一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种转基因方法，尤其是涉及了转基因生物领域中的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法。
【背景技术】
[0002]类转录激活子效应蛋白(TALE)是从病原菌属Xanthomonas spp中分离得到的保守的细菌性效应蛋白，是一类可以特异识别DNA序列的蛋白。至今为止TALE已经广泛应用于基因打靶、内源基因的定点调控和定点的表观遗传修饰。
[0003]在过去的十多年中,piggyBac转座子介导的转基因技术已经成功应用于大量的脊椎动物和非脊椎动物，成为了强大的遗传操作工具，在制备转基因动物和插入诱变等研究上发挥重要的作用。但是，PiggyBac转座子介导的转基因效率依旧较低，而且转化效率不稳定，近年来家蚕上的平均转基因效率仅为8.8%。因此，转基因效率的低下给研究人员增加了很大的工作负担，很大程度上限制了该技术的进一步的推广和应用。
【发明内容】
[0004]为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的是提供一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，大大提高了 PiggyBac介导的在家蚕中的转基因效率。
[0005]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下:
[0006]I)采用分子生物学技术构建包含类转录激活子效应蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac转座酶(PBase)DNA序列的辅助质粒,该质粒表达有TALE-PBase融合蛋白，将该辅助质粒在体外转录成mRNA ；
[0007]2)采用显微注射法将作为转座酶的辅助质粒的mRNA与含有外源基因的piggyBac转座子质粒的DNA —起导入到动物的受精卵中，获得外源基因能够稳定遗传和表达的转基因动物；
[0008]3)根据标志基因或基因的表达特征筛选出转基因阳性个体。
[0009]所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列包括16个重复的DNA序列。
[0010]所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列之间的Linker序列长度为209bp。
[0011]所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白序列位于PBase序列的5’端，类转录激活子效应蛋白序列和PBase序列表达后为一个融合蛋白。
[0012]所述的piggyBac转座子质粒中含有至少一种外源基因的表达框。
[0013]由本发明实施例，piggyBac转座子质粒包含有绿色荧光蛋白基因(EGFP)、红色荧光蛋白基因(DsRed)和家蚕丝素轻链启动子启动人血清白蛋白(HSA)中的一种或者多种的表达框。
[0014]本发明具有的有益效果是:
[0015]本发明极大地推动了转基因技术的发展，将目前piggyBac介导的在家蚕中的转基因效率至少提高了 7倍，这将是转基因技术发展中的一次重要突破。同时，其它动物的piggyBac转座子介导的转基因效率也因本技术的发明而得到显著提高。因此，在今后的研究中，获得转基因动物将会变得非常容易，这很大程度上简化了转基因实验的过程，也节省了大量的人力和物力。
【附图说明】
[0016]图1是本发明TALE-PBase新型辅助质粒结构图。
[0017]图2是实施例1具有3XP3-EGFP表达框的piggyBac转座子质粒结构图。
[0018]图3是实施例3具有3XP3-DsRed和FL-HSA两个表达框的piggyBac转座子质粒结构图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020]实施例1:
[0021]以提高动物转基因效率为研究目的，构建了一个包含类转录激活效应蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac转座酶(PBase)DNA序列(基因如SEQ ID N0.5)的新型辅助质粒(图1)。具体方法是:先组装TALE序列(如SEQ ID N0.3)的3’端(C00N端)连接一个PBase序列，与前面的TALE序列在同一个编码框内，用于表达TALE-PBase融合蛋白，TALE与PBase之间有I个209bp长度连接序列(Linker)(如SEQ ID N0.4)连接；在TALE的5，端(順2端)构建一个SP6原核启动子(如SEQ ID N0.1)，该启动子可以将下游基因在体外转录成mRNA ;还构建了一个核定位序列(NLS)(如SEQ ID N0.2)，用于引导TALE-PBase融合蛋白进入细胞核。
[0022]同时还构建了包含3XP3-EGFP-SV40 Poly A结尾的表达框的piggyBac转座子质粒DNA (如SEQ ID N0.5)(图2)，其中ITR为piggyBac转座子的反向重复序列，绿色荧光蛋白基因EGFP(如SEQ ID N0.6)由3XP3启动子(如SEQ ID N0.9)启动转录，在动物的眼睛和神经组织中能够特异表达绿色荧光。
[0023]将新型辅助质粒在体外转录成mRNA，然后与3XP3-EGFP转座子质粒DNA —起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3XP3-EGFP转座子质粒DNA的浓度为300ng/ μ L，新型辅助质粒的mRNA浓度为200ng/ μ L。
[0024]以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液注入家蚕P50品种产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为1nl左右。注射后的蚕卵在25°C温度、85%湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(G0代)，每个GO代蛾子与野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代家蚕用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)的阳性家蚕。
[0025]实验总共注射了 850个家蚕受精卵，成功孵化了 71条家蚕，最终得到58个Gl代蛾圈。在这58个蛾圈中总共筛选得到37个阳性蛾圈，所以转基因效率为63.8% (37/58)。
[0026]实施例2:
[0027]TALE-PBase融合蛋白表达载体以及包含3XP3-EGFP表达框的转座子质粒DNA的构建方法如实施例1，实施例2的辅助质粒与包含3XP3-EGFP表达框的转座子质粒DNA均与实施例1相同。
[0028]将本发明新型辅助质粒在体外转录成mRNA，然后与3 X P3-EGFP转座子质粒DNA —起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3XP3-EGFP转座子质粒DNA的浓度为300ng/ μ L，新型辅助质粒mRNA的浓度为200ng/ μ L。
[0029]以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液导入P50品种家蚕产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为1nl左右。注射后的蚕卵在25°C温度、85%湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(G0代)，每个GO代蛾子与野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代蛾圈用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)的阳性家蚕。
[0030]实验总共注射了 900个家蚕受精卵，成功孵化了 75条家蚕，最终得到36个Gl代蛾圈。在这36个蛾圈中总共筛选得到23个阳性蛾圈，所以转基因效率为63.9% (23/36)。
[0031]实施例3:
[0032]TALE-PBase融合蛋白表达载体的构建方法如实施例1。同时构建了包含3XP3-DsRed和FL-HSA两个表达框的piggyBac转座子质粒(图3)，SV40 Poly A (如SEQID N0.12)和家蚕丝素轻链(FL)Poly A(碱基如SEQ ID N0.13，肽如SEQ ID N0.1)分别为2个表达框的结尾信号；该质粒中3XP3启动子启动红色荧光蛋白(DsRed)(基因如SEQ IDN0.10，氨基酸如SEQ ID N0.11)特异的在眼中表达红色荧光；家蚕丝素轻链启动子启动人血清白蛋白(HSA)(如SEQ ID N0.15)特异的在家蚕后部丝腺中表达，丝素轻链信号肽能够促使人血清白蛋白从细胞分泌到家蚕丝腺腔内。
[0033]将新型辅助质粒在体外转录成mRNA,然后与3XP3-DsRed-FL_HSA的piggyBac转座子质粒DNA —起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3XP3-DsRed-FL-HSA转座子质粒DNA的浓度为200ng/ μ L，新型辅助质粒mRNA的浓度为200ng/μ L。
[0034]以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液导入LanlO品种家蚕产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为1nl左右。注射后的蚕卵在25°C温度、85%湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(GO代)，每个GO代蛾子与野生型的蛾子交配得到Gl代。得到的Gl代蛾圈用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达红色荧光蛋白(DsRed)的阳性家蚕。
[0035]实验总共注射了 1100个家蚕受精卵，成功孵化了 234条家蚕，最终得到103个Gl代蛾圈。在这103个蛾圈中总共筛选得到56个阳性蛾圈，所以转基因效率为54.4%(56/103)。采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕HSA蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，人血清白蛋白占蛋白溶液中总蛋白含量可达29.1%,占茧层重的2.11%。
[0036]综上所述，证明本发明的TALE-PBase融合蛋白可以显著地提高piggyBac转座子介导的转基因效率；即使增大PiggyBac转座子质粒DNA的大小，如增加I个表达框FL-HAS，结果并没有导致转基因效率的显著降低(P >0.05) ;3次不同实验的结果证实了TALE-PBase融合蛋白介导的转基因效率是稳定的，这就充分说明了本发明高效转基因方法的可靠性，具有突出显著的技术效果。
[0037]实施例中的piggyBac转座子首次在鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系TN-368中发现。之后，该转座子在地中海果蝇(Ceratitis capitata)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家香(Bombyx mori L.)等昆虫中的转基因实验均取得了成功。后来研究还证明PiggyBac转座子是一个广谱的转座系统，已经在酵母(Schizosaccharomyces pombe)、真润虫(Girardia tigrina)、斑马鱼(Dan1rer1)、小鼠、鸡、牛、猪、水稻和人细胞等物种中得到有效应用。从无脊椎动物到有脊椎动物等多种生物中成功实现转基因。由此可见，虽然实施例采用的物种是家蚕，但本发明也同样适用于其他物种，本发明同样可以在其它物种中实现高效的转基因。
[0038]上述【具体实施方式】用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
[0039]本发明所涉及的基因序列如下:
[0040]SEQ ID N0.1:SP6 启动子序列
[0041]来源:SP6启动子
[0042]5’ -ATTTAGGTGACACTATAGA-3’
[0043]SEQ ID N0.2:核定位信号(NLS)序列
[0044]来源:核定位信号(NLS)序列
[0045]5， -CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG-3，
[0046]SEQ ID N0.3 =TALE 序列
[0047]来源:TALE序列
[0048]5，-CTGACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCACTCGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGATTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGACTTACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCGAGCAATAACGGCGGA