一种基于普鲁兰多糖的负载药物和基因的载体、及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于普鲁兰多糖的负载药物或/和 基因的双功能载体、及其制备方法，还涉及该载体在药物-载体传送系统、基因-载体传送 系统和药物-基因-载体传送系统中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，化学药物治疗是重要的癌症治疗方法之一，但单独使用化疗药物需要很大 的剂量才具有抗肿瘤功效，同时带来一定的毒副作用，如阿霉素的心脏毒性。因此，化疗药 物同其他治疗技术的联合使用已成为一个新的研宄方向。近年来的研宄表明：癌症是一种 基因病，是在外界环境因素的作用之下，人体细胞内在原癌基因被激活和抑癌基因失去活 性的长期逐渐演变过程。由此可见，基因治疗对于肿瘤的根治有着极其重要的意义。
[0003] 基因治疗是指利用合适的载体将外源基因导入靶细胞，纠正基因异常或缺陷，进 而达到治疗疾病的目的，基因治疗的关键在于是否存在转染效率高、低毒的载体将治疗基 因（如抑癌基因P53等）导入靶细胞。
[0004] 常见基因载体包括病毒载体和非病毒载体两类。尽管病毒载体具有较好的基因递 送功效，但易引起免疫学反应，且生产成本高。病毒载体的种种缺点使得人们将研宄重点逐 渐转向非病毒载体，目前的非病毒基因载体主要包括脂质体、多聚物载体和天然多糖类物 质。例如，聚乙烯亚胺是一种常见的高效多聚物载体，因其结构中含有大量氨基，可以利用 静电作用结合带负电的DNA形成复合物，同时又具有"质子海绵效应"，利于复合物进行核 内体逃逸，进而将运载的DNA有效运送至细胞核内。但聚乙烯亚胺存在细胞毒性较大的缺 点，为解决这一问题，有研宄者使用聚乙二醇对聚乙烯亚胺进行修饰，降低复合物与血液中 蛋白质之间的相互作用，提高血液循环时间，但是单一的基因治疗亦难以长期有效地抑制 癌细胞的生长。因此，化疗药物同基因治疗的联合使用成为肿瘤治疗中的一个重要研宄方 向。
[0005] 普鲁兰多糖是一种安全无毒、生物相容性良好、具有肝靶向性的天然多糖易溶于 水和二甲基亚砜，富含羟基，化学性质较活泼，可以通过酯化反应、酰胺化反应以及羧甲基 化反应将疏水性化合物连接到普鲁兰多糖的主链上，赋予其两亲性，继而在水溶液中通过 疏水作用自组装形成纳米胶束，作为抗癌药物的可控释放载体；也可以在普鲁兰多糖的主 链上连接以带正电的化合物，得到可运载治疗基因的载体，将治疗基因导入到细胞内以纠 正自身缺陷，恢复患者健康。由于普鲁兰多糖本身的生物相容性良好，由之改性得到的基因 载体具有较低的细胞毒性。然而，现有研宄大多是将普鲁兰多糖改性后，用于单一的药物载 体或基因载体研宄，本发明使用硬脂酸和支链型聚乙烯亚胺同时对普鲁兰多糖进行修饰， 制备得到兼具药物传递和基因传递两种功能的纳米载体Pullulan-SA-PEI，尚未见该类载 体的报道，这种新型纳米载体的研宄将为纳米给药系统抗肿瘤治疗提供新思路。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于普鲁兰多糖的负载药物或/和 基因的双功能载体、及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种基于普鲁兰多糖的用于负载药物或/和基因 的载体，所述的载体以硬脂酸为疏水核心，以普鲁兰多糖和低分子量聚乙烯亚胺为亲水外 壳，该载体具有式I的结构：
【主权项】
1. 一种基于普鲁兰多糖的用于负载药物或/和基因的载体，其特征在于：所述的载体 以硬脂酸为疏水核心，以普鲁兰多糖和低分子量聚乙烯亚胺为亲水外壳，该载体具有式I 或式II的结构：
式I中，m为5到24之间的整数，η为11到47之间的整数；式II中，η为9到45之间 的整数。
2. 根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的低分子量聚乙烯亚胺为支链型聚 乙烯亚胺。
3. 根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的低分子量聚乙烯亚胺的重均分子 量为500-2000Da，所述的普鲁兰多糖的平均分子量为30-200kDa，所述的硬脂酸接枝率为 3-10%，所述的低分子量聚乙稀亚胺接枝率以含氮量表不：为5-12%。
4. 如权利要求1-3的任一项所述的载体的制备方法，其特征在于，所述载体是将硬脂 酸和低分子量聚乙烯亚胺分别通过酯化反应和酰胺化反应依次接枝到普鲁兰多糖的骨架 上而制备得到的。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1) 氮气保护下，普鲁兰多糖中加入硬脂酸和4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸，在15-50°C下搅拌反应30-70h，收集产物，产物经透析纯化、冷 冻干燥，得到普鲁兰-硬脂酸接枝聚合物；反应溶剂为二甲基亚砜； (2) 氮气保护下，步骤（1)得到的普鲁兰-硬脂酸接枝聚合物中加入琥珀酸酐和4-二 甲氨基吡啶，在30-70°C下搅拌反应5-30h，收集产物，产物经透析纯化、冷冻干燥，得到普 鲁兰-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物；反应溶剂为二甲基亚砜； (3)氮气保护下，步骤（2)得到的普鲁兰-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中，加入1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在2-8°C下搅拌活化 2_8h，再加入低分子量聚乙烯亚胺，在15-50°C下搅拌反应10_30h，经透析纯化、冷冻干燥， 得到普鲁兰-硬脂酸-聚乙烯亚胺接枝聚合物；反应溶剂为磷酸盐缓冲液； 其中： 步骤（1)中所述的普鲁兰多糖和硬脂酸的摩尔比为（1-5) :1-30 :1，硬脂酸、4-二甲 氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为I :(0.5-2): (1-2. 5)； 步骤（2)中所述的普鲁兰-硬脂酸接枝聚合物和琥珀酸酐的摩尔比为1 : (1-3)，4-二 甲氨基吡啶与琥珀酸酐的摩尔比为1 : (4-12)。 步骤（3)中所述的普鲁兰-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中羧基与支链型聚乙烯亚 胺中氨基的摩尔比为1 : (〇. 1-5)，普鲁兰-硬脂酸-琥珀酸酐接枝聚合物中羧基、1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1 : (0. 1-3): (0· 1-3)〇
6. -种药物-基因-载体系统，包括载体和负载在所述载体上的疏水性抗癌药物和基 因物质，其中所述的载体为权利要求1-3的任一项所述的载体。
7. 根据权利要求6所述的药物-基因-载体系统，其特征在于，所述的疏水性抗癌药物 为阿霉素、紫杉醇、喜树碱中的一种。
8. 根据权利要求6所述的药物-基因-载体系统，其特征在于，所述的基因物质为质粒 DNA、染色体DNA、线粒体DNA中的一种。
9. 根据权利要求6所述的药物-基因-载体系统，其特征在于，所述的质粒DNA为 p β Gal、p53 中的一种。
10. 权利要求6-9的任一项所述的药物-基因-载体系统的制备方法，包括如下步骤： (1) 将载体和疏水性药物搅拌混合，经透析、冷冻干燥后得载体负载药物系统； (2) 将所述载体负载药物系统与基因物质混合后室温孵育，得到药物-基因-载体系 统； 其中，疏水性药物与载体的质量比为I :(5-30);负载药物系统与基因物质的质量比为 (0.01-80) :1 ;所述孵育时间为20-60min。
【专利摘要】本发明公开了一种基于普鲁兰多糖的负载药物或/和基因的双功能载体Pullulan-SA-PEI，本发明通过酯化反应和酰胺化反应先后将硬脂酸和低分子量聚乙烯亚胺接枝到普鲁兰多糖主链上，制备出Pullulan-SA-PEI。本发明还公布了双功能载体的应用，Pullulan-SA-PEI在水溶性环境中可以自组装形成胶束结构，内核包裹抗癌药物，外壳吸附治疗基因，进而实现药物和基因的共传递。共传递体系可有效结合和转运pDNA，缓释药物，在吸附治疗基因后，对癌细胞有较好的杀伤效果。双功能载体Pullulan-SA-PEI在药物缓释和基因治疗领域具有潜在的应用价值。
【IPC分类】C08G81-00, A61K9-107, A61K47-36, A61K48-00, C12N15-85, A61K31-4745, A61P35-00, C08B37-00, C12N15-87, A61K31-337, A61K31-704
【公开号】CN104651405
【申请号】CN201510066829
【发明人】王静云, 王晓红, 陈丽丽, 夏菁, 王先武
【申请人】大连理工大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月6日