普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水凝胶，具体涉及一种普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]水凝胶的设计和发展成为具有多功能的高分子聚合物用于组织修复研宄的热点，一般水凝胶的研宄应用于组织工程、药物释放、基因传递、创伤修复。天然多糖因具有可再生、无毒、可降解材料特性而作为新型材料制备中不可缺少的一种，大多数多糖的研宄都集中在甲壳素、壳聚糖、肝膦脂、藻酸盐和普鲁兰多糖。普鲁兰多糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可应用于组织工程领域，广泛应用在基因治疗、药物释放、骨组织工程和治疗肝细胞癌方面。
[0003]类人胶原蛋白应用于组织工程方面也比较多，比如，人工血管、人工骨、螯合物以及水凝胶，而且获得了良好的评价，具有水溶性好、低排异反应、无病毒隐患，结构与人体自身胶原蛋白极其接近的显著优点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶及其制备方法，采用化学交联方法制备更具生物相容性、安全性更高的皮肤填充材料和植入支架材料。
[0005]本发明的实现过程如下:
一种普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
(1)将类人胶原蛋白溶于双蒸水中，得到质量体积分数为5?30mg/mL的类人胶原蛋白溶液，向类人胶原蛋白溶液中加入不同分子量的普鲁兰多糖，温度控制为O?27°C，其中类人胶原蛋白与普鲁兰多糖的质量比为(I?3):10 ;
(2)加入质量分数为I?10%的交联剂1，4丁二醇二缩水甘油醚溶液，搅拌均匀，温度控制为20?30°C ;其中，类人胶原蛋白与交联剂的质量比为50?300:1?40 ；
(3)将反应液放于45?55°C反应3h?6h，制得水凝胶；
(4)制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2?6天，用制粒机制成可注射的颗粒。
[0006]上述类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白。
[0007]上述普鲁兰多糖为由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，分子量为10000g/mo I ?530000g/molo
[0008]上述磷酸盐缓冲溶液pH为7.4。
[0009]上述普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶的制备方法为:
(I)将类人胶原蛋白溶于双蒸水中，得到1mL质量体积分数为5?30mg/mL的类人胶原蛋白溶液，向类人胶原蛋白溶液中加入不同分子量的普鲁兰多糖粉末，令类人胶原蛋白与普鲁兰多糖的质量比为(I?3): 10，反应温度控制为O?27°C，在搅拌条件下反应0.5?Ih ；
(2)加入0.1?0.35mL、质量分数为I?10%的交联剂1，4 丁二醇二缩水甘油醚溶液，反应温度控制为20?30°C，在搅拌条件下反应0.2?0.5h ;
(3)将反应液放于50°C恒温水浴锅中3h?6h，制得水凝胶；
(4)制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2?6天，用制粒机制成可注射的颗粒。
[0010]本发明具有以下优点:
本发明所涉及的一种用普鲁兰多糖和类人胶原蛋白合成的水凝胶，是将不同分子量的普鲁兰多糖和类人胶原蛋白结合起来制成的皮肤填充材料，以基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白、由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的不同分子量的水溶性胞外中性普鲁兰多糖为原料，采用化学交联方法制成，类人胶原蛋白和普鲁兰多糖通过接枝共混形成接枝聚合物，由1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚交联对接形成聚合物，可制成不同粒径的可注射颗粒，具有稳定性良好、生物学效价高、可避免外科手术的创伤和减少病人的疼痛的优点，从而真正实现皮肤填充的优势。
【附图说明】
[0011]图1为水凝胶的红外吸收图谱；图中，A中，I号为分子量为100，000g/moL的普鲁兰多糖的红外图，2号为分子量为530，000g/moL的普鲁兰多糖的红外图；B中，I号为类人胶原蛋白的红外图，2号为1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚的红外图；C中，I号为分子量为100，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的红外图，2号为分子量为530，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的红外图；
图2为水凝胶中1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚的残留量；图中，A号为分子量为100，OOOg/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶中BDDE的残留量，B为分子量为530，OOOg/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶中BDDE的残留量；
图3为水凝胶的样品图；图中，A、B、C为水凝胶的照片图；A为分子量为100，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的样品图；B，C为分子量为530，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的样品图；
图4为水凝胶的扫描电镜图；图中，I号为水凝胶的扫描电镜图(放大100倍)，2号为水凝胶的扫描电镜图(放大250倍)，3号为水凝胶的扫描电镜图(放大100倍)，4号为水凝胶的扫描电镜图(放大250倍)；1，2为分子量为100，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的内部结构图；3，4为分子量为530，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶的内部结构图；
图5为水凝胶注射于小鼠皮下图；图中，A为分子量为100，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶注射于小鼠皮下2周后的图，B为分子量为530，OOOg/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶注射于小鼠皮下2周后的图，C为分子量为100，000g/moL和530，000g/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶注射于小鼠皮下2周后的图，D为注射于小鼠皮下2周后取出的水凝胶的图；
图6为水凝胶注射于小鼠皮下后的H&E染色图；图中，1，2为分子量为100，OOOg/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶注射于小鼠皮下后的H&E组织染色图；3，4为分子量为530，OOOg/moL的普鲁兰多糖与类人胶原蛋白制备的水凝胶注射于小鼠皮下后的H&E组织染色图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0013]本发明所涉及的普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶的制备方法，选择交联剂1，
4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)与以基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白和由出芽短梗霉(Aureobasidium pulIulans)分泌的水溶性胞外中性普鲁兰多糖交联制备水凝胶，采用交联剂进行化学交联，再在25°C搅拌下进行物理交联。BDDE是一种双功能团交联剂，可以开环与普鲁兰多糖的羟基交联生成醚键，也可以氧化羟基为醛基，也可以实现普鲁兰多糖与类人胶原蛋白的交联。而且，BDDE已经是FDA/EMEA法规认证的。因此选用BDDE交联剂，不同分子量的普鲁兰多糖和类人胶原蛋白制备新型的水凝胶。同时阐释水凝胶的空间构象变化、机械性能和生物学功效之间的关系。
[0014]原料中的类人胶原蛋白采用的是由基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白，与来自动物源提取的胶原蛋白相比，其具有水溶性好、低排异反应、无病毒隐患，结构与人体自身胶原蛋白极其接近的显著优点。另外，动物源胶原蛋白也可作为原料制造水凝胶。普鲁兰多糖为由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的水溶性胞外中性多糖。普鲁兰多糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可应用于组织工程领域。
[0015]本发明涉及的普鲁兰多糖-类人胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将类人胶原蛋白溶于双蒸水中，得到1mL质量体积分数为5?30mg/mL的类人胶原蛋白溶液，向类人胶原蛋白溶液中加入不同分子量的普鲁兰多糖粉末，令类人胶原蛋白与普鲁兰多糖的质量比为(I?3):10，反应温度控制为O?27°C，在搅拌条件下反应
0.5 ?Ih ;
步骤二:加入0.1?0.35mL、质量分数为I?10%的交联剂溶液，反应温度控制为20?300C，在搅拌条件下反应0.2?0.5h ;
步骤三:将反应液放于50°C恒温水浴锅中3h?6h，制得水凝胶；
步骤四:制得的水凝胶相继用无热原水和磷酸盐缓冲溶液浸洗2?6天，用制粒机制成不同粒径的可注射的颗粒。
[0016]步骤一中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白。
[0017]步骤一中，普鲁兰多糖为由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，分子量为100000g/mol ?530000g/molo
[0018]步骤