β－联蛋白/TCF激活转录的调节的制作方法

专利名称：β－联蛋白/TCF激活转录的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节由β-联蛋白/TCF激活的转录的化合物和方法，例如，选择性抑制Wnt/β-联蛋白途径靶向的基因。
背景技术：
Wnt/β-联蛋白途径引发在正常发育和癌症的起始和发展中均至关重要的信号级联(Wodarz等人，“Mechanisms of Wnt signaling indevelopment，”Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，P.J.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signaling throughbeta-catenin，”Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecularcauses of colon cancer，”Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。该途径的特点是它激活了多功能蛋白β-联蛋白的转录作用。在正常细胞中，大多数β-联蛋白发现于连在钙黏着蛋白上的细胞膜上，它在这里在细胞黏着中发挥重要的作用。另一β-联蛋白库发现于胞质和核中，它在这里调节转录(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenininteracts with its partners，”Curr.Biol.11R792-4(2001))。在其作为质膜处细胞黏着介体及作为转录激活剂的不同作用中，β-联蛋白与蛋白宿主相互作用，大部分蛋白宿主尽管缺少显著的序列同源性，却竞争相同的β-联蛋白犰狳蛋白重复单元。晶体结构与突变研究已经描绘出几种蛋白的β-联蛋白对不同的犰狳蛋白重复单元的结合部位(Gottardi等人，“Adhesion signalinghow beta-catenin interacts with its partners”，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。
β-联蛋白的胞质库通过被其中包括糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、酪蛋白激酶-1α(CK-1α)、支架蛋白、轴蛋白和肿瘤抑制物、腺瘤性结肠息肉(APC)的“破坏复合体”磷酸化而得以调节(Behrens J.，“Controlof beta-catenin signaling in tumor development”，Ann.N.Y.Acad.Sci.91021-33(2000)；讨论33-5)。在不存在Wnt信号传导的情况下，磷酸化标记胞质β-联蛋白以进行Skp1-滞蛋白-F box(SCF)定向的遍在蛋白化和蛋白体降解。激活Wnt途径使GSK-3β的功能失活，防止β-联蛋白磷酸化，从而使β-联蛋白在胞质中积聚，并随后易位至核中，在这里形成转录活性复合体并驱动其靶基因的表达。靶基因激活中的关键步骤是β-联蛋白和转录因子的T细胞因子(TCF)/淋巴样细胞增强因子(LEF-1)家族成员之间复合体的形成(Brantjes等人，“TCFLadyJustice casting the final verdict on the outcome of Wnt signaling”，Biol.Chem.383255-61(2002))。为了生成转录活性复合体，β-联蛋白募集转录辅激活物CREB-结合蛋白(CBP)或其紧密关联的同源物p300(Hecht等人，“The p300/CBP acetyltransferases function astranscriptional coactivators of beta-catenin in vertebrates”，EMBO J.191839-50(2000)；Takemaru等人，“The transcriptional coactivator CBPinteracts with beta-catenin to activate gene expression”，J.Cell Biol.149249-54(2000))以及基础转录机制的其它组分。
β-联蛋白/TCF复合体激活Wnt响应基因转录的精确机制尚不明确，但是β-联蛋白有关转录激活的结构域已经描绘为NH2-和COOH-端(Staal等人，“Wnt signals are transmitted through N-terminallydephosphorylated beta-catenin，”EMBO 363-68(2002))。β-联蛋白的COOH-端区由大约100个氨基酸组成，已经显示它与TATA结合蛋白(TBP)相互作用(Hecht等人，“Functional characterization of multipletransactivating elements in beta-catenin，some of which interact with theTATA-binding protein in vitro”，J.Biol.Chem.27418017-25(1999))。当与LEF-1融合时，COOH-端便足以促进反式激活作用(Vleminckx等人，“The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessaryand sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopuslaevis，”Mech.Dev.8165-74(1999))。β-联蛋白的NH2-端部分由大约130个氨基酸组成，其含有蛋白体降解所需的GSK-3β磷酸化位点。
正常情况下Wnt/β-联蛋白调节一系列与促进增殖和分化有关的基因的表达。但是，＞85％的结肠癌中，破坏复合体的组分之一APC、和/或β-联蛋白本身是变异的，这导致核β-联蛋白的增加和靶基因的组成型激活(constitutive activation)(Fearnhead等人，“Genetics of colorectalcancerhereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis”，Br.Med.Bull.6427-43(2002))。许多这些在细胞的生长、增殖和分化中发挥关键作用的基因，包括细胞周期蛋白D1(Shtutman等人，“The细胞周期蛋白D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-cateninregulates expression of细胞周期蛋白D1 in colon carcinoma cells，”Nature 398422-26(1999))和c-myc(He等人，“Identification of c-MYCas a target of the APC pathway”，Science 2811509-12(1998))，以及穿入性生长所必需的基因如基质裂解蛋白(matrilysin)(Crawford等人，“The metalloproteinase matrilysin is a target of beta-catenintransactivation in intestinal tumors”，Oncogene 182883-91(1999))、纤连蛋白(Gradl等人，“The Wnt/Wg signal transducer beta-catenin controls纤连蛋白expression”，Mol.Cell.Biol.195576-87(1999))、CD44(Wielenga等人，“Expression of CD44 in Apc and Tcf mutant miceimplies regulation by the WNT pathway”，Am.J.Pathol.154515-23(1999))、和μPAR(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-Tcell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectalcarcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))均被不适当地激活。
根据大多数结直肠癌与β-联蛋白信号传导途径的激活有关，并且根据多种突变导致该激活这一事实，明确需要有削弱β-联蛋白核功能的药物。本发明提供对抗β-联蛋白/TCF介导的转录的试剂，并进一步提供相关优势，如下文所详细说明。

发明内容
简言之，本发明提供对抗β-联蛋白/TCF介导的转录的试剂，以及它们的使用方法。一方面，本发明提供使β-联蛋白/TCF响应基因的亚型被特异性减量调节的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供使CBP和β-联蛋白之间的结合被破坏，但是结构相关的辅激活物p300和β-联蛋白之间的结合不被破坏的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供使由CBP而非由p300启动的基因被选择性激活的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。此外，本发明提供使由p300而非由CBP启动的基因被选择性激活的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供用化学试剂处理癌细胞以使细胞周期G1阶段的发育停滞的方法，其中延长用化学试剂进行处理诱发正常结肠细胞(colonocyte)中检测不到的细胞凋亡。例如，癌细胞可以是结肠、乳腺、前列腺等等。
例如，一方面，本发明提供调节β-联蛋白诱发的基因表达的方法。该方法包括使组合物与试剂接触，这里的组合物包含β-联蛋白、CBP和p300，而且β-联蛋白具有结合到CBP与p300的可能性。所述试剂以有效改变β-联蛋白结合到CBP与p300的可能性的量存在。换句话说，在不存在该试剂的情况下，β-联蛋白与CBP和p300结合的程度与存在试剂的情况下观察到的不同。例如，取决于其化学结构，试剂可以增加CBP在β-联蛋白上的结合，同时任选地降低p300在β-联蛋白上的结合；或者增加p300在β-联蛋白上的结合，同时任选地降低CBP在β-联蛋白上的结合。该方法可以在体内或先体外后体内进行。一方面，该方法先体外后体内进行，组合物包括干细胞。另一方面，该方法在体内进行，组合物在哺乳动物内。本发明的方法可以用于治疗多种医学病症。例如，在本发明的各个方面哺乳动物可以罹患癌症，而用量对于治疗癌症是有效的；组合物在细胞内，而试剂增加细胞分化的可能性；组合物在细胞内，而试剂增加细胞增殖的可能性。
另一方面，本发明提供包含β-联蛋白、CBP、p300和试剂的组合物。β-联蛋白具有结合到CBP与p300的可能性，而且试剂以有效改变β-联蛋白结合到CBP与p300的可能性的量存在于组合物中。换句话说，在不存在试剂的情况下，β-联蛋白与CBP和p300结合的程度与存在试剂的情况下观察到的不同。例如，取决于其化学结构，试剂可以增加CBP在β-联蛋白上的结合，同时任选地降低p300在β-联蛋白上的结合；或者增加p300在β-联蛋白上的结合，同时任选地降低CBP在β-联蛋白上的结合。该组合物可以在体内或先体外后体内。一方面，该组合物先体外后体内，并且组合物进一步包含干细胞。另一方面，该组合物在体内，并且组合物在哺乳动物如小鼠内。
另一方面，本发明提供调节Wnt途径活性的方法，其包括(a)使Wnt途径的组分与激活Wnt途径的化合物相接触，以提供激活的Wnt途径；以及(b)使激活的Wnt途径与完全或基本上干扰p300与联蛋白之间结合但是极少或者不干扰CBP与联蛋白之间结合的化学试剂相接触。任选地，Wnt途径在细胞内。任选地，该方法先体外后体内进行。任选地，激活Wnt途径的化合物选自LiCl和GSK抑制剂。
另一方面，本发明提供调节细胞增殖的方法，其包括(a)在使一定比例的群体增殖且一定比例的群体分化的条件下提供细胞群体；以及(b)向群体中加入化学试剂，在此所述试剂导致增殖细胞的比例相对于分化细胞的比例增加。在该方法的各种最佳实施方式中化合物干扰p300与联蛋白之间的结合；该方法进一步包括向群体中加入激活Wnt途径的试剂；所述的细胞群体是干细胞群体；该方法先体外后体内进行；该方法进一步包括加入导致细胞群体分化的试剂，例如，群体中的细胞分化形成血细胞或者群体中的细胞分化形成神经元细胞。
另一方面，本发明提供将干细胞保持在未分化状态下的方法，其包括使干细胞与抑制细胞分化或促进细胞增殖的试剂相接触，所述试剂的量对于将干细胞保持在未分化状态下是有效的。在某些实施方式中，用于该方法的试剂相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用。
简言之，在其它方面，本发明提供相对于β-联蛋白/p300相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/CBP相互作用的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，所述组合物含有β-联蛋白、CBP和p300，所述化合物相对于β-联蛋白/p300相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/CBP相互作用；相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，所述组合物含有β-联蛋白、CBP和p300，所述化合物相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用；促进β-联蛋白从核易位至胞液的方法，该方法包括向细胞中加入化合物，所述细胞包括核和胞液，核含有β-联蛋白，所述化合物导致β-联蛋白从核易位至胞液；选择性地抑制由WNT/β-联蛋白途径靶向的基因的表达的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，所述组合物含有由WNT/β-联蛋白途径靶向的基因，所述化合物导致由WNT/β-联蛋白途径靶向的基因表达的变化。
在本发明的方法和组合物中，化学试剂任选地选自结构式(I)的化合物 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
在某些实施方式中，结构式(I)的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9独立地选自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、苄基、取代苄基(其中苄基上的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、萘基、取代萘基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、双苯基甲基、取代双苯基甲基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基环己基C0-2烷基。
在某些实施方式中，A为-(CHR3)-，B为-(C＝O)-，D为-(CHR5)-，E为-(C＝O)-，G为-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II)
其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如结构式(I)中所定义。
在某些实施方式中，A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如结构式(I)中所定义，Z为氮或CH(当Z为CH时，X为氮)。
在某些实施方式中，A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如结构式(I)中所定义，Z为氮或CH，附带条件为当Z为氮时，n为0，当Z为CH时，X为氮并且n不是0。
在某些实施方式中，化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra为具有8至11个环成员的二环芳基，其可以具有1至3个选自氮、氧或硫的杂原子，R6为5至7元单环芳基，其可以具有1至2个选自氮、氧或硫的杂原子，而且化合物中的芳环可以具有一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基。任选地，Ra为萘基、喹啉基或异喹啉基，Rb为苯基、吡啶基或哌啶基，所有这些基团均可被一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基所取代。在某些实施方式中，Ra为萘基，Rb为苯基，其可被一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基所取代。
在某些实施方式中，化合物选自化合物1、3、4和5。
在其它方面，本发明提供筛选方法，即可以鉴别生物活性化合物和/或评价其效力的方法。例如，本发明提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含CBP1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制含步骤(b)的β-联蛋白的部分与含步骤(a)的CBP1-111的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含CBP1-111的所述部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分与β-联蛋白的结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
本发明还提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含CBP 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制含步骤(b)的CBP 1-111的部分与含步骤(a)的β-联蛋白的部分相结合；(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含β-联蛋白的所述部分与含CBP 1-111的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
本发明还提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含有(1)与CBP 1-111相结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使CBP 1-111从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与CBP 1-110的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制含p300 1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
本发明还提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含p300 1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含β-联蛋白的部分与步骤(a)的含p300 1-111的部分相结合；以及(d)当确定所述步骤(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
本发明还提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含p300 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含p300 1-111的部分与步骤(a)的含β-联蛋白的部分相结合；(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含β-联蛋白的所述部分与含p300 1-111部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
本发明还提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含有(1)与p300 1-111结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使p300 1-111从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与p300 1-111的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
任选地，上述方法可以进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制含CBP 1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
在其它方面，本发明提供核酸和肽序列，这些序列可以用作例如治疗剂，或者用于例如筛选方法。因此，在不同的示范性方面，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO1或者与SEQID NO1的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1或者与SEQ ID NO1的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2或者与SEQ IDNO2的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO1或者与SEQ IDNO1的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO3或者与SEQID NO1的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO4的同源性至少为80％的肽，附带条件为所述的肽不是p300蛋白；基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是p300蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4或者与SEQ IDNO2的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是p300蛋白；基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的肽不是p300蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者与SEQ IDNO3的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码p300蛋白；基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是p300蛋白；以及基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的肽不是p300蛋白。
以下进一步详细说明了本发明的这些及相关方面。


图1.化合物1抑制β-联蛋白/TCF转录。
A(i)和A(ii).化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的结构。
B(i)和B(ii).化合物1选择性地抑制β-联蛋白/TCF报道基因构成物(construct)，IC50为5μM。用β-联蛋白/TCF荧光素酶构成物转染SW480细胞(105)(图1B(i))。用化合物1处理细胞(1-64μM)。处理后24小时后制备溶胞产物，并对其进行双荧光素酶化验。数据以不同形式示于图1B(ii)。
C.化合物1对NFAT受体构成物没有影响。将用NFAT受体构成物稳定转染的Jurkat细胞，右图(right panel)，用PMA(10ng/ml)/洛诺霉素(1μg/ml)刺激，并用化合物1(0.781-50μM)处理。处理后24小时后制备溶胞产物，并对其进行双荧光素酶化验。所有实验进行两份，数值以平均+/-标准偏差作图。
D.CBP是化合物1的分子标靶。将SW480细胞的核抽提物与覆有化合物2(25μM)的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠一起培育。将小珠洗涤3次，对洗脱物进行凝胶电泳，并用抗CBP抗体进行免疫印迹。箭头指向在大小上和对CBP的免疫反应性相应的条带。
E.14C标记的化合物1与CBP结合。通过引入14C标记的酪氨酸制备化合物1。将SW480细胞用表达全长爪蟾(Xenopus laevis)β-联蛋白(2.2μg)或全长小鼠CBP(1.1μg)的载体转染。将50μg核溶解产物(NE-PER kit，Pierce)用20μM14C标记的化合物1(7.16×104CPM)、及DMSO(0.5％)或100μM和200μM的冷化合物1处理。使用G-25 1cc柱(Pharmacia)将溶解产物脱盐，以除去未结合的14C标记的化合物1，并测量14C标记的化合物1的结合。
图2.CBP而并非p300的前111个氨基酸特异性地结合化合物1。
A.野生型和CBP缺失构成物的示意图。
B.CBP(1-111)含有化合物1的最小结合结构域。SW480细胞中CBP缺失构成物的表达水平如图所示(上图)。10μg的总蛋白进行凝胶电泳，并使用抗His抗体进行免疫印迹。将表达CBP缺失构成物的SW480细胞的全细胞溶解产物结合到覆有100μM化合物2的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠上。结合部分进行凝胶电泳，并使用抗His抗体进行免疫印迹(下图)。箭头指向与覆有化合物2的小珠保持结合的构成物。
C.过量的化合物1与CBP(1-111)而非p300(1-111)竞争。将CBP缺失构成物、CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)和p300缺失构成物、p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)转染至SW480细胞中。将全部细胞溶解产物与链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠或者覆有100μM化合物2的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠一起培育(下图)。CBP构成物(1-111、1-211和1-351)和p300构成物(1-111、1-211和1-351)在小珠上的结合受到过量化合物1(150μM)的攻击。
D.CBP(1-111)以不依赖于磷酸化的方式与化合物1结合。CBP(1-111)或p300(1-111)在大肠杆菌中表达，并通过Ni-NTA-琼脂糖(考马斯亮蓝(Commassie blue)染色的凝胶)提纯。CBP(1-111)如图所示(右上)。使用抗His抗体对1和3μl的提纯蛋白进行免疫印迹。箭头指向通过其适当抗体识别的重组蛋白。增量的提纯CBP(1-111)(0.5、1和3μl)和p300(1-111)(1、3和5μl)与覆有100μM化合物2的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠一起培育。洗涤小珠，对洗脱蛋白进行凝胶电泳，之后用抗His抗体进行免疫印迹。箭头指向PVDF膜上的蛋白。使用过量化合物1(300μM)攻击特异结合的相互作用。
E.CBP的Δ1-111+NLS构成物不能拯救被化合物1抑制的β-联蛋白/TCF转录。将SW480细胞用(0.1-1)μg表达全长或CBP(Δ1-111+NLS)的表达载体转染。转染过后24小时用化合物1(25μM)或对照物(0.5％DMSO)处理细胞。处理过后24小时制备溶解产物，并对其进行双荧光素酶化验。
图3.化合物1破坏β-联蛋白/CBP复合体但不破坏p300/β-联蛋白复合体。
A.将全长爪蟾β-联蛋白(1.1、2.2和3.3μg)或者鼠CBP(0.14、0.28、0.55、1.1和2.2μg)质粒在SW480细胞内与β-联蛋白/TCF(1.1μg)报道基因构成物一起共转染。使用空pcDNA3载体使各反应中所用DNA的量均等。化合物1处理过后24小时进行双荧光素酶化验。所有实验进行两份，数值以平均+/-标准偏差作图。
B.化合物1与β-联蛋白竞争CBP。将SW480细胞用5或10μM化合物1或对照物(0.5％DMSO)处理。处理过后24小时，将溶解产物与覆有对照抗体或者抗CBP抗体或抗p300抗体的小珠一起培育。对共免疫沉淀的蛋白进行凝胶电泳，并用抗β-联蛋白抗体进行免疫印迹。箭头指向免疫沉淀的β-联蛋白(成对)。
C.CBP(1-111)是与β-联蛋白相互作用的最小区。用覆在蛋白A-琼脂糖小珠上的抗β-联蛋白抗体对用CBP缺失系列转染的SW480细胞进行免疫沉淀。将免疫复合体洗涤并进行凝胶电泳，之后使用抗His抗体进行免疫印迹。箭头指向与小珠保持结合的构成物。
D.化合物1与β-联蛋白竞争CBP而非p300构成物。将CBP(1-111、1-211和1-351)和p300(1-111、1-211和1-351)构成物均转染至SW480细胞中(下图)。转染过后48小时制备全部细胞溶解产物，并使用上述的蛋白A-琼脂糖-抗β-联蛋白抗体进行免疫沉淀(中图)。将免疫复合体洗涤并进行凝胶电泳，使用抗His抗体进行免疫印迹。箭头指向结合的蛋白(上图)。为了进行竞争化验，将小珠上的免疫复合体用50μM化合物1攻击。
E.CBP和p300与公认的β-联蛋白结合基序(SEQ ID NOS47-55)的序列排比。公认的序列是加框的。使用程序BLAST进行NCBI数据库中蛋白序列的排比。
F.CBP 1-111(CBP M1，SEQ ID NO2)与p300 1-111(p300M1，SEQ ID NO4)的序列排比。
图4.化合物1降低核的β-联蛋白A.β-联蛋白免疫荧光显微法。将对数期的SW480(左)和HCT116(右)细胞固定并用抗β-联蛋白红(上图，A)或者抗CBP(上图，B)绿染色。中图显示了SW480(左)和HCT116(右)细胞中重叠的β-联蛋白和CBP。下图显示用化合物1(25μM)处理24小时后β-联蛋白在SW480胞质(左)和HCT116细胞胞质膜(右)上的重新分布。
B.β-联蛋白的蛋白质印迹分析。使用25μg来自SW480细胞抽提物的总蛋白在用化合物1处理24小时或不进行处理的情况下进行胞质和核β-联蛋白的检测。
图5.化合物1抑制细胞周期蛋白D1的表达。
A.细胞周期蛋白D1水平随化合物1处理而降低。对经25μM化合物1或对照物(0.5％DMSO)处理4、8或24小时的25μg SW480全细胞溶解产物进行蛋白质印迹分析。使用抗细胞周期蛋白D1抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.)进行免疫印迹。
B.细胞周期蛋白D1和c-myc启动子被CBP和p300在体内占有。ChIP(见材料和方法)说明化合物1处理后发生c-myc启动子的CBP和p300占有。对来自化合物1(25μM)或对照物(0.5％DMSO)处理8小时的SW480细胞的c-myc启动子进行ChIP化验。使用CBP(AC-26，由Harvard University，Boston，MA的Dr.David Livingston慷慨赠送)或p300(C-20，Santa Cruz Biotechnology Inc.)特异性抗体在进行化合物1或对照物(DMSO)处理的情况下，评价启动子被CBP或p300占有。
图6.
A.化合物1使G1中的细胞停滞。对经化合物1(25μM)(右)或对照物(0.5％DMSO)(左)处理24小时的SW480(下图)和HCT116(上图)细胞进行FACS分析。将5.5×106细胞固定并用碘化丙锭(PI)染色。箭头标出G0/G1、S和G2/M。
B.化合物1选择性地激活结肠癌细胞系中的胱天蛋白酶。将SW480和HCT116(左图)细胞(105)连同正常结肠细胞CCD18Co(右图)用对照物(0.5％DMSO)或化合物1(25μM)处理。处理过后24小时，将细胞溶解，并测量胱天蛋白酶-3/7的酶活性。通过从经处理的样品(化合物1或对照物)减去空白(对照物，无细胞)的单位值计算相对荧光单位(RFU)，并作图。
图7.化合物1以依赖剂量的方式降低软琼脂中的集落生长。
A.向三孔SW480(5000细胞/孔)中加入浓度渐增的5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)和化合物1(0.25-5lμM)。将细胞洗涤并悬浮在软琼脂生长培养基中。8天后对集落数目(直径大于60lμM的集落)进行计数，并针对化合物浓度作图。标出三次测量的平均值±SE。在不存在化合物的情况下，对照的集落数为1,637±71。
B.化合物1的作用示意图。不想受其理论束缚，申请人提出β-联蛋白/TCF复合体以依赖辅激活物的方式调节其下游靶基因的表达。更具体地说，提出核的β-联蛋白/TCF有差异地与CBP或p300结合，三元复合体驱动β-联蛋白/TCF响应基因亚型的表达。化合物1特异性并选择性地靶向β-联蛋白/TCF/CBP复合体，但不靶向β-联蛋白/TCF/p300复合体，并对依赖CBP的基因，如细胞周期蛋白D1、轴蛋白2和hnkd的表达进行减量调节。尽管化合物1处理阻断了β-联蛋白/CBP的相互作用，却增加了可用于表达如下基因的β-联蛋白/TCF复合体，所述基因的启动子可以利用辅激活物(c-myc)或优选地利用p300作为辅激活物(c-jun和fra-1)。
图8提供制备用于实施本发明的化学试剂的一般合成示意图。
图9提供制备用于实施本发明的化学试剂的一般合成示意图。
图10.化合物3的代谢分析A.大鼠体内化合物3及其代谢产物的二极管阵列示踪图(上图)和总离子电流(下图)。
B.人体内化合物3及其代谢产物的二极管阵列示踪图(上图)和总离子电流(下图)。
具体实施例方式
本发明提供对抗β-联蛋白/TCF介导的转录的试剂，及其相关的方法。一方面，本发明提供使β-联蛋白/TCF响应基因的亚型被特异性减量调节的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供使CBP和β-联蛋白之间的结合被破坏，但是结构相关的辅激活物p300和β-联蛋白之间的结合不被破坏的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供使由CBP而非由p300启动的基因被选择性激活的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。此外，本发明提供使由p300而非由CBP启动的基因被选择性激活的方法，同时在相关方面，本发明提供用于该方法的化合物。另一方面，本发明提供用化学试剂处理结肠癌细胞以使细胞周期G1阶段的发育停滞的方法，其中延长用化学试剂进行处理诱发正常结肠细胞中检测不到的细胞凋亡。
以下提供这些方法和试剂更为具体的细节。但是，在提供这些细节之前，提供以下定义以帮助读者理解本发明的公开内容。
定义SEQ ID NO1是核酸序列tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcggacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac tcggccccgc cggtcccggg ccccacaaccgcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctcgccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaacttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcgaatgacagca cagattttgg atcattgttt gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg。
SEQ ID NO2是氨基酸序列MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDSTDFGSLFDLENDLPDELIPNGGELGLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSAN。
SEQ ID NO3是核酸序列ccttgtttgt gtgctaggct gggggggagagagggcgaga gagagcgggc gagagtgggc aagcaggacg ccgggctgag tgctaactgcgggacgcaga gagtgcggag gggagtcggg tcggagagag gcggcagggg ccagaacagtggcagggggc ccggggcgca cgggctgagg cgacccccag ccccctcccg tccgcacacacccccaccgc ggtccagcag ccgggccggc gtcgacgcta ggggggacca ttacataacccgcgccccgg ccgtcttctc ccgccgccgc ggcgcccgaa ctgagcccgg ggcgggcgctccagcactgg。
SEQ ID NO4是氨基酸序列MAENVVEPGPPSAKRPKLSSPALSASASDGTDFGSLFDLEHDLPDELINSTELGLTNGGDINQLQTSLGMVQDAASKHKQLSELLRSGSSPNLNMGVGGPGQVMASQAQQSSPGLGL。
小分子抑制剂术语“小分子”是指分子量低于约5,000g/mol的化学化合物。化合物可以是有机或无机的，可以是合成或天然的，例如，可以分类为肽、寡核苷酸、肽模拟物、寡核苷酸模拟物、寡糖、寡糖模拟物、天然产物类似物或衍生物，或者纯合成的化合物，其可以包括例如一个或多个无环基、环状基、碳环基、杂环基、多环基和/或芳香基。术语“抑制剂”是指将本文所公开的两种多肽，例如β-联蛋白与CBP或者β-联蛋白与p300之间的结合抑制到统计学上显著的程度的化合物。换句话说，与不存在抑制剂时发生的结合相比，在存在抑制剂的情况下将两种多肽之间的结合降低到统计学上显著的程度。优选地，该抑制足以实现对细胞性质的影响，例如接受小分子抑制剂的受试者内的治疗反应。
β-联蛋白CBP相互作用β-联蛋白和CBP均为公知的多肽。例如，参见Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)和Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。β-联蛋白与CBP之间的相互作用已经过证明和测量。例如，参见Takemaru等人，J.Cell.Biol.149249-54(2000)。术语β-联蛋白CBP相互作用是指这两种蛋白之间发生的结合。
假定的在小分子已经被验证具有例如β-联蛋白/TCF激活转导的调节物的活性之前，将小分子视为假定的调节物。当小分子表现出调节物活性时，那么可以将其称为β-联蛋白/TCF激活转导的调节物。类似地，在小分子已经被验证为如β-联蛋白CBP相互作用之类的蛋白-蛋白相互作用的抑制剂之前，小分子可以被称为β-联蛋白CBP相互作用的假定抑制剂。
接触当将两种物质，如化学化合物、蛋白、寡核苷酸等均置于液体培养基，如水或缓冲液中，并且不限制它们在该培养基中的活动，则这两种物质已经彼此相接触。此外，当将两种物质放置得彼此接近，使得两种物质彼此触及时，则这两种物质彼此相接触。进行化验时，当例如将它们均置于化验培养基中时，两种物质彼此相接触。
β-联蛋白是指一种本领域公知得蛋白，例如参见Morin，P.J.，Bioessays 211021-30(1999)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)；Huber等人，Cell 105391-402(2001)。β-联蛋白已经鉴定为胞质膜中细胞黏着的介体和转录激活物。
术语“化验”是指在选定的条件下将各种物质(如化学品、酶等)彼此相接触，并且将会引起或者将不引起可检测现象的过程或方法。是否检测到该现象则揭示关于各种物质和/或选定条件的信息。
术语“抑制结合”、“抑制相互作用”、“抑制复合体形成”和类似的术语均是指将两种蛋白之间结合的强度、等级或程度降低到统计学上显著的程度的作用。例如，当与两种蛋白的未复合形式相比它们在复合形式中显著更稳定时，可以发生强的结合。在定量和定性方面蛋白-蛋白结合研究在本领域是公知的。与β-联蛋白结合有关的例子如下说明Brantjes等人，Biol.Chem.383255-61(2002，β-联蛋白与T细胞因子(TCF)成员的结合)；Gottardi等人，Curr.Biol.11R792-4(2001)，说明了与结合配偶体相互作用的β-联蛋白结构元件)；和Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000，说明了β-联蛋白与CBP的相互作用)。
术语“CBP蛋白”是指也称为CREB结合蛋白的蛋白，这里的CREB是“cAMP-应答元件结合”的缩写。该蛋白在本领域是公知的，例如参见Takemaru等人，J.Cell Biol.149249-54(2000)和美国专利第6,063,583号。
CBP 1-111是指从蛋白CBP的N-端识别的CBP的前111个氨基酸。从人体中分离的CBD氨基酸1-111如上文陈述为SEQ ID NO2。相应的核酸序列如上文陈述为SEQ ID NO1。从小鼠分离的CBP氨基酸1-111为SEQ ID NO5，其如下MAENLLDGPPNPKRAKLSSPGFSANDNTDFGSLFDLENDLPDELIPNGELSLLNSGNLVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPGIGNVSASSPVQQGLGGQAQGQPNSTN。来自小鼠的相应核酸序列为SEQ ID NO6，其如下atggccgaga acttgctggacggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc ggcttctccg cgaatgacaacacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt cctgatgagc tgatccccaa tggagaattaagccttttaa acagtgggaa ccttgttcca gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttcttagaggaggcag cggctctagc atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctgtgcaacaggg ccttggtggc caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac。
p3001-111是指从蛋白p300的N-端识别的p300的前111个氨基酸。从人体中分离的p300氨基酸1-111如上文陈述为SEQ ID NO4。编码该肽的相应的核酸序列如上文陈述为SEQ ID NO3。
已知β-联蛋白天然地与包括p300和CBP在内的许多种不同的蛋白相互作用，即形成复合体(例如，参见Hecht等人，EMBO J.191839-50(2000)。当存在多种不同的潜在结合配偶体时，β-联蛋白将会与那些潜在的配偶体结合到不同的程度，其取决于β-联蛋白与潜在结合配偶体之间的结合强度。当β-联蛋白与那些结合配偶体中至少一种(第一结合配偶体)之间的结合程度相对于β-联蛋白与那些结合配偶体至少另一种(第二结合配偶体)之间的结合程度减少时，发生β-联蛋白结合的选择性抑制。这一结合的相对降低可以看作β-联蛋白与第一结合配偶体之间的结合降低，而不影响β-联蛋白与第二结合配偶体之间的结合；或者它可以看作β-联蛋白与第一结合配偶体之间的结合降低，而β-联蛋白与第二结合配偶体之间的结合增加；或者它可以看作β-联蛋白与第一结合配偶体之间的结合降低，同时β-联蛋白与第二结合配偶体之间的结合降低，只要β-联蛋白与第一结合配偶体之间结合的降低大于β-联蛋白与第二结合配偶体之间结合的降低。
术语“p300蛋白”是指本领域公知的蛋白。例如，参见Gusterson，R.J.等人，J.Biol.Chem.2003Feb 28；278(9)6838-47；An和Roeder，J.Biol.Chem.2003 Jan 17；278(3)1504-10；Rebel，V.I.等人，Proc NatlAcad Sci USA.2002 Nov 12；99(23)14789-94；和美国专利第5,658,784号，以及其中所引用的参考文献。
基本上提纯是指核酸或多肽是分离的，并且基本不含其它核酸或多肽，即所述的核酸或多肽是主要活性成分。本文所用的术语“分离的”是指从在其天然态下与其正常结合的基本上所有其它分子中分离出的分子。基本上提纯和分离的分子是制备中存在的主要物种。基本上提纯的分子可以多于60％，优选75％，更优选90％，最优选95％不含其它天然混合物中存在的分子(排除溶剂)。术语“分离的”不是要包括在其天然态中存在的分子。
短语“结合CBP与p300的可能性”是指β-联蛋白分子结合CBP与p300的概率。通过指定条件下结合CBP的β-联蛋白分子的数目与结合p300的β-联蛋白分子数目的比例，可以表达和/或测量这种概率。类似地，“改变β-联蛋白结合CBP与p300可能性”的试剂是指与反应混合物中不存在化合物时的比例相比，当反应混合物中存在该化合物时改变上述比例的化合物。
术语“细胞分化而不是增殖的可能性”是指细胞分化而不是增殖的概率。通过指定条件下分化细胞数目与增殖细胞数目的比例，可以表达和/或测量这种概率。“增加细胞分化而不是增殖的可能性”的试剂是指与不存在化合物时的分化细胞数目与增殖细胞数目的比例相比，当存在该化合物时增加该同样比例的化合物。类似地，“增加细胞增殖而不是分化的可能性”的试剂是指与不存在化合物时的增殖细胞数目与分化细胞数目的比例相比，当存在该化合物时增加该同样比例的化合物。
短语“Wnt途径”是指可以通过Wnt蛋白(分泌的糖蛋白)与卷曲的七跨膜跨度(seven-transmembrane-span)受体结合引发的信号级联。这一途径在本领域中是已知的，并且进行了表征，它是大量文章和综述的主题(例如，参见Huelsken和Behrens，J.Cell Sci.1153977-8，2002；Wodarz等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.1459-88(1998)；Morin，PJ.，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002)；Sakanaka等人，Recent Prog.Horm.Res.55225-36，2000)。
短语“Wnt途径的活性”是指该途径至少一个组分的活性。例如，在某些实施方式中，Wnt途径的活性可以指β-联蛋白在诱发靶基因表达中的活性。Wnt途径的许多成分在本领域中是已知的，其包括但不限于Cerberus(Cer)、FrzB、Dickkopf(DKK)、LRP、异源三聚G蛋白、Dsh、酪蛋白激酶Iα(CKIα)、GSK3β、βTrCP、ACP、轴蛋白、CBP、p300、β-联蛋白、TCF、Froucho等。
“激活Wnt途径”的化合物是指当存在于具有Wnt途径的系统中时，导致β-联蛋白诱发靶基因表达的化合物。许多β-联蛋白诱发其表达的靶基因在本领域中是已知的，其包括但不限于Conductin、Myc、Twin、细胞周期蛋白D1、Nkd、Ubx、En-2、PPARδ、Xbra、ID2、Siamois、Xnr3、MMP7、TCF-1、存活蛋白等。这些基因也可以称为“Wnt/β-联蛋白途径靶向的基因”。
短语“选择性抑制Wnt/β-联蛋白途径靶向基因的表达”是指抑制Wnt/β-联蛋白途径靶向基因的亚型的表达，但是不抑制其它Wnt/β-联蛋白途径靶向的基因的表达。尽管不想受任何特定机理的束缚，本发明的发明人推测可以通过破坏β-联蛋白与其某些但并非全部潜在的结合配偶体之间的结合，来实现基因表达的选择性抑制。
试剂一方面，本发明提供可用于上述方法的试剂。除化合物1之外，其它可用于本发明方法的试剂可以通过对通式(I)的化合物进行筛选来鉴别 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
在一个实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9独立地选自氨基C2-5烷基、胍C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、苄基、取代苄基(其中苄基上的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、萘基、取代萘基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、双苯基甲基、取代双苯基甲基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基环己基C0-2烷基。
在一个实施方式中，E的R1、R2、R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的残余部分，而A的R3、B的R4或D的R5选自氨基酸侧链部分或其衍生物。
在另一个实施方式中，A的R3、D的R5、E的R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的残余部分，而在B的R1、R2和R4中的一个或多个，并且在一个方面其全部表示氨基酸侧链。在这种情况下，术语“化合物的残余部分”表示共价结合到回折拟态结构的R3、R5、R6、R7、R8和/或R9位置的任何分子部分、试剂、化合物、载体、分子、连接基团、氨基酸、肽或蛋白质。该术语也包括氨基酸侧链部分及其衍生物。
这里所使用的术语“化合物的残余部分”表示共价结合到回折拟态结构的任何分子部分、试剂、化合物、载体、分子、原子、连接基团、氨基酸、肽或蛋白质。该术语也包括氨基酸侧链部分及其衍生物。在本发明的一个方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R9中的任意一个或多个位置可以表示化合物的残余部分。在本发明的一个方面，R1、R2和R4中的一个或多个表示氨基酸侧链部分或其衍生物。
这里所使用的术语“氨基酸侧链部分”表示任何天然蛋白质中所存在的氨基酸侧链部分，包括(但是不限于)表1中载明的天然氨基酸的侧链部分。本发明的其它天然氨基酸侧链部分包括(但是不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羟赖氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸。此外，在本发明的实际应用中也可以使用糖基化的氨基酸侧链，包括(但是不限于)糖基化的苏氨酸、丝氨酸和天门冬酰胺。
表A氨基酸侧链部分氨基酸-H甘氨酸-CH3丙氨酸-CH(CH3)2缬氨酸-CH2CH(CH3)2亮氨酸-CH(CH3)CH2CH3异亮氨酸-(CH2)4NH3+赖氨酸-(CH2)3NHC(NH2)NH2+精氨酸
组氨酸-CH2COO-天门冬氨酸-CH2CH2COO-谷氨酸-CH2CONH2天门冬酰胺-CH2CH2CONH2谷酰胺 苯丙氨酸酪氨酸 色氨酸-CH2SH半胱氨酸-CH2CH2SCH3甲硫氨酸-CH2OH丝氨酸-CH(OH)CH3苏氨酸脯氨酸羟基脯氨酸除天然氨基酸侧链部分外，本发明的氨基酸侧链部分还包括它们的各种衍生物。这里所使用的氨基酸侧链部分的“衍生物”包括天然氨基酸侧链部分的变体和/或变异。例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸侧链部分通常可以被归类为低链烷基、低链芳基或低链芳烷基部分。氨基酸侧链部分的衍生物包括其它直链或支链的、环状或非环状的、取代或非取代的、饱和的或非饱和的低链烷基、低链芳基或低链芳烷基部分。
这里所使用的“低链烷基部分”含有1-12个碳原子，“低链芳基部分”含有6-12个碳原子，而“低链芳烷基部分”含有7-12个碳原子。因此，在一个实施方式中，氨基酸侧链衍生物选自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳烷基，并且在一个更优选的实施方式中，其选自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳烷基。
本发明的氨基酸侧链衍生物进一步包括低链烷基、低链芳基和低链芳烷基部分的取代衍生物，其中取代基选自(但是不限于)以下化学部分的一个或多个-OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和卤素(包括F、Cl、Br和I)，其中各个R的存在独立地选自直链或支链的、环状或非环状的、取代或非取代的、饱和或不饱和的低链烷基、低链芳基和低链芳烷基部分。此外，本发明的环状低链烷基、低链芳基和低链芳烷基部分包括萘，以及杂环化合物，例如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、异喹啉和咔唑。氨基酸侧链衍生物进一步包括低链烷基和低链芳烷基部分的烷基部分的杂烷基衍生物，包括(但是不限于)烷基和芳烷基的磷酸酯和硅烷。
代表性的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9部分具体包括(但是不限于)-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR，其中各个R的存在如上所述。
在另一个实施方式中，除了可以是氨基酸侧链部分或其衍生物(或者R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是化合物的残余部分)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是促进化合物与另一个部分或化合物连接的连接基团。例如，本发明的化合物可以连接到一种或多种用于诊断或筛选化验的公知化合物上，例如生物素。此外，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是将化合物连接到固体载体(例如在固相肽合成中所使用的载体)上的连接基团。在此实施方式中，连接到另一个部分或化合物上、或者到固体载体上，优选在R1、R2、R7或R8、或者R9位置上，更优选在R1或R2位置上。
在A是-(CHR3)-、B是-(C＝O)-、D是-(CHR5)-、E是-(C＝O)-并且G是-(XR7)n-的实施方式中，本发明的回折拟态化合物具有下式(II)
其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如上所述。在优选实施方式中，R1、R2和R7表示化合物的残余部分，并且R3或R5选自氨基酸侧链部分。
在A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-、G是-(C＝O)-(XR9)-的实施方式中，本发明的回折拟态化合物具有下式(III) 其中R1、R2、R4、R6、R9、W和X如上所述，Z是氮或CH(当Z是CH时，则X是氮)。在优选实施方式中，R1、R2、R6和R9代表化合物的残余部分，并且R4选自氨基酸侧链部分。
在更具体的实施方式中，其中A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-并且G是(XR7)n-，本发明的回折化合物具有下式(IV) 其中R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如上所述，并且Z是氮或CH(当Z是氮时，则n是0，当Z是CH时，则X是氮并且n不是0)。在优选实施方式中，R1、R2、R6和R7代表化合物的残余部分，并且R4选自氨基酸侧链部分。在一个方面，当Z和X都是CH时，R6或R7选自氨基酸侧链部分。
这些化合物可以通过使用合适的起始组分分子(下文中称为“组分片段”)而制备。简单的说，在具有式(I)的回折拟态结构的合成中，使第一和第二组分片段偶联以形成结合的第一-第二中间体，如果必要，使第三和/或第四组分片段偶联以形成结合的第三-第四中间体(或者，如果商品化，可以使用单独的第三中间体)，然后使结合的第一-第二中间体与第三-第四中间体偶联以提供第一-第二-第三-第四中间体(或者第一-第二-第三中间体)，将该中间体环化从而生成本发明的回折拟态结构。或者，式(I)的回折拟态结构可以通过单独的组分片段在溶液中逐步地，或者如固相肽合成中所常用的一样通过固相合成，进行连续偶联而制备。
制备本发明的化合物的具体组分片段及其组装如图8所示。例如，“第一组分片段”可以具有下式S1 其中R2如上所述，并且R是适用于肽合成的保护基，其中该保护基可以连接到聚合载体上以使固相合成能够进行。合适的R基团包括烷基，并且在优选实施方式中，R是甲基。在图8中，R基团之一是聚合(固体)载体，在该图中显示为“Pol”。这种第一组分片段可以通过H2N-R2和CH(OR)2-CHO的还原性胺化作用，或者通过H2N-R2与CH(OR)2-CH2-LG(其中LG代表离去基团，例如卤素(Hal)基团)之间的取代反应而容易地合成。
“第二组分片段”可以具有下式S2 其中P是适用于肽合成的氨基保护基团，L1是羟基或羧基-活化基团，并且R4如上所述。优选的保护基团包括叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基羰基(MOC)、9H-芴甲氧羰基(FMOC)，和丙烯氧基羰基(Alloc)。N-保护的氨基酸是商品化的；例如可从各种来源得到FMOC氨基酸。为使第二组分片段与第一组分片段反应，L1是羧基-活化基团，并且通过本领域中公知的羧基活化方法可以容易地完成羧基到活化羧基的转换。合适的活化羧酸基团包括酸卤，其中L1是例如氯或溴的卤素；酸酐，其中L1是例如乙酰基的酰基；活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和五氟苯基酯；以及其它活性中间体，例如使用例如二环己基碳二亚胺(DCC)的碳二亚胺在偶联反应中形成的活性中间体。因此，市售的N-保护氨基酸可以通过本领域技术人员公知的手段转化为羧酸活性形式。
在氨基酸的叠氮衍生物充当第二组分片段的情况下，这种化合物可以通过Zaloom等人所公开的反应(J.Org.Chem.465173-76，1981)，由相应的氨基酸制备。
或者，本发明的第一组分片段可以具有下式S1’ 其中R如上所定义，并且L2是离去基团，例如卤原子或甲苯磺酰基，并且本发明的第二组分片段可以具有下式S2’ 其中R2、R4和P如上所定义。
本发明的“第三组分片段”可以具有下式S3 其中G、E、L1和L2如上所定义。合适的第三组分片段可以是各种来源的市售产品，或者可以通过有机化学中公知的方法制备。
在图8中，式(1)的化合物的A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-并且E是-(CR6)-。如图9所示，其中的羧基在B位并且R基团在B位的式(1)的化合物，即，其中A是-(CHR3)-并且B是-(C＝O)-的化合物，可以用与图8所示方法类似的方法制备。图9也说明了向第一-第二-第三组分中间体中加入第四组分片段，而不是在与第一-第二中间体片段反应之前将第四组分片段附在第三组分片段上。此外，图9说明了其中D是-(CHR5)-(而不是图8所示的-(C＝O)-)并且E是-(C＝O)-(而不是图8所示的-(CHR6)-)的本发明的化合物的制备过程。最后，图9说明了其中G是NR7的化合物的制备过程。
因此，如上所述，式(I)的回折拟态化合物可以通过以下方法合成，使第一组分片段与第二组分片段反应从而生成结合的第一-第二中间体，然后继续使结合的第一-第二中间体与第三组分片段反应以提供结合的第一-第二-第三-第四中间体，然后使该中间体环化以生成回折拟态结构。
式(III)和(IV)的回折拟态结构可以通过与以上公开的模块化组分合成相类似的技术而制备，但是对组分片段进行适当的更改。
例如，可以通过以下通式说明用于本发明的化合物 其中，R1为具有8至11个环成员的二环芳基，其可以具有1至3个选自氮、氧或硫的杂原子，R2为5至7元单环芳香环，其可以具有1至2个选自氮、氧或硫的杂原子，而且化合物中的芳环可以具有一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基。
优选地，R1为萘基、喹啉基或异喹啉基，R2为苯基、吡啶基或哌啶基。更优选地，R1为萘基，R2为苯基。
在另一优选的实施方式中，化合物具有如下的(6S，10R)-构型 其中R1和R2与前述具有相同的含义。在另一优选的实施方式中，通式(I)的化合物具有如图1A所示的化学结构，该化合物在本文中称为化合物1。可以根据授予Molecumetics Ltd.的美国专利第6,184,223号的公开内容制备具有通式(I)的化合物。前述讨论是在化合物1的活性方面进行的，但是，在本方法中可以对结构式(I)的其它化合物进行活性筛选。
以下文献中可以找到其它用于本发明的示范性试剂PCT申请公开第WO03/031448号、美国专利公开第US20040072831号、美国申请第10/803,179和10/826,972号，其标题均为“回折拟态及其相关方法”(“Reverse-Turn Mimetics and Method Relating Thereto”)。
核酸分子一方面，本发明提供各种核酸分子，其编码可用于筛选试剂的多肽，与β-联蛋白和p300之间的相互作用相比，该试剂选择性地抑制β-联蛋白和CBP之间的相互作用。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少为80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长人(或小鼠)CBP蛋白。如本文所使用，两种核酸的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默认参数确定。这些程序运行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7，1993)修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)中的算法。例如，BLAST程序可以自网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，核酸分子编码含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，核酸分子含SEQ ID NO1或SEQ ID NO6。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码CBP蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述序列与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者最少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)或者与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述序列与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者最少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO1(或SEQ ID NO6)片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长人p300蛋白。在某些实施方式中，核酸序列编码含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，核酸分子含SEQ ID NO3。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其含有SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长p300蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO3片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述序列与SEQ ID NO3的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者最少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其基本由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO3片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸分子编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述序列与SEQ ID NO3的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者最少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸序列，其由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少30个，或者至少60个，或者至少90个，或者至少120个，或者至少150个，或者至少180个，或者至少210个，或者至少240个，或者至少270个，或者至少300个核酸，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为300个，或270个，或240个，或210个，或180个，或150个，或120个，或90个，或60个核酸。独立地，同时也是最佳地，核酸序列内的片段与SEQ ID NO3片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，核酸序列编码结合β-联蛋白的肽。
根据本发明的核酸分子可以通过用限制性内切酶或其它核酸酶来消化对全长CBP和p300蛋白编码的核酸分子而得到。编码全长CBP和p300蛋白的核酸分子可以从基因组DNA或cDNA中通过本领域已知的作法分离(参见Sambrook和Russell，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001)。可以使用对应于SEQ ID NO1、3或6区域的核酸探针筛选基因组或cDNA库。适于筛选基因组或cDNA库的核苷酸通常长度为20-40个碱基，并可以用多种有助于检测的分子进行标记(如放射性核素、酶标记、蛋白标记、荧光标记或生物素)。基因组和cDNA库可以在多种适当的载体中构建，其包括质粒、噬菌体、酵母人工染色体和黏端质粒载体。另外，库可以从市场上购买(如Clontech，Palo Alto，CA)。
也可以使用其它方法获得根据本发明的核酸分子。一种优选的方法是进行聚合酶链式反应，以扩增期望的编码CBP和p300蛋白的核酸分子区域(例如编码含CBP或p300前111个氨基酸残基的多肽的区域)。例如，PCR扩增的具体方法见于Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，NY 1995。
另一种获得核酸分子的方法是通过使用能够结合CBP 1-111或p300 1-111的多肽探针的表达克隆。所述探针可以包括针对CBP 1-111、p300 1-111或其片段的抗体。表达克隆方法描述于Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience，NY 1995；和Blackwood和Eisenman，Methods in Enzymology 254229-40，1995。
还可以使用合成化学技术制造本发明的多聚核苷酸，得到本文所公开的序列。遗传密码的简并使得可以存在另外的编码SEQ ID NO1、3或6中所列的氨基酸序列的核苷酸序列。所有这些核苷酸序列均在本发明的范围之内。
编码CBP或p300片段的核酸序列可以与多种异源序列融合，例如编码亲和性标记(如GST和His-tag)的序列和编码分泌信号的序列。与编码亲和性标记的序列融合使人们可以通过融合标记进行亲和性提纯，有助于所编码多肽的提纯。与编码分泌信号的序列融合使人们可以从细胞溶解产物、壁膜间隙、韧皮部，或者从生长或发酵培养基中回收多肽，也有助于所编码多肽的提纯。适用的分泌信号是广泛存在的，并且在本领域中是公知的(例如von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。
如上文所述，本发明的核酸分子还可以包括SEQ ID NO1、3或6中列出的天然核酸分子的变异体(包括等位基因)。这种变异体包括天然变异体(例如简并形式、多态性、剪接变异体或突变体)和本领域中已知的基因工程产生的变异体。
多肽序列一方面，本发明提供多种用于筛选试剂的多肽分子，与β-联蛋白和p300之间的相互作用相比，该试剂选择性地抑制β-联蛋白和CBP之间的相互作用。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2(或SEQ ID NO5)或者与SEQ ID NO2(或SEQ IDNO5)的同源性至少为80％、85％、90％、95％、98％或99％的肽，附带条件为所述的肽不是全长CBP蛋白(如人或小鼠CBP)。如本文所使用，两种肽的百分比同源性使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215403-10，1990)的BLAST程序以默认参数确定。这些程序运行Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad Sci.USA 905873-7，1993)中修改的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8，1990)的算法。例如，BLAST程序可以自网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，根据本发明的多肽包括含有天然CBP序列(如人CBP或小鼠CBP)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，多肽分子含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是全长CBP蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO2片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽组成。在不同的最佳实施方式中，所述肽与SEQ ID NO2的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者最少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO2片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其由SEQID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述的肽与SEQ ID NO2的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其由SEQID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO2片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长人p300蛋白。在某些实施方式中，多肽包括含有天然p300序列(如人p300或小鼠p300)中存在的不多于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述的多肽含SEQ ID NO4。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是全长p300蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO4片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO4的同源性至少为80％的肽组成。在不同的最佳实施方式中，所述的肽与SEQ ID NO4的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO4片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其由SEQID NO4或者与SEQ ID NO4的同源性至少为80％的肽组成，附带条件为所述的肽不是CBP蛋白。在不同的最佳实施方式中，所述的肽与SEQ ID NO4的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供基本上提纯和分离的肽，其由SEQID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成的。在不同的最佳实施方式中，所述片段具有至少10个，或者至少20个，或者至少30个，或者至少40个，或者至少50个，或者至少60个，或者至少70个，或者至少80个，或者至少90个氨基酸(残基)，同时独立地，所述片段的长度(可能时，基于片段的最小长度)为100个，或90个，或80个，或70个，或60个，或50个，或40个，或30个，或20个氨基酸(残基)。独立地，同时也是最佳地，肽内的片段与SEQ ID NO4片段的同源性至少为85％，或者至少为90％，或者至少为95％。在优选的实施方式中，所述的肽结合β-联蛋白。
在某些实施方式中，本发明的多肽包含保守氨基酸变换，即，替换SEQ ID NO2或4中带相似电荷或不带电荷的氨基酸。保守氨基酸变换涉及将一种氨基酸替换成侧链结构相关的氨基酸类别中的另一种氨基酸。天然氨基酸通常分为四类酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也归类为芳香氨基酸。非天然氨基酸也可用于形成本发明的多肽。
本发明还提供CBP或P300融合蛋白，其包括融合到含有一种或多种异源多肽的氨基酸序列上的CBP或P300片段或其同源物。这种异源多肽可以对应于任何来源的天然多肽，或者可以是重组工程产生的氨基酸序列。融合蛋白可用于提纯、产生针对氨基酸序列的抗体，并用于多种化验系统。常用于融合蛋白构建的蛋白包括β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、自身荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光素酶、辣根过氧化物酶(HRP)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。此外，融合蛋白的构建中可以使用附加表位，其包括组氨酸(His)标记、FLAG标记、流感血凝素(HA)标记、Myc标记、VSV-G标记和硫氧还蛋白(Trx)标记。其它的融合结构可以包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标记物、Lex aDNA结合结构域(DBD)融合、GAL4 DNA结合结构域融合、和单纯疱疹病毒(HSV)BP 16蛋白融合。
本发明的多肽可以通过各种本领域已知的方法得到。例如，可以通过例如亲和力色谱的生化方法分离含SEQ ID NO2(或SEQ ID NO4)的CBP(或p300)片段。可用于CBP或p300多肽的亲和基质可以是其上连有针对SEQ ID NO2或4或其片段制得的抗CBP或抗p300单克隆或多克隆抗体的固相。或者，可以将已知的结合CBP或p300(如β-联蛋白)的多肽用作分离CBP或p300多肽或其片段的亲和基质。
其它分离CBP、p300或其片段的生化方法包括制备性凝胶电泳、凝胶过滤、亲和力色谱、离子交换和反相色谱、层析聚焦、等电聚焦和蔗糖或甘油密度梯度(Deutscher，Methods in EnzymologyGuide toProtein Purification，第182卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter38，1990；Balch等人，Methods in Enzymology，第257卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Chapter 8，1995)。
根据本发明的多肽也可以通过化学合成，如固相肽合成法产生(Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149，1964)。也可以使用本领域公知的标准液相法来合成含SEQ ID NO2或4或其同源物的多肽(Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin，1984；Bodanszky，Peptide Chemistry，Springer-Verlag，Berlin，1993)。可以分离新合成的多肽，例如通过高效液相色谱，并且可以使用质谱或氨基酸序列分析对其进行表征。
根据本发明的多肽也可以通过重组DNA法产生。可以将本发明提供的编码SEQ ID NO2或4或其同源物的核酸克隆到适当的表达载体中。这种载体有市售，或者可以由本领域技术人员构建，并含有转录和翻译所必需的表达元件。如果适当的话，所选的载体也可以用于原核或真核宿主体系中，只要表达和调控元件的来源是相容的。例如，可以使用具有针对SEQ ID NO2或4或其片段的抗体的亲和力色谱、离子交换色谱、HPLC、尺寸排阻色谱、硫酸铵结晶、电共焦、或制备性凝胶电泳来分离宿主细胞中产生的或者由细胞分泌的重组多肽(主要参见Ausubel等人，见上文；Sambrook等人，见上文)。通常，分离提纯的蛋白在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上证实为单条带。
本发明还提供含SEQ ID NO2或4或其同源物和异源多肽的融合蛋白。这种融合蛋白可以通过将两个蛋白片段共价连接，或者通过分子生物学领域的标准方法制得。例如，如本领域已知，可以使用重组DNA法制备融合蛋白，这通过生成含编码序列的DNA结构，该编码序列选自SEQ ID NO2或4，并在合适的阅读框架中使核苷酸编码第二个蛋白片段并在宿主细胞中表达DNA结构。许多构建融合蛋白的试剂盒可以获自为研究实验室提供实验工具的公司，例如，其包括Promega Corporation(Madison，WI)、Stratagene(La Jolla，CA)、Clontech(Mountain View，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、MBL International Corporation(MIC；Watertown，MA)、和QuantumBiotechnologies(Montreal，Canada；1-888-DNA-KITS)。
使用方法本发明提供结构式(I)的化合物，其抑制β-联蛋白/TCF诱导的转录亚型。例如，如实施例中所详述，化合物1选择性地阻断β-联蛋白和CBP的相互作用，却不干扰β-联蛋白和p300的相互作用，其中p300与CBP密切相关。化合物1处理导致β-联蛋白从核到胞质的重新分布，选择性地抑制CBP与某些靶基因(如c-myc和细胞周期蛋白D1)的启动子的结合，从而抑制这些基因的表达。此外，化合物1选择性地激活转化中，但是不正常的结肠细胞中的凋亡胱天蛋白酶，导致癌细胞的G1/S期停滞，并降低转化的结直肠细胞的增殖。因此，本发明的化合物可以具有多种用途，例如治疗癌症、降低肿瘤生长、增加细胞凋亡、调控β-联蛋白诱发的基因表达和类似用途。
一方面，本发明提供相对于β-联蛋白/p300的相互作用，选择性地抑制β-联蛋白/CBP相互作用的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，其中所述的组合物包括β-联蛋白、CBP和p300，所述化合物相对于β-联蛋白/p300的相互作用，选择性地抑制β-联蛋白/CBP的相互作用。
另一方面，本发明提供相对于β-联蛋白/CBP的相互作用，选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，其中所述组合物包括β-联蛋白、CBP和p300，所述化合物相对于β-联蛋白/CBP的相互作用，选择性地抑制β-联蛋白/p300的相互作用。某些化合物1的类似物对于β-联蛋白/p300复合体是选择性的。
蛋白-蛋白相互作用(如β-联蛋白与p300之间的相互作用、和β-联蛋白与CBP之间的相互作用)、以及试剂对蛋白-蛋白相互作用的影响，可以通过本领域已知的任何合适方法表征和/或测量。这些方法可以包括使用亲和力提纯的重组β-联蛋白、CBP和p300蛋白或其片段的体外结合化验。在某些实施方式中，可以将一种蛋白组分首先固定在固体载体(如ELISA板)，以便于蛋白-蛋白相互作用的检测和测量。蛋白-蛋白相互作用还可以使用体内结合化验表征，例如免疫沉淀法和蛋白质印记分析，如实施例中所述。
另一方面，本发明提供促进β-联蛋白从核易位至胞液的方法，该方法包括向细胞中加入化合物，所述细胞包括核和胞液，所述的核含有β-联蛋白，而且所述化合物导致β-联蛋白从核易位至胞液。β-联蛋白从核易位至胞液可以通过免疫荧光分析检测，如实施例中所述。
另一方面，本发明提供选择性地抑制WNT/β-联蛋白途径靶向基因的表达的方法，该方法包括向组合物中加入化合物，所述组合物含有WNT/β-联蛋白途径靶向的基因，所述化合物导致WNT/β-联蛋白途径靶向基因表达的变化。
如上文所述，本发明提供影响CBP启动的基因表达的方法，并在优选的实施方式中提供优先于影响p300启动的基因表达而影响CBP启动的基因表达的方法。本发明还提供影响p300启动的基因表达的方法，并在优选的实施方式中提供优先于影响CBP启动的基因表达而影响p300启动的基因表达的方法。考虑到CBP与p300之间的结构相似性，和许多本领域技术人员将CBP和p300视为生物功能基本相同这一事实，本发明尤其值得注意。该效力可以应用于诸如存活蛋白表达的影响。
一方面，本发明提供调节β-联蛋白诱发的基因表达的方法，该方法包括使组合物与试剂接触，这里的组合物包含β-联蛋白、CBP和p300，β-联蛋白具有结合CBP与p300的可能性，而且所述试剂以有效改变β-联蛋白结合CBP与p300的可能性的量存在。在示范性方面，调节的形式可以是增加CBP与β-联蛋白的结合，并任选地同时降低p300与β-联蛋白的结合。或者，调节的形式可以是增加p300与β-联蛋白的结合，并任选地同时降低CBP与β-联蛋白的结合。所述的组合物可以是细胞。
所关注的基因表达和试剂对这些基因表达的影响可以通过本领域已知的任何适当方法进行。这些方法包括使用cDNA微点阵、具有扩增所关注基因用的引物的RT-PCR、和测量所关注基因的启动子驱动的报道基因活性和ChIP化验。
另一方面，本发明提供调节Wnt途径活性的方法，其包括(a)使(i)含Wnt途径组分的组合物与(ii)激活Wnt途径的化合物相接触，以提供激活的Wnt途径；和(b)用完全或基本上干扰p300与β-联蛋白之间结合，但是极少或者不干扰CBP与β-联蛋白之间结合的化学试剂调节Wnt途径的活性。
另一方面，本发明提供促进细胞增殖的方法，其包括(a)在一定比例的群体增殖且一定比例的群体分化的条件下提供细胞群体；和(b)向群体中加入化学试剂，在此所述试剂导致增殖细胞的比例相对于分化细胞的比例增加。
细胞增殖和细胞分化可以通过本领域已知的任何适当方法进行表征。这些方法包括流式细胞分析和软琼脂化验，如实施例中所述。
另一方面，本发明提供将干细胞保持在未分化状态下的方法，其包括使干细胞与抑制细胞分化或促进细胞增殖的试剂相接触，所述试剂的量对于将干细胞保持在未分化状态下是有效的。在某些实施方式中，所述试剂能够降低β-联蛋白与p300之间的相互作用，而不干扰β-联蛋白与CBP之间的相互作用。
干细胞疗法为治疗多种变形疾病提供了可能，这些变形疾病是由特定细胞类型过早死亡或功能失常且机体不能将其替换或恢复所导致的。干细胞的可能治疗用途包括器官移植患者的免疫调节、如肌肉营养不良、多发性硬化和类风湿性关节炎之类的自身免疫病的治疗、如中风、骨髓损伤和烧伤之类的受损组织的修复、如Lou Gehrig氏病之类的神经变形疾病和如帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病之类的神经系统病症的治疗、白血病、镰形细胞贫血、心脏病和糖尿病的治疗。对于大多数干细胞疗法来说，可以在体外培养胚胎干细胞或成熟干细胞，诱导其分化成期望的细胞类型并移值到患者体内。对了干细胞的成功培养来说，干细胞需要保持未分化状态。
为了将干细胞保持在未分化状态下，可以在不同的干细胞培养阶段使用根据本发明的化合物，例如促进细胞增殖或抑制细胞分化的化合物。例如，这种化合物可以在从其来源组织中分离干细胞时使用。或者，可以在一定的培养期之后将其加入到培养基中。它还可以持续存在于培养基中，将干细胞保持在未分化状态下。通过将化合物的量调节到使干细胞保持在未分化状态，或者与不存在化合物时培养的干细胞相比干细胞的分化得以降低，并且细胞培养的其它方面(例如细胞生存率和细胞增值率)不受有害影响的水平，可以对化合物的浓度进行优化。
本发明的这些和其它方法可以用化学试剂实施，例如本文识别为化合物1的化学试剂以及它的类似物。
筛选化验可以根据以下方法对结构式(I)的化合物以及其它试剂进行本文所述的活性的筛选。
例如，一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含CBP 1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含β-联蛋白的部分与步骤(a)的含CBP 1-111的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制所述含CBP 1-111的部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
另一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含CBP 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含CBP 1-111的部分与步骤(a)的含β-联蛋白的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制所述含β-联蛋白的部分与含CBP 1-111的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋CBP相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制所述含p3001-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
另一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含有(1)与CBP 1-111结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使CBP 1-111从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与CBP 1-111的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含p3001-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制所述含p300 1-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制所述含p300 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含p300 1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含β-联蛋白的部分与步骤(a)的含p300 1-111的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制所述的含p300 1-111的部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP1-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
另一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含p300 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含p300 1-111的部分与步骤(a)的含β-联蛋白的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制所述的含β-联蛋白的部分与含p300 1-111的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
另一方面，本发明提供鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，其包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含有(1)与p300 1-111相结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使p300 1-111从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与p300 1-111的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。任选地，该方法可以进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制所述含CBP 1-111的部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(d)的所述小分子并不抑制所述含CBP 1-111的部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
蛋白-蛋白相互作用(如β-联蛋白与p300之间的相互作用、和β-联蛋白与CBP之间的相互作用)、以及试剂对蛋白-蛋白相互作用的影响，可以通过本领域已知的任何适当方法表征和/或测量。例如，用于本发明的方法的适当化验手段为等温滴定量热法(ITC)。ITC实验可以使用MicroCal MCS等温滴定量热仪(MicroCal，Northampton MA)基本上按照制造商所建议进行。简言之，将CBP C1片段针对含50mMPIPES(pH7.5)和0.1mM EDTA的透析缓冲液进行广泛透析。向蛋白样品中加入DMSO至0.05％的最终浓度，以对应于稀释的药物样品。使用Bradford蛋白化验(Bio-Rad laboratories，Hercules CA)测定蛋白浓度，其使用牛血浆γ球蛋白作为标准物(Bio-Rad)。由于溶解性的限制，通过将5-15ul CBP C1[223uM]注入到充有23.3uM假定的小分子抑制剂的样品细胞中进行ITC实验。假定的小分子抑制剂在样品细胞中饱和之后评估稀释热，并且使用Origin 5.0软件包(MicroCal)计算热力学参数。稀释热越高表明假定的小分子抑制剂与CBP片段之间的结合越强。假定的小分子抑制剂与CBP片段之间的较强结合鉴别出可以更有效地破坏CBP结合，例如CBP与β-联蛋白结合的小分子。
药物组合物和给药可以将根据本发明的核酸分子、肽和化合物加入到适于给药的药物组合物中。这种组合物典型地含核酸分子、肽或化合物和药学可接受的载体。“药学可接受的载体”是指与药物给药相容的溶剂、分散介质、覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。也可以将辅助活性化合物加入到组合物中。
可以将本发明的药物组合物肠胃外、局部、口服或定位给药以进行治疗处理。可以使用多种水相载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸和类似物，也可以包括其它提高稳定性的蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。生成的组合物可以通过传统的公知灭菌技术进行灭菌。可以将溶液包装备用，或者在无菌条件下过滤并冻干，给药之前将冻干的制剂与无菌溶液混合。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们包封在明胶胶囊中，或者压入到药片中。为了口服治疗给药，可以将活性化合物与赋形剂结合，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。组合物可以包括药物相容的粘合剂和/或佐剂材料作为其一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂和类似物可以含有任意的下列成分或性质相似的化合物粘合剂(如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)；赋形剂(如淀粉或乳糖)、分裂剂(如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉)；润滑剂(如硬脂酸镁或Sterotes)；助流剂(如胶状二氧化硅)；甜味剂(如蔗糖或糖精)；或调味剂(如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂)。
对于吸入式给药，可以将化合物从加压容器或分配器中以气溶胶喷雾的形式输送，该加压容器或分配器含有适当的推进剂，例如二氧化碳之类的气体，或者喷雾器。
可以通过经粘膜或经皮方式进行系统给药。对于经粘膜或经皮给药，制剂中使用适于待渗透载体的渗透剂。这些渗透剂通常是本领域已知的，例如，对于经粘膜给药，其包括去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻用喷雾或栓剂完成。对于经皮给药，如本领域通常己知，可以将活性化合物配制到油膏、软膏、凝胶或乳剂中。
在一个实施方式中，活性化合物与保护化合物在机体内不被迅速排泄的载体一起制备，例如可控释放制剂，其包括植入物和微胶囊输送系统。可以使用可生物降解并且生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这些制剂的制备方法对本领域的技术人员来说是显而易见的。材料也可以购自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.。
尤其有利的是以便于给药的剂量单位形式配制剂量均匀的口服或肠胃外组合瓦。本文所用的剂量单位形式是指物理上分散的、适合作为待治疗受试者单一剂量的单位；每单位含有预定量的活性化合物，该预定的量计算成与需要的药物载体结合产生期望的治疗效果。对本发明的剂量单位形式的具体要求直接依赖于以下几个方面并由其指示活性化合物的独特性质和待实现的具体治疗效果，以及配制这种个体治疗用活性化合物的技术本身的限制。
这些化合物的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物方法测定，例如测定LD50(50％的群体致死的剂量)和ED50(50％的群体治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比即为治疗指数，其可以表达为比值LD50/ED50。表现出大的治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出有毒副作用的化合物，应当小心地设计将这种化合物靶向受侵袭组织处的输送系统，以便将对未受染细胞的潜在损害降至最低，从而减轻副作用。
细胞培养物化验和动物研究中得到的数据可以用于配制用于人的剂量范围。这种化合物的剂量优选地处于包括ED50而毒性很小或无毒的循环浓度范围以内。剂量可以取决于所采用的剂量形式和所利用的给药途径在该范围内变化。对于任何用于本发明方法的化合物来说，治疗有效剂量可以最初从细胞培养物化验来评估。可以在动物模型中配制剂量以达到包括细胞培养物中测定的IC50(即实现半数症状最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更精确地测定可用于人的剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱测量。
以下实施例用来对本发明进行说明，其不应当理解为对本发明的限定。
制备实施例制备实施例1(N-Fmoc-N’-R3-肼基)-乙酸的制备(1)N-Fmoc-N’-甲基肼的制备 为2L的双颈圆底烧瓶配上玻璃塞和钙管。加入硫酸甲基肼(20g，139mmol，其中R3是甲基)的THF(300mL)溶液，并且加入DiBoc(33g，153mmol)的THF溶液。经2小时，用加料漏斗滴加入饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)，同时剧烈搅拌。6小时后，缓慢加入Fmoc-C1(39g，153mmol)的THF溶液。所得到的悬浮液在0℃下搅拌6小时。用乙酸乙酯(EA，500mL)萃取该混合物，并且保留有机层。用硫酸钠干燥该溶液并且真空蒸发。无需纯化进行下一步。
为1L的双颈圆底烧瓶配上玻璃塞和钙管。加入由前步得到的产物在MeOH(300mL)中的溶液，并且用加料漏斗缓慢加入浓盐酸(30mL，12N)，同时在冰水浴中用磁力进行搅拌，并且搅拌过夜。用EA(1000mL)萃取该混合物并且保留有机层。用硫酸钠干燥该溶液并且真空蒸发。通过用正己烷和EA重结晶来对残余物进行纯化，从而得到N-Fmoc-N’-甲基肼(32.2g，83％)。1HNMR(DMSO-D6)δ7.90～7.88(d，J＝6Hz，2H)，δ7.73～7.70(d，J＝9Hz，2H)，7.44～7.31(m，4H)，4.52～4.50(d，J＝6Hz，2H)，4.31～4.26(t，J＝6Hz，1H)，2.69(s，1H)。
(2)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁基酯的制备
为1L的双颈圆底烧瓶配上玻璃塞和连接到钙管的回流冷凝器。加入N-Fmoc-N’-甲基肼(20g，75mmol)的甲苯(300mL)溶液。缓慢加入溴乙酸叔丁酯(t-butylbromo acetate，22g，111mmol)的甲苯(50mL)溶液。缓慢加入Cs2CO3(49g，149mmol)。缓慢加入NaI(11g，74mmol)同时剧烈搅拌。在回流温度下将反应混合物搅拌1天。过滤产品混合物并且用EA(500mL)萃取。用硫酸钠干燥该溶液并且真空蒸发。用己烷∶EA＝2∶1的溶液通过色谱对产品进行纯化以得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(19.8g，70％)。
1H-NMR(CDCl3-d)δ7.78～7.75(d，J＝9Hz，2H)，δ7.61～7.59(d，J＝6Hz，2H)，7.43～7.26(m，4H)，4.42～4.40(d，J＝6Hz，2H)，4.23(b，1H)，3.57(s，2H)，2.78(s，3H)，1.50(s，9H)。
(3)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸的制备 为1L的双颈圆底烧瓶配上玻璃塞和连接到钙管的回流冷凝管。加入(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(20g，52mmol)。缓慢加入盐酸溶液(150mL，在二氧己环中的4M溶液)，同时在冰水浴中剧烈搅拌。反应混合物在室温下搅拌1天。在减压下于40℃下将该溶液完全浓缩。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)，并且用乙醚(100mL)洗涤水层。在0℃下缓慢滴加浓盐酸(pH2-3)。萃取该混合物并且保留有机层(500mL，MC)。用硫酸钠干燥该溶液并且真空蒸发。用正己烷和乙酸乙酯通过重结晶对残余物进行纯化，从而得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)乙酸(12g，72％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ12.38(s，1H)，8.56(b，1H)，7.89～7.86(d，J＝9Hz，2H)，7.70～7.67(d，J＝9Hz，2H)，7.43～7.29(m，4H)，4.29～4.27(d，J＝6Hz，2H)，4.25～4.20(t，J＝6Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.56(s，3H)。
制备实施例2(N-Moc-N’-R7-肼基)-乙酸的制备(1)(N’-甲氧基羰基-肼基)乙酸乙基酯的制备
将MOC-NH-NH2(50g，0.55mol)溶解在DMF(300ml)中，然后向反应容器中加入溴乙酸乙酯(68ml，0.555mol)和碳酸钾(77g，0.555mol)。将该混合物加热到50℃并保持5小时。反应完成后，将该混合物过滤，并且用EtOAc稀释，然后用盐水洗涤(3次)。粗产品用柱纯化(洗脱液Hex/EtOAc＝4/1)，从而得到72克无色的油。
(2)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸乙基酯 将乙基酯(10g，0.05mol)、碳酸钾(6.9g，0.05mol)和R7-溴(14.1g，0.06mol)溶解在DMF(200ml)中，并且将该混合物加热到50℃并保持5小时。反应完成后，将该混合物过滤，并且用EA稀释，然后用盐水洗涤(3次)。用色谱纯化粗产品(洗脱液Hex/EtOAc＝4/1)。
(3)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸 将烷基化的乙基酯(9.5g，0.03mol)溶解在THF/水(1/1，ml)中，并且在0℃下加入2N的NaOH(28.3ml)溶液。在室温将该混合物搅拌2小时。当在紫外下检测不到起始的酯时，用EA稀释该溶液，然后分离。用1N的盐酸将水层酸化到pH3～4，并且用DCM萃取化合物(3次)。合并的有机层经MgSO4干燥后进行蒸发，得到黄色固体。
制备实施例3
(1)Nβ-Moc-Nα-苄基-肼基甘氨酸的制备 该化合物是根据文献的程序而制备的。(Cheguillaume等，Synlett2000，3，331)。
(2)1-甲氧基羰基-2，8-二苄基-6-甲基-4，7-二氧-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪的制备将溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)和苄胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在配有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用转炉[RobbinsScientific]将该反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，并且用DMF，然后用DCM清洗该树脂，从而得到第一组分片段。
将Fmoc-丙氨酸(4当量，市售，第二组分片段)，HATU(PerSeptiveBiosystems，4当量)和DIEA(4当量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到树脂中。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室温下将该反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
将Nβ-Moc-Nα苄基-肼基甘氨酸(4当量，制备实施例2中的化合物(3)，其中R7是苄基，第三组分片段)、HOBT[Advanved ChemTech](4当量)和DIC(4当量)的DMF溶液加入到以上制备的树脂中。在室温下将反应混合物振荡3小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗该树脂。在室温下真空干燥该树脂。
在室温下用甲酸(2.5ml)将该树脂处理18小时。过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，从而得到作为油的产品。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.51(d，3H)，2.99(m，1H)，3.39(d，1H)，3.69(m，1H)，3.75(m，1H)，3.82(s，3H)，4.02(d，1H)，4.24(d，1H)，4.39(d，1H)，4.75(d，1H)，5.14(q，1H)，5.58(dd，1H)，7.10-7.38(m，10H)。
制备实施例4 实施例2R2＝-Bn，R4＝-CH3实施例3R2＝-CH3，R4＝-CH3(1)N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯的制备 迅速地搅拌在15ml的CH2Cl2中的N-甲基肼羧酸9H-芴-9-基甲基酯(107mg，0.4mmol)和15ml的饱和NaHCO3水溶液的冰冷却的两相混合物，同时加入在甲苯中的1.93M光气(1.03ml，2mmol)作为单独的部分。将反应混合物搅拌30分钟，收集有机相，并且用CH2Cl2萃取水相。合并的有机相经MgSO4干燥后，过滤，真空浓缩以得到作为泡沫状固体的128mg(97％)氨基甲酰氯。[警告光气蒸汽剧毒。
在通风橱中使用]。该产品无需进一步纯化即用于以下的固相合成。
(2)2，5-二甲基-7-苄基-3，6-二氧-六氢-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸苄酰胺的制备将溴乙缩醛树脂(30mg，0.98mmol/g)和苄胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在带有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用转炉[RobbinsScientific]将反应混合物振荡12小时。过滤收集树脂，并且用DMF，然后用DCM清洗该树脂，以得到第一组分片段。
将Fmoc-丙氨酸(3当量，第二组分片段，市售)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3当量)和DIEA(3当量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到树脂中。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂，从而将第二组分片段加入到第一组分片段上。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
将上述步骤(1)中所获的N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯(结合的第三和第四组分片段，5当量)、DIEA(5当量)的DCM溶液加入到上述制备的树脂中。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g树脂加入10ml)。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
在室温下用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物对该树脂进行4小时的处理。然后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗该树脂。在室温下真空干燥该树脂。
在室温下用甲酸将该树脂处理14小时。过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，从而得到作为油的产品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.98(s，3H)，3.18(m，1H)，3.46(m，1H)，4.37-4.74(m，5H)，5.66(dd，1H)，6.18(m，1H)，7.10-7.40(m，10H)。
制备实施例52，5，7-三甲基-3，6-二氧-六氢-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸苄酰胺的制备根据制备实施例4所述的相同程序制备题述化合物，但是使溴乙缩醛树脂与甲基胺溶液进行反应而非苄胺。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.99(s，3H)，3.03(s，3H)，3.38(m，1H)，3.53(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.52(q，1H)，4.59(dd，1H)，5.72(dd，1H)，6.19(br.t，1H)，7.10-7.38(m，5H)。
制备实施例62-甲基-5-(对羟基苯甲基)-7-萘甲基-3，6-二氧-六氢-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸苄酰胺的制备将溴乙缩醛树脂(30mg，0.98mmol/g)和萘甲胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在带有螺帽的管形瓶中。使用转炉[RobbinsScientific]将反应混合物在60℃下振荡12小时。过滤收集树脂，并且用DMF、然后用DCM清洗该树脂，从而得到第一组分片段。
向该树脂中加入Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3当量)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3当量)和DIEA(3当量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂，从而将第二组分片段加入到第一组分片段上。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
向以上制备的树脂中加入N’-Fmoc-N-肼基碳酰氯(5当量)、DIEA(5当量)的DCM溶液。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM、和DMF清洗该树脂。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g树脂中加入10ml)。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
在室温下用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物将该树脂处理4小时。然后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗该树脂。在室温下真空干燥该树脂。
在室温下用甲酸将该树脂处理14小时。过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，从而得到作为油的产品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
制备实施例72-甲基-6-(对羟基苯甲基)-8-萘基-4，7-二氧-六氢-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸苄酰胺的制备将溴乙缩醛树脂(60mg，0.98mmol/g)和萘胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在带有螺帽的管形瓶中。使用转炉[Robbins Scientific]将反应混合物在60℃下振荡12小时。过滤收集树脂，并且用DMF，然后用DCM清洗该树脂。
将Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)和DIEA(4当量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到该树脂中。在室温下将反应混合物振荡4小时后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
将Nβ-Fmoc-Nα-苄基-肼基甘氨酸(4当量)、HOBT[AdvancedChemTech](4当量)和DIC(4当量)的DMF溶液加入到以上制备的树脂中。在室温下将反应混合物振荡3小时后，过滤收集树脂，并且用DMF，然后用DCM清洗该树脂。向该树脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g树脂中10ml)。在室温下将反应混合物振荡8分钟后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗该树脂。
在室温下用异氰酸苄酯(4当量)和DIEA(4当量)在DCM中的混合物将该树脂处理4小时。然后，过滤收集树脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗该树脂。在室温下真空干燥该树脂后，在室温下用甲酸(2.5ml)将该树脂处理18小时。过滤除去树脂后，在减压下浓缩滤液，从而得到作为油的产品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.73(s，3H)，3.13(d，1H)，3.21-3.38(m，3H)，3.55(d，1H)，3.75(t，1H)，4.22(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.79(d，1H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)；MS(m/z，ESI)564.1(MH+)586.3(MNa+)。
实施例质粒CBP和p300的缺失构造在市售的pTriEx-3载体(Novagen，Madison，WI)中表达。鼠CBP的缺失系列通过PCR从Vollum Institute，Portland，OR的Dr.Richard Goodman慷慨赠送的全长小鼠CBP质粒产生。扩增的区域在5’-端具有BamH I部位，在3’-端具有Not I部位，使人们可以用表达载体pTriEx-3的ATG进行框内克隆。为了进行识别和提纯，也可以对质粒在COOH-端用6X-组氨酸和单纯疱疹病毒(HSV)标记物进行框内克隆。用于克隆CBP C-端切除构造的正向引物为5′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGATGGCCGAGAACTTGCTG-3′(SEQ IDNO7)。用于CBP-C1(1-334)、-C2(1-634)、-C3(1-1594)、-C4(1-2062)、-C5(1-2623)、-C6(1-3094)、-C7(1-3694)的反向引物为C15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCC-GCGTTTGTACTGTTCGGCTG-3′(SEQ IDNO8)，C25′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCTCC-ATTCATGACTTGAGC-3′(SEQ ID NO9)，C35′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCGTTTTT-CAGGGTCTGC-3′(SEQ ID NO10)，C45′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC AGCTGGTAAAGC-TGGCTG-3′(SEQ IDNO11)，C55′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCATGTTGGAGAGAGGGC-AT-3′(SEQ ID NO12)，C65′-CGTGTATA CAGCTGTGCGGCCGCAGAACCTTGTAAATCCTC-3′(SEQ ID NO13)，C75′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGCGCTGTAGTAGGCTGCATC-3′(SEQ IDNO14)。CBP的N-端切除构造用以下反向引物生成5′-GTATACAGCTGTGCGGCCGCCAAACCCTCCACAAACTTTTC-3′(SEQ ID NO15)。CBP-C8(4081-7324)、-C9(4534-7324)、-C10(5074-7324)、-C11(5674-7324)、C12(6282-7324)、-C13(6754-7324)的正向引物为C85′-GATATCTGAGCTCG-TGGATCCGGAAGCTGGGGAGGTTTTT-3′(SEQ ID NO16)，C95′-GATATCTGAGCTCGTGGAT-CCGAAGAAGATGCTGGACAAG-3′(SEQ ID NO17)，C105′-GATATCTGAGCTCGTGGATCCGTCC AAATGGTCCACTCTG-3′(SEQ ID NO18)，C115′-GATATCTGAGCTCGTGGAT CCGTCTCCTACCTCAGCACCA-3′(SEQ ID NO19)，C125′-GATATCTGAGCTC GTGGATCCGAACATCCTTAA-ATCAAAC-3′(SEQ ID NO20)，C135′-GATATCTGAGCCGTGGATCCGCAGCAGCAACGCATG-CAA-3′(SEQ ID NO21)。使用C-端切除构造的正向引物和N-端切除构造的反向引物，将全长小鼠CBP扩增并克隆到pTriEx-3载体中。通过使用以下经PAGE提纯的正向引物，由全长CBP的PCR生成CBP(Δ1-111+NLS)，所述引物在CBP的NLS序列(划线部分)上游含有BamH I部位5′-ATCTGAGCTCGTGGATCCGGGACCGCCCAACCCCAAACGAGCCAAACTCCAGCCGAACAGTACAAACATGGCCAGCTTA-3′(SEQ ID NO22)，其使用的反向引物是上文所述用于生成CBP N-端切除构造的引物。将插入片段克隆到pTriEx-3质粒的BamH I-Not I部位中。
p300的缺失构造通过PCR从Dr.David Livingston(Harvad，MA)慷慨赠送的人p300质粒(CMVβ-p300-CHA)生成。将PCR产物克隆到pTriEx-3载体的Hind III-Not I部位中。C-端切除的p300构造的正向引物为5′-GACGGTACCGGTTCGAAGCTTA-TGGCCGAGAATGTGGT-G-3′(SEQ ID NO23)。p300-P1(1-334)、p300-P2(1-634)和p300-P3(1-1054)的反向引物如下P15′-CGTGTATACAGCTGTGCGGCCGC-CAAACCTAATC CAGGACT-3′(SEQ ID NO24)，P2CGTG-TATACAGCTGTGCGGCCGCGTTGCCAGCACTTCCCAT-3′(SEQ IDNO25)，P3CGTGTATACA-GCTGTGCGGCCG CGGCCTGTTCCCGGCGCTG-3′(SEQ ID NO26)。
通过将4个串联的TCF4结合部位(CCAACCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCAG-GAATTCGGTTGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGAATGGGGGAAACTAGTCCTTAAG)(SEQID NO27)插入到pGL3质粒(Promega)的SV40启动子上游的XhoI-Kpn I部位中，生成β-联蛋白/TCF报道基因质粒，该SV40启动子驱动下游荧光素酶基因的表达。
所有引物均购自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)。克隆用的限制性内切酶加了下划线，其购自New England Biolabs，Beverly，MA。
细胞培养于37℃下，将人结肠癌细胞系SW480和HCT116以及正常结肠细胞CCD18Co(ATCC，Manassas，VA)在5％CO2的气氛中补充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Gibco-BRL，Baltimore，MD)中生长。
转染将指数生长的SW480和HCT116细胞(105)在24孔平板或100-mm的圆盘中培养，并分别用0.5μgβ-联蛋白/TCF报道基因和浓度渐增的效应物质粒或10μg表达载体转染。将细胞按照说明用FuGENE6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)或Superfect(Qiagen，Valencia，CA)转染。根据NE-PER试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)所述的方法制得核抽提物。
荧光素酶化验使用双荧光素酶化验系统(Promega)按照说明在转染过后16-24小时在20μl细胞溶解产物上进行各组的荧光素酶化验。使用浓度渐增的空白表达载体pTriEx-3进行标准化。
软琼脂化验通过对之前所述方法(Moody等人，“A vasoactive intestinal peptideantagonist inhibits non-small cell lung cancer growth，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.904345-49(1993))进行修改，对SW480细胞进行软琼脂集落形成化验。
向6孔平板(Nalge Nunc International，Roskide，Denmark)的每个孔(35mm)上覆盖1ml含10％胎牛血清的DMEM培养基中的0.8％底层琼脂。固化之后，向每孔中加入1ml含0.4％顶层琼脂、10％胎牛血清、双倍浓度化合物的DMEM培养基和5,000个存活细胞。将培养物于37℃下在5％CO2增湿培养箱中培育。每天检测软琼脂上的集落，培育8天后进行拍照。对直径＞60μm的集落进行计数。
免疫沉淀将细胞用含20mM Hepes pH7.9、100mM NaCl、0.5mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、6mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals)的溶胞缓冲液在冰上溶解30分钟，并通过离心澄清。将全细胞溶解产物在室温下与特定的抗体一起培育，对于CBP-C1，使用获自Santa Cruz Biotechnology，Inc.的A-22抗体；对于p300-P1，使用N-15抗体(Santa CruzBiothchnology，Inc.Santa Cruz，CA)；对于全长内源β-联蛋白，使用预先结合在蛋白A-琼脂糖小珠(Pierce，Rockford，IL)上的单克隆抗体(Transduction Laboratories，Lexington，KY)。将免疫复合体在HB S(100-150mM NaCl，如所指出，10mM Hepes pH7.9、5mM 2-巯基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)中洗涤数次，然后进行蛋白质免疫印迹，见下文。然后用含(20mM Hepes pH7.9、500mM NaCl、和5mM含1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物的2-巯基乙醇)的缓冲液将小珠洗涤7次。
Pull-down化验在室温下，将25-100μM生物素化的化合物2在含50％DMSO和50％蛋白结合缓冲液PBB(20mM Hepes pH7.9、20％甘油、0.5mMEDTA、60mM NaCl、6mM MgCl2、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巯基乙醇、和1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)的缓冲液中与100μl50％的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠浆(Amersham Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)结合过夜。将小珠用PBB洗涤3次，除去未结合的化合物2。将100-200μl含过量表达的质粒的全细胞溶解产物(见免疫沉淀部分)与小珠一起在室温下培养3-4小时，或者在4℃下培养过夜。然后将小珠在PBB缓冲液中洗涤3次，然后对洗脱的蛋白进行SDS-PAGE电泳和蛋白质免疫印迹，见下文。在竞争化验中，如每次实验中所指出，将过量的化合物1与溶解产物在室温下预培养1小时。
ChIP化验SW480细胞的甲醛交联和染色质免疫沉淀化验如之前所述进行(Barley等人，“Acetylation of p53 activates transcription throughrecruitment of coactivators/histone acetyltransferases”，Mol.Cell 81243-54(2001)；E1-Osta等人，“Analysis of chromatin-immunopurifiedMeCP2-associated fragments”，Biochem.Biophys.Res.Commun.289733-37(2001)；Shang等人，“Formation of the androgen receptortranscription Complex”，Mol.Cell 9601-10(2002))。用于c-myc和细胞周期蛋白D1启动子PCR的引物如下c-myc正向引物5′-TGGTAGGCGCGCGTAGTTA-3′(SEQ ID NO28)和反向引物5′-GGGCGGAGATTAGCGAGAG-3′(SEQ ID NO29)。细胞周期蛋白D1正向引物5′-TGCTTAACAACA-GTAACGT-3′(SEQ ID NO30)和反向引物5′-GGGGCTCTTCCTGGGCAGC-3′(SEQ ID NO31)。这些ChIP引物在靠近转录起始部位的启动子区内，设计成TCF4结合结构域下游的大约20至30个碱基对。PCR产物的大小为大约200个碱基对。抗CBP抗体，AC-26，由Dr.David Livingston慷慨赠送。
蛋白质印迹化验将上述免疫复合体在SDS-PAGE上分离，之后将其转移到immobilon-P膜(PVDF)(获自Millipore，Bedford，MA)。将膜用TBST(15mM Tris/HCl，pH7.4、0.9％NaCl和0.05％吐温20)中5％的脱脂奶粉阻断，之后用特定抗体进行印迹。使用获自Qiagen Inc.的抗His抗体进行pTriEx-3中制成的蛋白的检测。使用缀合在辣根过氧化物(Santa Cruz Biotechnology Inc.)上的第二抗体进行检测。使用ECL检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)对免疫印迹进行分析。
免疫荧光使用免疫荧光法研究CBP和β-联蛋白在经化合物1(25μM)或对照物(0.5％DMSO)处理的SW480和HCT116细胞中的定位。对对数期的细胞进行接种，24小时后将细胞用化合物1或对照物处理。处理过后24小时，对细胞进行固定。将盖玻片与分别针对CBP(A-22)(Santa Cruz Biotechnology)和β-联蛋白(Transduction Laboratories)培养的抗体一起培养。涂上缀合在FITC或TRITC(JacksonImmunoResearch，Westgrove，PA)上的第二抗体之后，使用Nikon PCM2000激光扫描共焦显微镜对薄片进行检测。
流式细胞分析(FACS)对于FACS分析，将约5×106出自PNRI处理或载体处理的细胞用70％的冷乙醇固定，并在-20℃下保存至少30分钟。将细胞用1×PBS洗涤一次，在室温下用碘化丙锭(PI)溶液(85μg/ml碘化丙锭、0.1％Nonidet P-40、10mg/ml RNAse)培养30分钟。使用BeckmanCoulter EPICS XL-MCL流式细胞仪对每个样品获取10,000染色细胞，通过Expo32ADC软件(Coulter Corporation，Miami，Florida，33196)测定处于细胞周期不同阶段的细胞的百分比。
蛋白提纯将CBP(1-111)和p300(1-111)表达为具有6X-His标记物的融合蛋白，并使用它们的6X-His标记物从细菌溶解产物中亲和提纯。将转移的细菌沉淀(1L培养物)重新悬浮在5-10ml溶胞缓冲液(20mMHepes pH7.9、150mM NaCl、0.1％Nonidet P-40、5mM 2-巯基乙醇和1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物)中。将细胞通过超声处理溶解。将澄清的溶解产物与500μl Ni-NTA-琼脂糖小珠(Qiagen)在4℃下培养1小时。将结合的蛋白用500μl洗脱缓冲液(20mM Hepes pH7.9和150mM NaCl、1片CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物、5mM 2-巯基乙醇和250mM咪唑)洗脱。将洗脱出的蛋白分成等分试样冷冻。
实时反向转染-PCR分析使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen)进行RNA提取，并根据SYBRGreen PCR Master Mix试剂盒(Perkin Elmer Biosystems，Shelton，CT)提供的方案进行实时RT-PCR。用于细胞周期蛋白D1、轴蛋白2、hnkd、c-myc、c-jun和fra-1扩增的引物为细胞周期蛋白D1正向引物5′-AGATCGAAGC-CCTGCTG-3′(SEQ ID NO32)反向引物5′-AGGGGGAAAGAGCAAAGG-3′(SEQ ID NO33)生成大小约300bp的产物；轴蛋白2正向引物5′-GTGTGAGGTCCAC GGAAA-CT-3′(SEQ IDNO34)和反向引物5′-CTCGGGAAATGAGGTA-GAGA-3′(SEQ IDNO35)；hnkd正向引物5′-CTGGCTGCTGCTACCACCA TTGCGT-3′(SEQ ID NO36)和反向引物5′-CCAGGCCCAAATTGGG ACGT-3′(SEQ ID NO37)；c-myc正向引物5′-GAA-GAAATTCGAGCTGCTGC-3′(SEQ ID NO38)和反向引物5′-CACATACAGTCCTGGATGAT-G-3′(SEQ ID NO39)；c-jun正向引物5′-AGATGCCCGGCGAGACACCG-3′(SEQ ID NO40)和反向引物5′-AGCCCCCGACGGTCTCTTT-3′(SEQ ID NO41)；fra-1正向引物5′-ACC-CCGGCCAGGAG-TCATCCGGGCCC-3′(SEQ ID NO42)和反向引物5′-AGGCGCCTCACAAAGCGAGGAGGG-TT-3′(SEQ ID NO43)。使用β-肌动蛋白进行标准化。β-肌动蛋白的引物为正向引物5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′(SEQ ID NO44)和反向引物5′-CGTCATACTCCTCCTTGCYGATCCACA TCTGC-3′(SEQ ID NO45)。各组引物在95℃下扩增10分钟，进行40个95℃下15秒和60℃下1分钟的循环。
胱天蛋白酶-3活性化验将SW480、HCT116和CCD18Co细胞在处理之前以每孔(96孔平板)105细胞放置24小时。向每孔中加入25μM化合物1或对照物(0.5％DMSO)。处理过后24小时，将细胞溶解，并使用胱天蛋白酶-3/7活性试剂盒(Apo-One同源胱天蛋白酶-3/7化验，#G77905，Promega)测量胱天蛋白酶活性。通过从实验测得的数值减去空白(对照物，无细胞)的单位值得到相对荧光单位(RFU)。
表1显示了对用化合物1(25μ)或对照物(0.5％DMSO)处理4、8或24小时的SW480细胞进行实时反向转录-PCR(RT-PCR)分析的定量结果。在每个时间点，对1μg mRNA进行实时RT-PCR。测量内源细胞周期蛋白D1、c-myc、纤连蛋白、hnkd、轴蛋白2、c-jun和BMP-4相对于β-肌动蛋白的表达水平。通过各组平均值减去相应的获白β-肌动蛋白的平均值，测定Δ阈值周期(Cycle of Threshold，CT)值的量。所有实验均进行两份。
化合物1通过靶向CBP来对抗β-联蛋白/TCF转录由于APC突变，SW480结肠癌细胞表现出β-联蛋白到核的组成性易位，并因此表现出高的基部(basal)β-联蛋白/TCF转录，如通过TOPFLASH报道基因系统所评估(Korinek等人，“Constitutivetranscriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/-coloncarcinoma”，Science 2751784-87(1997))。相关的报道基因用于对二级结构模板小分子库(Ogbu等人，“Highly efficient and versatilesynthesis of libraries of constrained b-stranrd mimetics”，Bioorg.Med.Chem.Lett.82321-26(1998)；Eguchi等人，“Solid-phage synthesis andstructural analysis of Bicyclic β-Turn mimetics incorporating functionalityat the i to i+3positions”，Amer.Chem.Soci.10222031-32(1999))进行β-联蛋白/TCF介导的转录抑制剂的筛选。对于最初的筛选，我们选择IC50为5μM(图1B)的化合物1(图1A)，并且其相对于许多其它的包括NFAT(图1C)、CRE和AP-1(数据未显示)在内的依赖CBP的报道基因具有极好的选择性。化合物1在β-联蛋白磷酸化位点有缺陷、但是表达野生型APC的HCT116细胞中表现出类似活性(数据未显示)。
为了确定化合物1的分子靶底，我们对其进行衍生化以用作亲和试剂，得到化合物2(图1A)。用化合物1或载体进行预处理之后，从SW480细胞中制备核抽提物，然后与化合物2一起培养。然后将复合体在链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠上进行分离，并进行凝胶电泳。SW480细胞的核抽提物在化合物2亲和柱上保留的主要条带表观分子量为225KDa，并通过免疫印迹法鉴别为CREB结合蛋白(CBP)(图1D)。化合物1特异性地洗脱结合到化合物2的CBP(图1D，比较条带7与8)，而且在亲和力色谱之前将核抽提物与化合物1(20μM)一起预培养阻断了CBP的结合(图1D，条带9)。所用的抗体对CBP是特异性的，不会与p300交叉反应。因此，这些数据表明化合物1结合CBP。
进一步进行一系列研究以进一步确认化合物1结合CBP。通过在合成中加入14C-标记的酪氨酸，合成化合物1的14C-标记型。将未经β-联蛋白或CBP表达载体转染或者经其转染的SW480细胞的核溶解产物，用14C-标记化合物1、以及DMSO或冷化合物1一起处理过夜。然后使用G-25柱对细胞溶解产物进行脱盐处理，除去未结合的14C-标记化合物1，并测量放射性的结合。如图1E所示，与对照物相比(图1E，比较条带2与6)，用CBP转染的核溶解产物结合的14C-标记化合物增加了大约4-6倍，其以依赖剂量的方式被冷化合物1竞争掉(图1E，比较条带6与7&8)。
基于这一证据，推断出化合物1结合CBP。因此，本发明一方面提供一种方法，其包括将含CBP的组合物与试剂混合，其中该试剂结合CBP。对CBP的结合干扰了CBP另外可能发生的任何其它结合反应。因此，本发明提供通过与CBP结合处理受试者的方法，其包括用有效量的试剂为对其有需要的受试者给药。
化合物1特异性地与CBP的前111个氨基酸相互作用使用生物素化的类似物化合物2(图1A)描绘CBP与化合物1结合所必需的最小区。将含过量表达的CBP片段(图2B，上图)的细胞溶解产物与预先与化合物2结合的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠一起培养数小时。然后从小珠上洗脱结合的蛋白，对其进行凝胶电泳并使用抗His抗体进行免疫印迹，以检测结合的CBP片段。如图所示(图2B，下图)，与化合物2特异性结合的最小区是CBP的NH2-端氨基酸1-111(比较条带2、3和4与其它条带)。如共免疫沉淀实验所预计，检测不到与SW480细胞中过量表达的任何p300片段的结合(数据未显示，见下文)。当在SW480细胞中过量表达CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)连同p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)时(图2C，下图)，过量的化合物1强烈竞争掉CBP片段的结合(图2C，上图，比较条带4-6与7-9)，但是对p300片断的结合没有任何影响(图2C，比较条带10-12与13-15)。因此，可以看出化合物1结合CBP的前111个氨基酸而不是相关蛋白p300。
为了排除CBP与化合物1之间由其它细胞组分介导的直接联合的可能性，并对直接结合进行测验，我们使用6X-His标记大肠杆菌(E.coli)表达的蛋白(图2D，右)对CBP(1-111)和p300(1-111)进行亲和力提纯。使用结合在链霉抗生物素蛋白-琼脂糖小珠上的化合物2，我们阐明了CBP(1-111)而不是p300(1-111)对化合物2的特异性结合，其可以被过量的化合物1竞争掉(图2D，右，比较条带3-5和6-8)。该数据证实了CBP(1-111)与化合物1之间在体外的直接结合。由于化合物1与大肠杆菌中表达的CBP结合，这便降低了CBP为结合化合物1需要被哺乳动物激酶磷酸化的可能性。
利用构造物CBP(Δ1-111+NLS)进一步证实了CBP氨端所发挥的关键作用。尽管全长CBP的表达以依赖剂量的方式恢复了化合物1(25μM)对β-联蛋白/TCF启动子活性的抑制，CBP(Δ1-111+NLS)的表达则没有影响(图2E)。
因此，本发明一方面提供调节β-联蛋白诱发的基因表达的方法，该方法包括使组合物与试剂接触，其中该组合物包含β-联蛋白、CBP和p300，并且试剂以有效降低β-联蛋白与CBP的结合而对β-联蛋白与p300的结合影响极小或没有影响的量与组合物接触。
化合物1与β-联蛋白竞争CBPCBP是许多转录进程中的限速因素。如图3A所示，浓度渐增的CBP而非β-联蛋白的转染，以依赖剂量的方式提高化合物1(12.5μM)的IC50。进行SW480细胞中的免疫沉淀化验，以确定化合物1破坏β-联蛋白与CBP的结合。β-联蛋白与CBP的免疫沉淀被化合物1以依赖浓度的方式抑制(图3B，比较条带2、3和4，条带1是对照物，未加抗体)。化合物1与CBP的结合是非常特异性的，因为尽管CBP与p300高度同源，该化合物并未干扰β-联蛋白与p300的结合(图3B，下图，比较条带2-4)。
为了进一步确认上述的β-联蛋白/CBP相互作用，用上述的CBP和p300缺失构造(图2A)对SW480细胞进行转染。随后洗涤小珠之后，CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)保持特异性结合在免疫沉淀的β-联蛋白上(图3C，比较条带2-4与5-15)。这些结合研究强调CBP与p300的NH2-端的前111个氨基酸均与β-联蛋白结合。为了确认这一区域与化合物1的CBP结合部位重叠，我们在存在过量化合物1的情况下评估CBP(1-111)、CBP(1-211)和CBP(1-351)以及p300(1-111)、p300(1-211)和p300(1-351)与β-联蛋白的结合。图3D的下图显示这些片段在SW480细胞中的表达水平是可比的。暴露于过量的化合物1大大地竞争去结合在β-联蛋白上的片段，而对结合在β-联蛋白上的p300片段则没有影响(图3D，上图，比较条带4-9与10-15)。从显示的数据可以看出，化合物1特异性地结合在区分两种高度同源的辅激活物CBP与p300的CBP氨基端(1-111氨基酸)上，并且竞争掉β-联蛋白与CBP的相互作用。
这些结合研究突出了作为与β-联蛋白相互作用的最小区的CBP和p300前111个氨基酸。对这些区域的序列排比显示出与之前发表的发现于TCF、APC和E-钙黏着蛋白中的β-联蛋白结合基序的惊人相似性(图3E和3F)。序列排比数据强烈显示CBP像其它β-联蛋白相互作用蛋白那样，包埋了β-联蛋白结合所需的带负电氨基酸的保守序列端。
化合物1降低核β-联蛋白检测β-联蛋白和CBP的亚细胞分布，以确定其定位是否受化合物1的影响。SW480细胞中的大多数内源β-联蛋白在核内发现为CBP(图4A)。用化合物1处理导致β-联蛋白易位至SW480细胞中其中内源E-钙黏着蛋白的表达受限的胞质(图4A，比较上图的对照物与下图的经处理的细胞)(de Vries等人，“In vivo and in vitro invasion in relation tophenotypic characteristics of human colorectal carcinoma cells”，Br.JCancer 71271-77(1995))。用核转运抑制剂细霉素B的处理消除了化合物1诱导的β-联蛋白的胞质转运，这表明图4A中观察到的β-联蛋白的核输出是由于化合物1对β-联蛋白/CBP复合体的破坏(数据未显示)。因此，我们推断破坏β-联蛋白与CBP的结合导致β-联蛋白的核水平降低。通过蛋白质免疫印记分析观察了化合物1诱导的β-联蛋白从SW480细胞的核易位至胞质(图4B)。
通过β-联蛋白靶基因调节分化并利用辅激活物细胞周期蛋白D1基因在许多不同肿瘤类型中不适当地表达，已知它是Wnt/β-联蛋白途径的直接靶底(Shtutman等人，“The cyclin D1gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965522-27(1999)；Tetsu等人，“Beta-catenin regulates expressionofcyclin D1in colon caminoma cells”，Nature 398422-26(1999))。为了测定化合物1对这一β-联蛋白/TCF途径的直接靶底的表达的影响，在处理过后4、8和24小时的时间点，对提取自经化合物1(25μM)或对照物处理的细胞的mRNA进行实时反向转录-PCR(RT-PCR)(表1)。表1显示了对用化合物1(25μ)或对照物(0.5％DMSO)处理4、8或24小时的SW480细胞进行定量实时反向转录-PCR(RT-PCR)分析的结果。在每个时间点，对1μg mRNA进行实时RT-PCR。测量内源细胞周期蛋白D1、c-myc、纤连蛋白、hnkd、轴蛋白2、c-jun和BMP-4相对于β-肌动蛋白的表达水平。通过将各组平均值减去获自β-肌动蛋白的相应平均值，测定Δ阈值周期(CT)的量。所有实验均进行两份。
表1实时RT-PCR

使用β-肌动蛋白基因对数据进行标准化。通过将各组平均值减去获自β-肌动蛋白基因的相应平均值测定Δ阈值周期(CT)值。细胞中mRNA的量越低，相应的ACT值越高。如表1所总结，与对照细胞相比，经化合物1处理的细胞中观察到细胞周期蛋白D1信息的ΔCT值以依赖于时间的方式增加。另外还评估了细胞中的细胞周期蛋白D1的蛋白水平。对经处理的SW480细胞的全细胞溶解产物进行凝胶电泳和蛋白质免疫印迹分析。如图5A所示，用化合物1(25μM)处理时，细胞周期蛋白D1的水平有明显的降低，处理过后4小时开始降低，处理后24小时增加(比较条带1与2、3与4、以及5与6)。
此外，选择先前已经在文献中报道为β-联蛋白/TCF转录的直接靶底的基因亚型，进行实时RT PCR分析。在这些型当中，轴蛋白2和人类裸表皮(human naked cuticle，hnkd)的信息水平(Yan等人，“Elevatedexpression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in human colon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))如预计那样被减量调节(表1)。但是，对于几种β-联蛋白/TCF调节的基因来说，信息水平则显著增加，例如c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))、c-jun和fra-1(表1)(Mann等人，“Target genes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factorsignaling in human colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))。因此，化合物1仅仅抑制β-联蛋白靶基因亚型的表达。
化合物1抑制细胞周期蛋白D1而不抑制c-myc(二种已知的β-联蛋白信号传导的靶基因)的表达这一结果，结合化合物1对CBP而不是p300的特异性，说明p300被c-myc启动子选择性利用可以使它避免被化合物1阻抑。为了评价内源c-myc启动子上的辅激活物的使用，对经化合物1(25μM)或对照物(0.5％DMSO)处理的SW480细胞进行染色质免疫沉淀(ChIP)化验。如图5B所示，c-myc启动子在经对照物处理的细胞中被辅激活物CBP和p300占有，大多数被CBP占有。用化合物1处理则完全并且选择性地阻断CBP与c-myc启动子的联合，并伴随着p300联合水平的增加。与c-myc启动子相似，用化合物1处理完全并且选择性地阻断CBP与细胞周期蛋白D1启动子的联合(图5B，下图)。与之形成鲜明的对比，p300不能够代替CBP结合细胞周期蛋白D1基因的启动子。这一结果与实时RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析获得的数据相一致(表1和图5A)。因此，化合物1选择性地降低CBP而不是p300与β-联蛋白调节的启动子的亚型的结合。
为了进一步研究化合物1的选择性，使用Clontech Atlas HumanCancer1.2Array(#7851-1)进行cDNA微点阵分析。数据表明化合物1对总体基因转录具有良好的选择性效应(表2-5)。用25μM化合物1处理8小时之后的SW480细胞，分析得到～2％的基因被增量调节大于2倍，而～0.3％的基因被减量调节大于50％(表2-3)。
表2SW480细胞中通过用25μM化合物1处理8小时增量调节的基因


表3SW480细胞中通过用25μM化合物1处理8小时减量调节的基因

表4SW480细胞中通过用25μM化合物1处理24小时增量调节的基因


表5SW480细胞中通过用25μM化合物1处理24小时减量调节的基因

化合物1导致G1/S阶段停滞并激活胱天蛋白酶活性已经显示对细胞周期蛋白D1基因表达的抑制导致细胞周期G1/S阶段的停滞(Shintani等人，“Infrequent altemations of RB pathway(Pb-p16INK4A-cyclin D1)in adenoid cystic carcinoma of salivaryglands”，Anticancer Res.202169-75(2000))。将HCT116(图6A，上图)和SW480(图6A，下图)细胞用化合物1(25μM)(图6A，右)或对照物(0.5％DMSO)(图6A，左)处理24小时。随后将细胞用碘化丙锭(PI)染色，并通过FACS细胞荧光测定法分析DNA含量。如预期的那样，对照细胞(图6A，左)经历正常的细胞周期，而经化合物1处理的细胞(图6A，右)在细胞周期G1/S阶段显示出积聚增加。因此，可以看出化合物1导致G1阶段细胞的停滞。
胱天蛋白酶是通常在指定的细胞群体中通过凋亡刺激触发而激活的半胱氨酸蛋白酶。为了评价SW480、HCT116和野生型结肠细胞(CCD18Co细胞)中的凋亡诱导，将细胞用化合物1(25μM)或对照物(0.5％DMSO)处理24小时，然后进行胱天蛋白酶-3/7活性化验。如图6B所示，与CCD18Co细胞相比，化合物1在SW480和HCT116细胞中特异性地显著激活胱天蛋白酶-3/7途径。
化合物1降低转化的结肠直肠细胞的增殖使用经化合物1(0.25-5μM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)处理的SW480细胞进行软琼脂集落形成化验。如图7A所示，化合物1在集落形成的数目上显示出依赖剂量的降低。化合物1和5-FU的IC50值分别为0.87±0.11μM和1.98±0.17μM。因此，化合物1增加胱天蛋白酶活性，并降低通过激活β-联蛋白信号传导的突变而转化的结肠直肠细胞的体外生长。
化合物4和化合物5在Min小鼠模型中降低肿瘤生长化合物4、化合物5或运载体在野生型和Min小鼠中给药。化合物4同样是化合物1的类似物(图1A)。各种处理之后测量这些小鼠的小肠和结肠中息肉形成的数目(表6)。数据显示当以大约300mpk给药时，与仅用运载体处理的对照小鼠相比，化合物4和化合物5均降低min小鼠中的息肉数目。
表6化合物4和化合物5对Min小鼠模型中息肉数目的影响


化合物3的细胞毒性使用不同来源的癌细胞测量化合物3(化合物1的类似物，图1A)和其它抗癌治疗剂的细胞毒性。结果显示浓度低于或类似于其它抗癌治疗剂(即顺氯氨铂、5-FU、ADR(阿霉素))的浓度时，化合物3导致癌细胞死亡(表7)。
表7细胞毒性

表7中的数值单位为μg/ml。
化合物3在大鼠和人体内的代谢通过将该化合物与大鼠或人肝脏微粒体一起培养5分钟至1小时，通过HPLC分出经处理的微粒体提取物，并对分出的部分进行MS分析，分析化合物3的代谢。结果如图10A和10B所示。两种体系中均观察到几种代谢产物(如M1、M2、M3)。
化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率研究在小鼠和大鼠体内研究化合物3、化合物4和化合物5的生物利用率。这些化合物的结构如图1A所示。使用相同的运载体(即20％吐温80)将所有化合物给药(静脉内和口服，10mg/kg)。化合物3、4和5在小鼠体内的生物利用率分别为低于2％、低于2％和几乎为0％。化合物3在大鼠体内的生物利用率为大约24％。
讨论大量有力的证据表明对β-联蛋白途径的误调节与癌症的发生和发展有关(Morin，PJ.，“Beta-catenin signaling and cancer”，Bioessays 211021-30(1999)；Moon等人，“The promise and perils of Wnt signalingthrough beta-catenin”，Science 2961644-46(2002)；Oving等人，“Molecular causes of colon cancer”，Eur.J.Clin.Invest.32448-57(2002))。在本文中，我们说明了结构式(I)的化合物抑制β-联蛋白/TCF转录亚型这一发现。利用二级结构模板化合物库筛选SW480结肠癌细胞中的报道基因，对这些低分子量抑制剂的生物活性进行表征，所述结肠癌细胞在APC基因中具有导致β-联蛋白/TCF转录组成性提高的突变。利用生物素化类似物(化合物2)的亲和力色谱，使人们将辅激活物蛋白CBP鉴别为化合物1的分子靶底。
已经显示CBP而不是β-联蛋白的转染显著增加14C-标记的化合物1与SW480核溶解产物的结合。为了确认CBP为化合物1的分子靶底，已经显示CBP表达载体的转染能够超控β-联蛋白/TCF报道基因构造被化合物1抑制。而且，化合物1在不干扰β-联蛋白与紧密相关的辅激活物p300的相互作用的情况下，选择性地阻断β-联蛋白与CBP的相互作用。而且，化合物1导致SW480细胞中β-联蛋白从核到胞质的重新分布。最后，化合物1介导的对细胞周期蛋白D1表达的抑制，导致G1/S细胞周期停滞，延长处理导致SW480(或HCT116)细胞中而不是正常结肠细胞中胱天蛋白酶的激活，导致转移的结肠癌细胞系的凋亡。因此，化合物1是β-联蛋白途径的抑制剂，CBP是它的分子靶底。
为了进一步研究化合物1的选择性，使用Clontech Atlas HumanCancer 1.2Array(#7851-1)进行cDNA微点阵分析。数据表明化合物1对总体基因转录具有良好的选择性效应(表2-5)。用25μM化合物1对SW480细胞处理8小时之后，分析得到～2％的基因被增量调节大于2倍，而～0.3％的基因被减量调节大于50％(表2-3)。
依赖启动子的辅激活物选择性地增加β-联蛋白/TCF途径的复杂性。如预期的那样，化合物1抑制细胞周期蛋白D1、hnkd和轴蛋白2基因的表达(Yan等人，“Elevated expression of axin2 and hnkd mRNAprovides evidence that Wnt/beta-catenin signaling is activated in humancolon tumors”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814973-78(2001))。与之相反，c-myc(He等人，“Identification of c-MYC as a target of the APCpathway”，Science 2811509-12(1998))和c-jun(Mann等人，“Targetgenes of beta-catenin-T cell-factor/lymphoid-enhancer-factor signaling inhuman colorectal carcinomas”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961603-08(1999))的表达由于分化辅激活物在β-联蛋白/TCF途径中的应用而得以增加(表1和图7B)。利用ChIP化验，表明化合物1选择性地抑制CBP与内源c-myc和细胞周期蛋白D1启动子的联合，而且在处理过的细胞中，对于c-myc启动子而不是细胞周期蛋白D1启动子，启动子被p300占有得以增加。这一结果与β-联蛋白co-IP实验和细胞周期蛋白D1的实时RT-PCR中得到的数据非常一致。选择性抑制β-联蛋白/CBP相互作用的化合物1、和对β-联蛋白/p300有选择性的相关类似物(Kahn等人，未发表数据)，提供新型化学基因组工具，以提出β-联蛋白/TCF复合体以依赖启动子并具有辅激活物特异性的方式激活基因转录的机制(图7B)。
关于在β-联蛋白与辅激活物蛋白CBP和p300之间相互作用的特异性接触部位的文献中存在显著的差异。这一点可能涉及CBP和p300与β-联蛋白到多种靶蛋白之间混杂的、通常低到中度的结合亲和力。我们预计我们可以使用化合物1对CBP的结合特异性来澄清这一局面。化合物1与CBP片段的结合研究导致发现了CBPNH2-端处的最小相互作用区(氨基酸1-111)。而且，化合物1不结合p300中的同源序列。化合物1在不干扰p300(1-111)/β-联蛋白相互作用的情况下，选择性地阻断细胞中CBP(1-111)与β-联蛋白的相互作用。该区域的序列排比显示出与先前发表的发现于TCF、APC和E-钙黏着蛋白中的β-联蛋白结合基序的惊人相似性(图5A)(Huber等人，“The structure ofthe beta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverseligand recognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。CBP(1-111)和p300(1-111)二者均含有对与β-联蛋白的相互作用至关重要的带负电荷的扣状体(DELIXXXXE)(Graham等人，“Tcf4 canspecifically recognize beta-catenin using alternative conformations，”Nat.Struct.Biol.81048-52(2001))。发现于APC和E-钙黏着蛋白中的SXSSXS基序(其中X是具有非极性脂肪族R基团的氨基酸)同样存在于CBP、SASSP(氨基酸89-93)中，但是未见于p300中。尽管SW480细胞中化合物1与CBP(1-111)和p300(1-111)的不同结合可以主要归因于磷酸化不同，使用已知的GSK-3β(Nikoulina等人，“Inhibitionof glycogen synthase kinase 3 imporves insulin action and glucosemetabolism in human skeletal muscle”，Diabetes 512190-98(2002))或PKC(Bollag等人，“Effects of the selective protein kinase C inhibitor，Ro31-7549，on the proliferation of cultured mouse epidermal keratinocytes”，J.Invest.Dermatol.100240-46(1993))抑制剂对化合物1的结合没有明显的效果(数据未显示)。而且，大肠杆菌中表达的纯化重组CBP(1-111)能够与化合物1结合，进一步反驳了依赖辅激活物的磷酸化是区分因素这一观点。因此，使用化合物1作为工具，我们具体将CBP与β-联蛋白相互作用的最小区定位于CBP的前111个氨基酸。
对我们的定位研究的进一步支持源白CBP上存在视黄酸(RA)受体RXR/RAR的结合位点，其与CBP上的β-联蛋白结合基序非常接近(图3F)。之前，已经显示RA处理抑制β-联蛋白/TCF信号传导(Earswaran等人，“Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF andretionoid signaling pathways”，Curr.Biol.91415-18(1999))。共有区(LXXLL)(SEQ ID NO46)RXR/RAR结合部位(LSELL)位于氨基酸残基70-74，其在我们提出的CBP和p300上的β-联蛋白结合位点以内(Minucci等人，“Retinoid receptors in health and diseaseco-regulators and the chromatin connection.Semin”，Cell Dev.Biol.10215-25(1999))。
化合物1也使我们可以解决β-联蛋白信号传到途径依赖于启动子的辅激活物选择性问题。化合物1处理并不抑制p300与β-联蛋白的相互作用(图3D)，实际上它增加了β-联蛋白/p300复合体在处理过的细胞中的形成(图3B)。如序列排比中所示，尽管定位出的β-联蛋白结合基序相似，这两种辅激活物之间存在的差异能够解释观察到的化合物1对CBP而不是p300的特异性。基于这些研究，看起来β-联蛋白/TCF转录的激活需要CBP/p300的N-端111个氨基酸与β-联蛋白之间的相互作用。
尽管对于β-联蛋白/TCF转录的选择性小分子抑制剂有着强烈的兴趣，据我们所知，化合物1代表着对这一途径的直接小分子抑制剂的第一个例子。尽管对β-联蛋白和TCF之间的相互作用进行了精细的结构研究(Graham等人，“Crystal structure of a beta-catenin/Tcfcomplex”，Cell 103885-96(2000)；Graham等人，“Tcf4 can specificallyrecognize beta-catenin using alternative conformations”，Nat.Struct.Biol.81048-52(2001)；Poy等人，“Structure of a human Tcf4-beta-catenincomplex”，Nat.Struct.Biol.81053-57(2001))，抑制这一途径的吸引人的先验模式，由于TCF以外(如APC和E-钙黏着蛋白)同样结合在β-联蛋白中央臂重复单元(central Arm repeat)上的不同配对物，关于特异性抑制剂开发的兴趣增加(Huber等人，“The structure of thebeta-catenin/E-cadherin complex and the molecular basis of diverse ligandrecognition by beta-catenin”，Cell 105391-402(2001))。化合物1精致选择性，通过相对于高度同源的辅激活物p300(其在氨基酸水平上与CBP享有多达96％的一致性)而对β-联蛋白/CBP相互作用的特异性抑制，为研究β-联蛋白/TCF介导的转录提供了独特的化学基因组工具。化合物1的特异性、其在转移的而不是正常的结肠细胞中选择性地激活凋亡的胱天蛋白酶的能力、以及其在软琼脂集落形成化验中的效力，对于其在结肠癌中的潜在治疗应用来说均为非常有希望的迹象。而且，化合物1的类似物已经在鼠癌症模型中显示出体内效力且毒性有限(注射有SW480细胞的裸小鼠和Min小鼠模型；Moser等人，“ApcMina mouse model for intestinal and mammary tumorigenesis”，Eur.J.Cancer A1061-64(1995)；Kahn等人，未发表数据)，进一步确认了使用β-联蛋白/TCF/CBP转录的选择性抑制剂，从而潜在地应用于癌症的化学治疗及其它过度增殖性疾病。
在此结合上文中所有本说明书引用的和/或申请数据页中所列的美国专利、美国专利申请公开物、美国专利申请、他国专利、他国专利公开物和非专利出版物的全部内容作为参考。
从上文中应当理解到，尽管本文为了阐述起见描述了本发明具体的实施方式，但可以在不偏离本发明主旨和范围的前体下进行各种修改。因此，除所附权利要求外，本发明不受限制。
序列表<110>(株)中外制药M.卡恩吴世雄金大训河钟烈<120>β-联蛋白/TCF激活转录的调节<130>200146.404PC<140>PCT<141>2004-08-27<150>60/498,451<151>2003-08-28<160>55<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>330<212>DNA<213>智人<400>1tgaggaatca acagccgcca tcttgtcgcg gacccgaccg gggcttcgag cgcgatctac 60tcggccccgc cggtcccggg ccccacaacc gcccgcgctc gctcctctcc ctcgcagccg 120gcagggcccc cgacccccgt ccgggccctc gccggcccgg ccgcccgtgc ccggggctgt 180tttcgcgagc aggtgaaaat ggctgagaac ttgctggacg gaccgcccaa ccccaaaaga 240gccaaactca gctcgcccgg tttctcggcg aatgacagca cagattttgg atcattgttt 300gacttggaaa atgatcttcc tgatgagctg 330<210>2<211>111<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys1 5 10 15Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Ser Thr Asp Phe Gly Ser20 25 30Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly35 40 45Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala50 55 60Ser Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser65 70 75 80Ser Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln85 90 95Gln Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser Ala Asn100 105 110
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<210>6<211>330<212>DNA<213>小家鼠<400>6atggccgaga acttgctgga cggaccgccc aaccccaaac gagccaaact cagctcgccc 60ggcttctccg cgaatgacaa cacagatttt ggatcattgt ttgacttgga aaatgacctt 120cctgatgagc tgatccccaa tggagaatta agccttttaa acagtgggaa ccttgttcca 180gatgctgcgt ccaaacataa acaactgtca gagcttctta gaggaggcag cggctctagc 240atcaacccag ggataggcaa tgtgagtgcc agcagccctg tgcaacaggg ccttggtggc 300caggctcagg ggcagccgaa cagtacaaac 330<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的正向引物<400>7gatatctgag ctcgtggatc cgatggccga gaacttgctg40<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>8cgtgtataca gctgtgcggc cgcgtttgta ctgttcggct g 41<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>9cgtgtataca gctgtgcggc cgctccattc atgacttgag c 41<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>10cgtgtataca gctgtgcggc cgcgcgtttt tcagggtctg c 41<210>11<211>41
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>11cgtgtataca gctgtgcggc cgcagctggt aaagctggct g 41<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>12cgtgtataca gctgtgcggc cgcatgttgg agagagggca t 41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>13cgtgtataca gctgtgcggc cgcagaacct tgtaaatcct c 41<210>14<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于克隆CBP的C-端切除构造的反向引物<400>14cgtgtataca gctgtgcggc cgcgctgtag taggctgcat c 41<210>15<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于产生CBP的N-端切除构造的反向引物<400>15gtatacagct gtgcgcgccgc caaaccctcc acaaactttt c41<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C8的正向引物<400>16gatatctgag ctcgtggatc cggaagctgg ggaggttttt 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C9的正向引物<400>17gatatctgag ctcgtggatc cgaagaagat gctggacaag 40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C10的正向引物<400>18gatatctgag ctcgtggatc cgtccaaatg gtccactctg 40<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C11的正向引物<400>19gatatctgag ctcgtggatc cgtctcctac ctcagcacca 40<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C12的正向引物<400>20gatatctgag ctcgtggatc cgaacatcct taaatcaaac 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP-C13的正向引物<400>21gatatctgag ctcgtggatc cgcagcagca acgcatgcaa 40
<210>22<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于产生CBP的正向引物<400>22atctgagctc gtggatccgg gaccgcccaa ccccaaacga gccaaactcc agccgaacag60tacaaacatg gccagctta 79<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300构造的正向引物<400>23gacggtaccg gttcgaagct tatggccgag aatgtggtg 39<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300构造的反向引物<400>24cgtgtataca gctgtgcggc cgccaaacct aatccaggac t41<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300构造的反向引物<400>25cgtgtataca gctgtgcggc cgcgttgcca gcacttccca t41<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-端切除的p-300构造的反向引物<400>26cgtgtataca gctgtgcggc cgcggcctgt tcccggcgct g41<210>27<211>102
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于产生β-联蛋白/TCF报道质粒的四个串联TCF4结合位点<400>27ccaacctttg atcttacccc ctttgatctt accccctttg atcaggaatt cggttggaaa 60ctagaatggg ggaaactaga atgggggaaa ctagtcctta ag 102<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于c-myc启动子PCR的正向引物<400>28tggtaggcgc gcgtagtta 19<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于c-myc启动子PCR的反向引物<400>29gggcggagat tagcgagag 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于细胞周期蛋白D1启动子PCR的正向引物<400>30tgcttaacaa cagtaacgt 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于细胞周期蛋白D1启动子PCR的反向引物<400>31ggggctcttc ctgggcagc19<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>细胞周期蛋白D1正向引物<400>32agatcgaagc cctgctg 17<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>细胞周期蛋白D1反向引物<400>33agggggaaag agcaaagg18<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>轴蛋白2正向引物<400>34gtgtgaggtc cacggaaact 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>轴蛋白2反向引物<400>35ctcgggaaat gaggtagaga 20<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hnkd正向引物<400>36ctggctgctg ctaccaccat tgcgt25<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hnkd反向引物
<400>37ccaggcccaa attgggacgt 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc正向引物<400>38gaagaaattc gagctgctgc 20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc反向引物<400>39cacatacagt cctggatgat g21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-jun正向引物<400>40agatgcccgg cgagacaccg 20<210>41<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-jun反向引物<400>41agcccccgac ggtctcttt 19<210>42<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fra-1正向引物<400>42accccggcca ggagtcatcc gggccc 26
<210>43<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>fra-1反向引物<400>43aggcgcctca caaagcgagg agggtt 26<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌动蛋白正向引物<400>44atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 32<210>45<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌动蛋白反向引物<400>45cgtcatactc ctccttgcyg atccacatct gc 32<210>46<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>一致RXR/RAR结合位点<221>变量<222>2，3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>46Leu Xaa Xaa Leu Leu1 5<210>47<211>15<212>PRT<213>智人<400>47Asn Asp Glu Leu Ile Arg Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu1 5 10 15
<210>48<211>21<212>PRT<213>智人<400>48Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Ala Alal 5 10 15Ser Leu Ser Ser Leu20<210>49<211>20<212>PRT<213>智人<400>49Ala Asp Thr Leu Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Ser Cys Ser Ser Serl 5 10 15Leu Ser Ala Leu20<210>50<211>15<212>PRT<213>智人<400>50Leu Asp Thr Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Asp Glu Gln1 5 10 15<210>51<211>16<212>PRT<213>智人<400>51Glu Asp Thr Pro Ile Cys Phe Ser Arg Cys Ser Ser Leu Ser Ser Leu1 5 10 15<210>52<211>15<212>PRT<213>智人<400>52Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg1 5 10 15<210>53<211>24<212>PRT<213>智人
<400>53Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser1 5 10 15Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>54<211>23<212>PRT<213>小家鼠<400>54Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly Glu Leu Ser Leu Leu Asn Ser Ser1 5 10 15Gly Ser Ser Ala Ser Ser Pro20<210>55<211>23<212>PRT<213>智人<400>55Pro Asp Glu Leu Ile Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Ser Ser1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gln20
权利要求
1.一种调节β-联蛋白诱发的靶基因表达的方法，所述方法包括使组合物与试剂接触，其中所述的组合物包含β-联蛋白、CBP和p300，所述的β-联蛋白具有结合到CBP与p300的可能性，而且将所述试剂以有效改变β-联蛋白结合到CBP与p300的可能性的量与所述组合物接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的试剂增加CBP与β-联蛋白的结合。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的试剂降低p300与β-联蛋白的结合。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的试剂增加p300与β-联蛋白的结合。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的试剂降低CBP与β-联蛋白的结合。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物是先体外后体内。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的组合物包含干细胞。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物是细胞或哺乳动物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的哺乳动物罹患癌症，并且所述的量对于治疗癌症有效。
10.根据权利要求9的方法，其中所述的癌症是结肠癌。
11.根据权利要求9的方法，其中所述的癌症选自前列腺癌和乳腺癌。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物是细胞，所述的试剂增加细胞分化而不是增殖的可能性。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物是细胞，所述的试剂增加细胞增殖而不是分化的可能性。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的试剂具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
15.根据权利要求14的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9独立地选自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、苄基、取代苄基(其中苄基上的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、萘基、取代萘基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、双苯基甲基、取代双苯基甲基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基独立地选自一个或多个氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基独立地选自一个或多个氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、卤素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羟基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羟基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基环己基C0-2烷基。
16.根据权利要求14的方法，其中A为-(CHR3)-，B为-(C＝O)-，D为-(CHR5)-，E为-(C＝O)-，G为-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(II) 其中，R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如权利要求1中所定义。
17.根据权利要求14的方法，其中A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(C＝O)-(XR9)-，并且化合物具有如下通式(III) 其中，R1、R2、R4、R6、R9、W和X如权利要求1中所定义，Z为氮或CH(当Z为CH时，X为氮)。
18.根据权利要求14的化合物，其中A为-(C＝O)-，B为-(CHR4)-，D为-(C＝O)-，E为-(ZR6)-，G为-(XR7)n-，并且化合物具有如下通式(IV) 其中，R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如权利要求1中所定义，Z为氮或CH，附带条件为当Z为氮时，n为0，当Z为CH时，X为氮并且n不是0。
19.根据权利要求18的方法，其中所述的化合物具有如下通式(VI) 其中，Ra为具有8至11个环成员的二环芳基，其可以具有1至3个选自氮、氧或硫的杂原子，Rb为5至7元单环芳基，其可以具有1至2个选自氮、氧或硫的杂原子，而且化合物中的芳环可以具有一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基。
20.根据权利要求19的方法，其中Ra为萘基、喹啉基或异喹啉基，Rb为苯基、吡啶基或哌啶基，所有这些基团均可被一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基所取代。
21.根据权利要求20的方法，其中Ra为萘基，Rb为苯基，其可被一个或多个选自卤素、羟基、氰基、低级烷基和低级烷氧基的取代基所取代。
22.根据权利要求14的方法，其中所述的试剂是化合物1。
23.一种组合物，其包含试剂、β-联蛋白、CBP和p300，其中β-联蛋白具有结合到CBP与p300的可能性，而且所述试剂以有效改变β-联蛋白结合到CBP与p300的可能性的量存在于所述组合物中。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述的试剂增加CBP与β-联蛋白的结合。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述的试剂降低p300与β-联蛋白的结合。
26.根据权利要求23的组合物，其中所述的试剂增加p300与β-联蛋白的结合。
27.根据权利要求26的组合物，其中所述的试剂降低CBP与β-联蛋白的结合。
28.根据权利要求23的组合物，其处于先体外后体内的状态下。
29.根据权利要求28的组合物，其进一步包含干细胞。
30.根据权利要求29的组合物，其中所述的试剂增加细胞分化而不是增殖的可能性。
31.根据权利要求29的组合物，其中所述的试剂增加细胞增殖而不是分化的可能性。
32.根据权利要求23的组合物，其中所述的试剂具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
33.根据权利要求32的化合物，其中所述的试剂是化合物1。
34.一种调节Wnt途径活性的方法，所述的方法包括(a)使(i)含有Wnt途径组分的组合物与(ii)激活Wnt途径的化合物相接触，以提供激活的Wnt途径；以及(b)用完全或基本上干扰p300与β-联蛋白之间结合但是极少或者不干扰CBP与β-联蛋白之间结合的化学试剂调节Wnt途径的活性。
35.根据权利要求34的方法，其中所述的组合物是细胞。
36.根据权利要求34的方法，其先体外后体内进行。
37.根据权利要求34的方法，其中所述的化合物是LiCl或GSK3抑制剂。
38.根据权利要求34的方法，其中所述的化学试剂具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
39.一种调节细胞增殖的方法，所述的方法包括(a)在一定比例的群体增殖且一定比例的群体分化的条件下提供细胞群体；以及(b)向所述的群体中加入化学试剂，其中所述的试剂导致增殖细胞的比例相对于分化细胞的比例增加。
40.根据权利要求39的方法，其中所述的化合物干扰p300与β-联蛋白之间的结合。
41.根据权利要求39的方法，其进一步包括向所述群体中加入激活Wnt途径的试剂。
42.根据权利要求39的方法，其中所述的细胞群体是干细胞群体。
43.根据权利要求39的方法，其先体外后体内进行。
44.根据权利要求39的方法，其进一步包括加入导致细胞群体分化的试剂。
45.根据权利要求44的方法，其中群体中的细胞分化形成血细胞。
46.根据权利要求44的方法，其中群体中的细胞分化形成神经元细胞、肌肉细胞、骨细胞、或胰β-细胞。
47.根据权利要求44的方法，其中所述的化学试剂具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
48.一种相对于β-联蛋白/p300相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/CBP相互作用的方法，所述方法包括向组合物中加入化合物，其中所述的组合物包括β-联蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相对于β-联蛋白/p300相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/CBP相互作用。
49.根据权利要求48的方法，其中所述的化合物具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的剩余部分、及其立体异构体。
50.一种相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用的方法，所述方法包括向组合物中加入化合物，其中所述的组合物包括β-联蛋白、CBP和p300，并且所述化合物相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用。
51.根据权利要求50的方法，其中所述的化合物具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
52.一种促进β-联蛋白从核易位至胞液的方法，所述方法包括向细胞中加入化合物，其中所述的细胞包括核和胞液，所述的核含有β-联蛋白，并且所述化合物导致β-联蛋白从核易位至胞液。
53.根据权利要求52的方法，其中所述的化合物具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝O或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
54.一种选择性地抑制WNT/β-联蛋白途径靶向基因的表达的方法，所述方法包括向组合物中加入化合物，所述的组合物含有WNT/β-联蛋白途径靶向的基因，所述化合物导致WNT/β-联蛋白途径靶向基因的表达的变化。
55.根据权利要求54的方法，其中所述的化合物具有选自结构式(I)的结构 其中A为-(CHR3)-或-(C＝O)-，B为-(CHR4)-或-(C＝O)-，D为-(CHR5)-或-(C＝O)-，E为-(ZR6)-或-(C＝O)-，G为-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-、或-(C＝O)-，W为-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y为氧或硫，X和Z独立地为氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，其各自独立地选自氨基酸侧链部分、氨基酸侧链部分的衍生物、或者分子的残余部分、及其立体异构体。
56.一种将干细胞保持在未分化状态下的方法，所述方法包括使干细胞与抑制细胞分化或促进细胞增殖的试剂相接触，所述试剂的量对于将干细胞保持在未分化状态下是有效的。
57.根据权利要求56的方法，其中所述的试剂相对于β-联蛋白/CBP相互作用而选择性地抑制β-联蛋白/p300相互作用。
58.一种鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含CBP 1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制含步骤(b)的β-联蛋白的部分与含步骤(a)的CBP 1-111的部分相结合；以及(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含CBP 1-111的所述部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
59.根据权利要求58的方法，其进一步包括如下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分与β-联蛋白的结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
60.一种鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含CBP 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制含步骤(b)的CBP 1-111的部分与含步骤(a)的β-联蛋白的部分相结合；(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含β-联蛋白的所述部分与含CBP 1-111的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
61.根据权利要求60的方法，其进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
62.一种鉴别β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含有(1)与CBP 1-111相结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使CBP 1-110从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与CBP 1-111的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白CBP相互作用的抑制剂。
63.根据权利要求62的方法，其进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白CBP相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含p300 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制含p3001-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(d)的所述小分子并不抑制含p300 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白CBP相互作用的选择性抑制剂。
64.一种鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白CBP小分子抑制剂与含p300 1-111的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含β-联蛋白的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含β-联蛋白的部分与步骤(a)的含p300 1-111的部分相结合；以及(d)当确定所述步骤(a)的小分子抑制含p300 1-111的所述部分与含β-联蛋白的部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
65.根据权利要求64的方法，其进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
66.一种鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含β-联蛋白的部分相接触；(b)使步骤(a)的混合物与含p300 1-111的部分相接触；(c)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否抑制步骤(b)的含p300 1-111的部分与步骤(a)的含β-联蛋白的部分相结合；(d)当确定步骤(a)的所述小分子抑制含β-联蛋白的所述部分与含p300 1-111部分相结合时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
67.根据权利要求66的方法，其进一步包括以下步骤(e)使步骤(d)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(f)通过化验手段确定步骤(e)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(g)当确定步骤(e)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
68.一种鉴别β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤(a)使假定的β-联蛋白p300小分子抑制剂与含有(1)与p3001-111结合的β-联蛋白的部分相接触；(b)通过化验手段确定步骤(a)的所述分子是否使p300 1-111从β-联蛋白上分离；以及(c)当确定步骤(a)的所述小分子使β-联蛋白与p300 1-111的结合分离时，将步骤(a)的小分子鉴别为β-联蛋白p300相互作用的抑制剂。
69-根据权利要求68的方法，其进一步包括以下步骤(d)使步骤(c)鉴别的β-联蛋白p300相互作用的小分子抑制剂与含有(1)含CBP 1-111的部分和(2)β-联蛋白的混合物相接触；(e)通过化验手段确定步骤(d)的所述分子是否并不抑制含CBP1-111的所述部分与β-联蛋白相结合；以及(f)当确定步骤(c)的所述小分子并不抑制含CBP 1-111的所述部分与所述β-联蛋白相结合时，确认所述的小分子是β-联蛋白p300相互作用的选择性抑制剂。
70.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO1或者与SEQ ID NO1的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长CBP蛋白。
71.根据权利要求70的核酸分子，其包含与SEQ ID NO1的同源性至少为90％的核苷酸序列。
72.根据权利要求70的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
73.根据权利要求70的核酸分子，其编码含有CBP蛋白内存在的不多于200个连续氨基酸残基的肽。
74.根据权利要求70的核酸分子，其编码含有CBP蛋白内存在的不多于150个连续氨基酸残基的肽。
75.根据权利要求74的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
76.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长CBP蛋白。
77.根据权利要求76的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核酸。
78.根据权利要求76的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
79.根据权利要求76的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
80.一种基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽，附带条件为所述的肽不是全长CBP蛋白。
81.根据权利要求80的肽，其与SEQ ID NO2的同源性至少为90％。
82.根据权利要求80的肽，其结合β-联蛋白。
83.根据权利要求80的肽，其含有CBP蛋白内存在的不多于200个连续氨基酸残基。
84.根据权利要求80的肽，其含有CBP蛋白内存在的不多于150个连续氨基酸残基。
85.根据权利要求84的肽，其含有SEQ ID NO2或4。
86.一种基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是全长CBP蛋白。
87.根据权利要求86的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
88.根据权利要求86的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
89.根据权利要求86的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
90.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1或者与SEQ ID NO1的同源性至少为80％的序列组成，附带条件为所述的序列不编码全长CBP蛋白。
91.根据权利要求90的核酸分子，其与SEQ ID NO1的同源性至少为90％。
92.根据权利要求90的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
93.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其基本由SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
94.根据权利要求93的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核苷酸。
95.根据权利要求93的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
96.根据权利要求93的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
97.一种基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2的同源性至少为80％的肽组成。
98.根据权利要求97的肽，其与SEQ ID NO2的同源性至少为90％。
99.根据权利要求97的肽，其结合β-联蛋白。
100.一种基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
101.根据权利要求100的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
102.根据权利要求100的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
103.根据权利要求100的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
104.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其由SEQ ID NO1或者与SEQ ID NO1的同源性至少为80％的序列组成。
105.根据权利要求104的核酸分子，其与SEQ ID NO1的同源性至少为90％。
106.根据权利要求104的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
107.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其由SEQ ID NO1的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
108.根据权利要求107的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核苷酸。
109.根据权利要求107的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
110.根据权利要求107的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
111.一种基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO2或者与SEQID NO2的同源性至少为80％的肽组成。
112.根据权利要求111的肽，其与SEQ ID NO2的同源性至少为90％。
113.根据权利要求111的肽，其结合β-联蛋白。
114.一种基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO2的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
115.根据权利要求114的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
116.根据权利要求114的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
117.根据权利要求114的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
118.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长p300蛋白。
119.根据权利要求118的核酸分子，其与SEQ ID NO3的同源性至少为90％。
120.根据权利要求118的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
121.根据权利要求118的核酸分子，其编码含有p300蛋白内存在的不多于200个连续氨基酸残基的肽。
122.根据权利要求118的核酸分子，其编码含有p300蛋白内存在的不多于150个连续氨基酸残基的肽。
123.根据权利要求122的核酸分子，其中所述的肽含有SEQ IDNO4。
124.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其含有SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的序列不编码全长p300蛋白。
125.根据权利要求124的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核酸。
126.根据权利要求124的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
127.根据权利要求124的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
128.一种基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO4的同源性至少为80％的肽，附带条件为所述的肽不是全长p300蛋白。
129.根据权利要求128的肽，其与SEQ ID NO4的同源性至少为90％。
130.根据权利要求128的肽，其结合β-联蛋白。
131.根据权利要求128的肽，其含有p300蛋白内存在的不多于200个连续氨基酸残基。
132.根据权利要求128的肽，其含有p300蛋白内存在的不多于150个连续氨基酸残基。
133.根据权利要求132的肽，其含有SEQ ID NO4。
134.一种基本上提纯和分离的肽，其含有SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列，附带条件为所述的肽不是全长p300蛋白。
135.根据权利要求134的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
136.根据权利要求134的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
137.根据权利要求134的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
138.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列组成。
139.根据权利要求138的核酸分子，其与SEQ ID NO3的同源性至少为90％。
140.根据权利要求138的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
141.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其基本由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
142.根据权利要求141的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核苷酸。
143.根据权利要求141的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
144.根据权利要求141的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
145.一种基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4或者与SEQ ID NO4的同源性至少为80％的肽组成。
146.根据权利要求145的肽，其与SEQ ID NO4的同源性至少为90％。
147.根据权利要求145的肽，其结合β-联蛋白。
148.一种基本上提纯和分离的肽，其基本由SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
149.根据权利要求148的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
150.根据权利要求148的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
151.根据权利要求148的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
152.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其由SEQ ID NO3或者与SEQ ID NO3的同源性至少为80％的序列组成。
153.根据权利要求152的核酸分子，其与SEQ ID NO3的同源性至少为90％。
154.根据权利要求152的核酸分子，其编码结合β-联蛋白的肽。
155.一种基本上提纯和分离的核酸分子，其由SEQ ID NO3的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
156.根据权利要求155的核酸分子，其中所述的片段具有90-300个核苷酸。
157.根据权利要求155的核酸分子，其与所述片段的同源性至少为90％。
158.根据权利要求155的核酸分子，其中所述的片段编码结合β-联蛋白的肽。
159.一种基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO4或者与SEQID NO4的同源性至少为80％的肽组成。
160.根据权利要求159的肽，其与SEQ ID NO4的同源性至少为90％。
161.根据权利要求159的肽，其结合β-联蛋白。
162.一种基本上提纯和分离的肽，其由SEQ ID NO4的片段或者与所述片段的同源性至少为80％的序列组成。
163.根据权利要求162的肽，其中所述的片段具有30-100个氨基酸。
164.根据权利要求162的肽，其与所述片段的同源性至少为90％。
165.根据权利要求162的肽，其中所述的肽结合β-联蛋白。
全文摘要
本发明提供调节由β－联蛋白/TCF激活的转录的化合物和方法，例如，选择性抑制Wnt/β－联蛋白途径靶向的基因。
文档编号C12N5/08GK1871239SQ200480030688
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月27日 优先权日2003年8月28日
发明者M·卡恩, 吴世雄, 金大训, 河钟烈, K·霍贾特－埃马米 申请人:(株)中外制药