专利名称：c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及AP-I家族蛋白C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用。
背景技术：
AP-I家族是一类细胞响应外界信号包括生长因子、细胞因子和胞外压力的转录激活蛋白。结构上由不同的亚基组成同源或异源二聚体。这些亚基包括Jun、Fos和ATF。每个亚基上均有一个亮氨酸拉链结构，两两形成与DNA结合的锌指模块。ES细胞及胚胎干细胞是一中在囊胚的内细胞团中分离出的具有体外无限增殖、自我更新和多向分化的特性的细胞。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机 体几乎所有的细胞类型。鉴于ES细胞的体外无限增殖和多分化潜能，其在再生医学领域具有广阔的应用前景。胚胎干细胞的自我更新和多能性的维持受到一系列核因子和胞外信号分子的调控。在体外培养条件下，干细胞的很难维持其多能性状态，而倾向于自发地分化(即，获得特化的结构或功能)。干细胞分化是由于许多因素，包括生长因子、细胞外基质的分子和成分、环境应激源等造成。胚胎干细胞的体外增殖和多能性的维持依赖于饲养层细胞和白血病抑制因子(LIF)的加入。在无饲养层细胞或LIF的状态下，胚胎干细胞在血清中培养将会逐步走向分化。胚胎干细胞的体外增殖和自我更新机制一直是干细胞生物学研究的热点，其具体的分子生物学机制有待进一步的阐明。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用，可不依赖于LIF而维持胚胎干细胞的多能性和自我更新。本发明的技术方案为提供一种c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用，所述c-Jun的截短型为AP-I家族蛋白c-Jun的C端缺失和N端缺失,所述c-Jun的C端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的第I位氨基酸到256位氨基酸的截短或其对应的核酸序列，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。优选的，上述c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。本发明的另一技术方案为提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，a、将含有供体c-Jun蛋白氨基酸序列的170位氨基酸到334位氨基酸或第I位氨基酸到256位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上，并注入胚胎干细胞；b、将步骤a所得胚胎干细胞在无LIF的胚胎干细胞培养基中培养。优选的，上述使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。
优选的，上述使用C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞培养基为含血清的小鼠mES培养基。优选的，上述使用C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法中所述胚胎干细胞培养基为不含血清的小鼠mKSR培养基。本发明涉及培养ES细胞的方法，所述方法涉及在无饲养层细胞和LIF的条件下培养胚胎干细胞，提供了胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。c-Jun截短型对胚胎干细胞的维持的意义主要是可以在体外无饲养层细胞和LIF的条件下维持干细胞的多能性，有利于胚胎干细胞的体外培养。另外一个更加重要的意义在于胚胎干细胞多能性维持机制上的解释。AP-I家族蛋白与胚胎干细胞的关系，之前还没有发现过，对了解干细胞多能性的维持具有十分重要的意义。
图I是小鼠c-Jun蛋白全长和不同截短型的结构图。根据NCBI上小鼠c-Jun的蛋白序列全长和结构域信息，设计不同的引物，采用常规分子克隆的方法，克隆出图示中不同氨基酸的序列的多妝片段用于实验。其中1-334多妝片段命名为c-Jun-FL ； 1-256多妝片段命名为c-Jun(-bZIP)，170-334片段命名为c-Jun_DN。将克隆的片段用合适的限制性内切酶克隆到逆转录病毒载体PMXS上，进行目的片段的表达；图2是在OKS三因子重编程模型下，c-Jun蛋白全长或不同截短型与空载相比的重编程效率比较图。以OKS和空载病毒感染0G2胚胎成纤维细胞为对照，分别用OKS及所示c-Jun基因全长或不同截短型病毒感染0G2胚胎成纤维细胞。感染后在含血清的mES培养基中进行诱导培养，在合适的天数在荧光显微镜下计算GFP阳性的荧光克隆数。将各片段得到的重编程克隆数除以空载状态下的重编程克隆数，得到全长或各截短片段对重编程效率的影响；图3是胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-Jun表达含量比较图。采用常规分子生物学方法分别提取胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的总RNA，将2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中c-jun基因的表达量；图4是胚胎干细胞向拟胚体分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞按照常规方法向拟胚体进行分化，分别收取不同天数的分化培养物提取总RNAJf 2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较向拟胚体分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化；图5是胚胎干细胞在分化过程中c-jun表达量变化图。将胚胎干细胞在撤去白细胞抑制因子(LIF)的条件下培养，细胞将逐步分化。收取不同天数的培养物提取总RNAJf2ug总RNA反转为cDNA后采用荧光定量PCR进行检测。比较分化不同天数过程中c-jun基因的表达量变化；图6是c-Jun、c-Jun(-bZIP)和C-JunDN对干细胞分化影响效果图。分别构建c-Jun.c-Jun(-bZIP)和C-JunDN稳定表达干细胞株，并在胚胎干细胞的培养条件下进行连续传代培养。观察干细胞增殖和分化状态。图中可见c-Jun全长(C-JunFL)可引起胚胎干细胞分化；图7是c-Jun (-bZIP)和C-JunDN对干细胞多能性维持效果图。分别构建c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的稳定表达干细胞株，在撤去LIF后的胚胎干细胞培养基中培养。观察观察干细胞的多能性状态，并用AP染色检测多能性分子标记物碱性磷酸酶的活性。c-Jun (-bZIP)和C-JunDN的过表达均会在没有LIF的状态下维持干细胞的多能性，延迟分化。图中黑色为碱性磷酸酶染色。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook, Fritsch 和 Maniatis 等人编著！CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBI0L0GY(F.M. Ausubel 等人编著(1987));丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press,Inc.) PCR 2 A PRACTICAL APPROACH (1995)，M. J. MacPherson，B. D. Hames 和 G. R. Taylor等人编著，ANTIBODIES(1988) ,Harlow和Lane等人编著，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (1987)，R. I. Freshney 等人编著；HANDBOOK OF STEM CELLS，卷 2，ff. FrenchAnderson等人编著。除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。本文所述的“胚胎干细胞”是这样的细胞。其来源于小鼠囊胚内细胞团分离培养而来，可在体外无限增殖、自我更新并具有多项分化潜能，和分化成三个胚层的任何一种细胞类型。具有特异的分子标记物，可以形成畸胎瘤，注射到3. 5天囊胚再置于代孕母鼠子宫类可形成嵌合鼠。本文中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3. 5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞
O本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠，最优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞。将本发明所述基因片段的cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)。本发明中细胞的培养方法是常规的细胞培养方法及条件，包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，各种细胞类型的培养方法以及培养条件，可参见ff. French Anderson 等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷 2。
本文所述c-Jun全长的氨基酸序列(SEQ ID NO 1) :(1-334)I mtakmettfy ddalnasfIq sesgaygysn pkilkqsmtl nladpvgslk phlraknsdl61 ltspdvgllk laspelerli iqssnghitt tptptqfIcp knvtdeqegf aegfvralae1211hsqntlpsv tsaaqpvsga gmvapavasv agagggggys aslhseppvy anlsnfnpga1811ssgggapsy gaaglafpsq pqqqqqppqp phhlpqqipv qhprlqalke epqtvpempg24letppIspidm esqerikaer krmrnriaas kcrkrkleri arleekvktl kaqnselast30lanmlreqvaq lkqkvmnhvn sgcqlmltqq Iqtf 本文所述c-JunDN 截短型(170-334)序列(SEQ ID NO :2)yanlsnfnpgalssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempgetpplspidmesqerikaerkrmrnriaaskcrkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkqkvmnhvnsgcqlmltqqlqtf本文所述c-Jun-Bzip (1-256)序列(SEQ ID NO :3):I mtakmettfy ddalnasfIq sesgaygysn pkilkqsmtl nladpvgslk phlraknsdl61 ltspdvgllk laspelerli iqssnghitt tptptqfIcp knvtdeqegf aegfvralae12Ilhsqntlpsvtsaaqpvsgagmvapavasvagagggggysaslhseppvyanlsnfnpga18Ilssgggapsygaaglafpsqpqqqqqppqpphhlpqqipvqhprlqalkeepqtvpempg24letpplspidmesqeri本文所述c-Jun全长的cDNA序列(SEQ ID NO :4):ATGACTGCAAAGATGGAAACGACCTTCTACGACGATGCCCTCAACGCCTCGTTCCTCCAGTCCGAGAGCGGTGCCTACGGCTACAGTAACCCTAAGATCCTAAAACAGAGCATGACCTTGAACCTGGCCGACCCGGTGGGCAGTCTGAAGCCGCACCTCCGCGCCAAGAACTCGGACCTTCTCACGTCGCCCGACGTCGGGCTGCTCAAGCTGGCGTCGCCGGAGCTGGAGCGCCTGATCATCCAGTCCAGCAATGGGCACATCACCACTACACCGACCCCCACCCAGTTCTTGTGCCCCAAGAACGTGACCGACGAGCAGGAGGGCTTCGCCGAGGGCTTCGTGCGCGCCCTGGCTGAACTGCATAGCCAGAACACGCTTCCCAGTGTCACCTCCGCGGCACAGCCGGTCAGCGGGGCGGGCATGGTGGCTCCCGCGGTGGCCTCAGTAGCAGGCGCTGGCGGCGGTGGTGGCTACAGCGCCAGCCTGCACAGTGAGCCTCCGGTCTACGCCAACCTCAGCAACTTCAACCCGGGTGCGCTGAGCAGCGGCGGTGGGGCGCCCTCCTATGGCGCGGCCGGGCTGGCCTTTCCCTCGCAGCCGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCTCAGCCGCCGCACCACTTGCCCCAACAGATCCCGGTGCAGCACCCGCGGCTGCAAGCCCTGAAGGAAGAGCCGCAGACCGTGCCGGAGATGCCGGGAGAGACGCCGCCCCTGTCCCCTATCGACATGGAGTCTCAGGAGCGGATCAAGGCAGAGAGGAAGCGCATGAGGAACCGCATTGCCGCCTCCAAGTGCCGGAAAAGGAAGCTGGAGCGGATCGCTCGGCTAGAGGAAAAAGTGAAAACCTTGAAAGCGCAAAACTCCGAGCTGGCATCCACGGCCAACATGCTCAGGGAACAGGTGGCACAGCTTAAGCAGAAAGTCATGAACCACGTTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACGCAGCAGTTGCAAACGTTTTGA实验例I :c_Jun及其不同的缺失型的构建采用常规分子克隆方法分别将含有c-jun蛋白全长(324个氨基酸)，及1_256，75-324，170-334，254-334，274-334，170-334等6种不同氨基酸片段的核酸序列克隆到PMXs逆转录病毒表达载体上。最终克隆片段如图I所示。将小鼠成纤维细胞消化后，以每孔2万细胞种植到12孔板内，分别用OKS或OKSM
及实施例I中构建的表达载体进行感染。感染后用常用的重编程培养基进行培养，每天更换培养基，并在合适的天数在荧光显微镜下计算荧光克隆数。
如图2所示，与空载相比，C-Jun蛋白全长，1-256片段，75_324片段均对OKS诱导重编程有抑制作用，其中C-Jun蛋白全长抑制最为显著。而170-334，250-334片段则对OKS诱导的重编程具有明显的促进作用，其中170—334促进作用尤其显著。170-282和274-334片段对OKS诱导的重编程有影响但不明显。在接下来的实施例中，c-Jun的1-256多肽片段命名为c-Jun (-bZIP)，我们将c-Jun全长命名为c-Jun FL,将c-JUN 170-334片段命名为 c-jun-DN。实施例2c-Jun全长可以诱导干细胞分化,而c_Jun (-bZIP)，c-JunDN可以维持干细胞的多能性。ES细胞来源于植入前的胚胎并保留了发育为完整个体的发育潜能，其能够在体外和体内产生所有三个胚层的细胞和组织类型。ES细胞在体外不同的信号刺激下会向不同的细胞类型进行分化，这些分化信号主要由胞外环境和生长因子提供。小鼠ES细胞最初分离并培养在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞上。饲养层细胞的重要功能之一是为干细胞提供细胞因子一白血病抑制因子(LIF)。·LIF缺失的成纤维细胞在支持自我更新上是有缺陷的且LIF可取代小鼠ES细胞常规增殖与重新诱导中对饲养细胞的需求。LIF与连接gpl30受体的相关细胞因子提供了在分子水平上维持小鼠ES细胞长期自我更新性的途径，该ES细胞保留了未分化表型、多能性和胚胎增殖能力的基本特性。小鼠的ES细胞可在添加LIF的商品化的血清替代培养基中增殖，但是这仅在中至高细胞密度时有效且从单细胞到集落形成需要血清或伺养层存在。本发明的方法支持了在无饲养细胞和LIF的无血清条件下培养多能干细胞。多能性的机制也可有助于我们对肿瘤发生的理解(多能干细胞可在体内形成肿瘤，而且在“sternness”基因上的分子改变也可导致肿瘤)。此外，有越来越多的证据表明干细胞与肿瘤细胞间的近亲关系正常干细胞与肿瘤细胞自我更新的机制相似；涉及干细胞自我更新的发育信号通路的失控与肿瘤生成有关；肿瘤包括可能源自正常干细胞的"癌症干细胞"。为了研究C-Jun基因在胚胎干细胞多能性维持中的作用，我们研究了该基因在胚胎干细胞和成体细胞及胚胎干细胞分化过程中的表达状况，同时分析了不同的截短型在胚胎干细胞多能性维持和分化的影响。分别将小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)和胚胎干细胞(ES)提取RNA，再用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量。如图3显示，MEF细胞中c-Jun的表达量远高于胚胎干细胞中的表达量。表明c-Jun因子可能不利于多能性的维持。将ES细胞采用标准的方式分化为拟胚体(EB)，在不同的天数收取样品，提取RNA，采用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量。如图4所示，ES细胞向EB分化的过程中c-Jun的表达量不断上调。将ES细胞在没有LIF的血清培养基中培养，在不同天数收取细胞样品，提取RNA。采用RT-PCR的方法分析两种细胞中c-Jun的表达量.结果如图5所示，ES细胞分化过称中，c-Jun的表达量不断上调。分别将c-Jun全长，c-Jun (_bZIP)，c-JunDN转入Rl细胞中，采用抗性筛选能稳定表达目的基因片段的细胞系。本发明所用的Rl细胞来源于129品系小鼠3. 5天囊胚分离出的胚胎干细胞系，为实验室常用的胚胎干细胞系，具有胚胎干细胞的基本特征，可以血清培养条件下，在无饲养层细胞上传代培养。如图6所示，c-jun全长在Rl中过表达，能引起干细胞的分化，而c-Jun (-bZIP), c-JunDN则不会引起干细胞分化。本文所述的Rl细胞来源于129品系小鼠3. 5天囊胚分离出的胚胎干细胞系，为实验室常用的胚胎干细胞系，具有胚胎干细胞的基本特征。
分别构建c-Jun(-bZIP)和C-JunDN的表达载体，通过抗性筛选得到稳定表达c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的Rl干细胞株。将得到的干细胞株在高糖DMEM添加有15%FBS和1000U的白细胞的抑制因子的胚胎干细胞培养基中传代培养。传代稳定后再将细胞消化后以50万/孔种植在六孔板上，并在撤去LIF后的胚胎干细胞培养基(高糖DMEMd^W15%FBS,非必须氨基酸，谷氨酰胺，b-巯基乙醇)中连续培养。观察干细胞的多能性状态.待克隆长大后(约3-4天)用AP染色检测多能性分子标记物碱性磷酸酶的活性。c-Jun (-bZIP)和c-JunDN的过表达均会在没有LIF的状态下维持干细胞的多能性，延迟分化。如图7所示，图7是c-Jun (-bZIP)和c-JunDN对干细胞多能性维持效果图。图7中黑色为碱性磷酸酶染色。上述通过抗性筛选得到稳定表达c-Jun (-bZIP)和C-JunDN的Rl干细胞株在撤去LIF后的常用的胚胎干细胞培养基都可维持干细胞的多能性，具体替换为下述小鼠mES培养基和小鼠mKSR培养基都能在没有LIF的状态下维持胚胎干细胞的多能性，延迟分化。小鼠mES 培养基DMEM (High Glucose, Gibco) +15%FBS (56 °C 热灭活 30分钟，Gibco ) +NEAA (IX, Gibco ) +GlutaMAX (IX, Gibco ) + Sodium pyruvate(IX, Gibco) + penicillin/streptomycin (50untis/ml P,50mg/ml S, Hyclone)+ β -mercaptoethanol(0. ImM,)+LIF (1000units/ml，millipore)。小鼠mKSR 培养基knock-out DMEM (Gibco) +10%KSR+GlutaMAX (IX1Gibco)+NEAA (IX, Gibco) +penicillin/streptomycin (50untis/ml P,50mg/mlS, Hyclone)+ β -mercaptoethanol+LIF (lOOOunits/ml, millipore)。上述结果表明c-Jun基因全长可诱导胚胎干细胞的分化，而c-jun截短型则有利于维持干细胞的多能性。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院<120>C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>333<212>PRT
〈213〉小鼠c-Jun氨基酸序列〈400〉IMet Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045 Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He Ile65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu Hi s Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys245250255Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg260265270Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr275280285Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg
290295300Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser305310315320Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe325330 <210>2<211>165<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(170-334)位氨基酸序列<400>2Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly151015Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro202530Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln354045He Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln505560Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp65707580Met Glu Ser Gln Glu Arg He Lys Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn859095Arg He Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg He Ala100105110Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu115120125Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln130135140Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys Gln Leu Met Leu Thr Gln145150155160Gln Leu Gln Thr Phe165<210>3<211>255<212>PRT〈213〉小鼠c-Jun截短型(1-256)位氨基酸序列<400>3Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala151015
Ser Phe Leu Gln Ser Glu Ser Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys202530He Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser354045Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Thr Ser Pro Asp505560Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu He He
65707580Gln Ser Ser Asn Gly His He Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe859095Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly100105110Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser115120125Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Ser Gly Ala Gly Met Val Ala Pro130135140Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Ala145150155160Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn165170175Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala180185190Gly Leu Ala Phe Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln195200205Pro Pro His His Leu Pro Gln Gln He Pro Val Gln His Pro Arg Leu210215220Gln Ala Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu225230235240Thr Pro Pro Leu Ser Pro He Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg He245250255<210>4<211>1005<212>DNA〈213〉人工序列<400>4atgactgcaa agatggaaac gaccttctac gacgatgccc tcaacgcctc gttcctccag60tccgagagcg gtgcctacgg ctacagtaac cctaagatcc taaaacagag catgaccttg120
aacctggccg acccggtggg cagtctgaag ccgcacctcc gcgccaagaa ctcggacctt180ctcacgtcgc ccgacgtcgg gctgctcaag ctggcgtcgc cggagctgga gcgcctgatc240atccagtcca gcaatgggca catcaccact acaccgaccc ccacccagtt cttgtgcccc300aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgagggct tcgtgcgcgc cctggctgaa360ctgcatagcc agaacacgct tcccagtgtc acctccgcgg cacagccggt cagcggggcg420ggcatggtgg ctcccgcggt ggcctcagta gcaggcgctg gcggcggtgg tggctacagc480gccagcctgc acagtgagcc tccggtctac gccaacctca gcaacttcaa cccgggtgcg540ctgagcagcg gcggtggggc gccctcctat ggcgcggccg ggctggcctt tccctcgcag600ccgcagcagc agcagcagcc gcctcagccg ccgcaccact tgccccaaca gatcccggtg660cagcacccgc ggctgcaagc cctgaaggaa gagccgcaga ccgtgccgga gatgccggga720gagacgccgc ccctgtcccc tatcgacatg gagtctcagg agcggatcaa ggcagagagg780aagcgcatga ggaaccgcat tgccgcctcc aagtgccgga aaaggaagct ggagcggatc840gctcggctag aggaaaaagt gaaaaccttg aaagcgcaaa actccgagct ggcatccacg900gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag cttaagcaga aagtcatgaa ccacgttaac960agtgggtgcc aactcatgct aacgcagcag ttgcaaacgt tttga100权利要求
1.C-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用，所述C-Jun的截短型为AP-I家族蛋白c-Jun的C端缺失和N端缺失,所述c-Jun的C端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的第I位氨基酸到256位氨基酸的截短或其对应的核酸序列，所述c-Jun的N端缺失为AP-I家族蛋白c-Jun的170位氨基酸到末端334位氨基酸的截短或其对应的核酸序列。
2.根据权利要求I所述的c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的应用，其特征在于，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。
3.使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，其特征在于， a、将含有供体c-Jun蛋白氨基酸序列的170位氨基酸到334位氨基酸或第I位氨基酸到256位氨基酸对应的核酸序列克隆到表达载体上，并注入胚胎干细胞； b、将步骤a所得胚胎干细胞在无LIF的胚胎干细胞培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，其特征在于，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞。
5.根据权利要求4所述的使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，其特征在于，所述胚胎干细胞培养基为含血清的小鼠mES培养基。
6.根据权利要求4所述的使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法，其特征在于，所述胚胎干细胞培养基为不含血清的小鼠mKSR培养基。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及AP-1家族蛋白c-Jun的截短型在维持胚胎干细胞多能性的方法和应用。本发明的目的是提供一种使用c-Jun的截短型维持胚胎干细胞多能性的方法和应用，可以不依赖于LIF而维持胚胎干细胞的多能性和自我更新，所述c-Jun的截短型为AP-1家族蛋白c-Jun的C端缺失和N端缺失。本发明涉及培养ES细胞的方法，所述方法涉及在无饲养层细胞和LIF的条件下培养胚胎干细胞，提供了胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。
文档编号C12N15/63GK102816739SQ20121032421
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者裴端卿, 刘晶, 韩庆凯, 陈捷凯, 韦备, 彭梅秀 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院