专利名称：无血清胚胎干细胞培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于干细胞培养的培养液，特别涉及到胚胎干细胞培养的培养液，以 及建立新的人胚胎干细胞系并可用于临床疾病治疗水平的胚胎干细胞的培养液。
背景技术：
干细胞是一种具有不断自我更新能力的细胞，这种细胞一方面能够自我更新，另 外也能增生、分裂、分化成其他各种成熟的细胞。干细胞可按不同的标准进行分类。按它们 的来源可分为胚胎干细胞，骨髓干细胞和脐带血干细胞；按它们的增生和分化的能力可分 为全潜能、多潜能和但潜能的干细胞；按它们的所能够分化成的细胞可分为神经干细胞、心 肌干细胞、血液干细胞等；按它们的成熟的程度可分为胚胎干细胞和成熟组织干细胞。胚胎干细胞胚胎干细胞是来源于4-5天的囊胚或早期桑椹胚里内细胞岛的原始 细胞。它们是多潜能的细胞，能产生和分化成外胚层、中胚层和内胚层，所来源的所有的细 胞。胚胎干细胞具有两个特点1)自我更新Gelf-renewal)-经过多次的分裂还能维持为 分化的状态；幻潜能(Potency)-分化成不同的特异功能的细胞的能力，因此在再生医学中 具有重要的地位，是将来的细胞替代治疗的主要的细胞来源，所以它们在科研和疾病的治 疗方面都具有极大的潜能，如目前还难以治愈的神经变性性疾病阿尔海默氏病、帕杰金森 氏病；胰岛功能缺乏的糖尿病；脊髓损伤等。成熟组织干细胞位于成熟的机体或组织内的干细胞具有以下两种特征1)分裂 并产生另一个自我细胞；幻分裂后细胞也可进一步更分化成具有特殊功能的细胞。除了脐 带血外，其它组织内能分化成多种组织的多潜能(pluripotent)的干细胞比较少，大多数 的成熟组织内的干细胞具有组织定向分化(multipotent)的潜能。如骨髓造血干细胞只能 生成血液系统的细胞，骨髓移植能够成功的治疗白血病和其它有关的血液系统的疾病。理论上，胚胎干细胞是再生医学和组织移植的一种可能的细胞来源，为组织损伤 和顽固性疾病的治疗提供了希望，但通过20多年的研究，目前还没有胚胎干细胞疗法得到 FDA的批准而应用于临床治疗。医学研究人员相信，干细胞疗法有治疗人类疾病的巨大潜 能。目前，已有许多干细胞的疗法，特别是用于白血病的骨髓移植。将来，干细胞可能被用 来去治疗不同的疾病包括肿瘤、帕杰金氏病、脊髓损伤和肌肉萎缩等。世界上许多国家都在进行胚胎干细胞的研究，开发干细胞相关的产品，干细胞的 研究和开发是一种需要大量资金和人力的项目，目前在某些国家进行人体胚胎干细胞研究 的经费和原材料以及在伦理方面仍然受到某些限制，特别是建立新的人体胚胎干细胞系所 需要的人的胚胎，美国NIH现在只有6个胚胎干细胞系，这远远不够研究和市场的需要。为 了满足胚胎干细胞研究的市场的需求。就需要建立大量新的人胚胎干细胞系，为从事干细 胞的研究、药物筛选和生物科技公司的需要提供可靠的胚胎干细胞系的来源，特别是干细 胞能够用于临床疾病的治疗，但到目前为止，所以的胚胎干细胞系都是从含胎牛血清的培养液中建立的，还需要小鼠的成纤维母细胞的辅助，所以它们含有动物的蛋白，因此不能用 于人体，所以需要开发一种无血清的干细胞培养液来解决这个问题。本发明人通过创造性的劳动，选择出多种成分，配制成的无血清，而且也不需要小 鼠的成纤维母细胞的干细胞培养液。我们的培养液不但能用于动物的胚胎干细胞的建系， 也能够用于人的胚胎干细胞的培养和新系的建立。更重要的是它能够建立和培养用于临床 疾病治疗的人胚胎干细胞系。为更好地提高我国干细胞的研究水平提供了有利的条件。
发明内容
为了更有效地建立用于临床治疗的人体胚胎干细胞系，预防或治疗人类的多种用 目前的方法还难以治疗的疾病，克服现有的干细胞培养液含有胎牛血清，以及需要小鼠的 成千维母细胞帮助的缺陷。本发明通过发明者的创造性研究，提供了一种不仅能够用于动 物的干细胞培养，建立新的动物胚胎干细胞系的培养液；而且能够用于人的胚胎干细胞的 培养和建系的干细胞培养液。本发明的第一个方面，提供一种干细胞培养液的组成成分，其包含多种现有的基 本的细胞培养液和细胞因子。在本发明的一个实施方案中，所述培养液的各种组分都有特定的含量。在本发明中，利用LIF、bFGF和Wnt3a三种细胞生长因子的联合应用，加上其他的 细胞培养添加成分，并利用适当的组合使其能够充分发挥协同的作用，维持干细胞的不断 地自我更新，增生和去分化。与现有的干细胞培养液相比较，能避免其动物血清和小鼠的成 纤维母细胞的成分，这样的干细胞可以用于再生医学，为广大的病人服务。^X本发明所述术语“干细胞系”是指由囊胚的内细胞岛的细胞所建立的胚胎干细胞； “临床治疗用的干细胞”是指用我们所发明的培养液所建立的新的干细胞系。本发明所述术语“对照组”指含胎牛血清，用小鼠成纤维母细胞培养的干细胞。培养液组份及说明1.用于胚胎干细胞建系和培养的胚胎干细胞培养液，其有效成分包括第一种成分，DMEM/F-12，是人干细胞培养液的其本成分，它又由多种成分组成。第二种成分，Neurobasal medium，是神经细胞常用的培养液。第三种成分，B27 supplement,是一种又多种成分组成的细胞培养添加剂。第四种成分N2 Supplement B,第五种成分BSA fraction V第六种成分LIF (leukemia inf lammentory factor)，是小鼠干细胞培养的一种必 要的生长因子。第七种成分bFGF (β-Fibroblast Growth Factor)是人干细胞培养的一种必要的 生长因子。第八种成分Want3a是一种近年来发现的细胞生长因子，它和许多的信息调控的 通路有关。第九种成分BME ( β -metha)，常用的促进细胞分裂的化学试剂。第十种成分Pen/Str印抗菌素。
第十一中成分人参皂甙提取物。1. DMEM/F12 禾口 Neurobasal MediumDMEM/F12是人干细胞培养液的其本的液体成分；NeurcAasal medium，是神经细胞 常用的培养液。它们又由多种成分组成。具体可Ihvitrogen产品手册。细胞的基础培养液有多种，如DMDM，RPMI, MEM, L-15，DMEM/F12, Neurobasal Medium等，都可用作为细胞培养液的基本成分。本发明优选的DMEM/F12是人干细胞常用的 培养液；而Neurobasal Me dium是神经细胞常用的培养液，它们作为普通的细胞培养液时 都需要加5-10%的胎牛血清。2. B27 supplement 禾口 N2 Supplement B是一种由多种成分组成的细胞培养液的添加剂，具体可Ihvitrogen产品手册。3. LIF、bFGF、Want3a其中LIF是小鼠干细胞在有血清培养条件下的一种必要的生长因子；而bFGF( β-Fibroblast Growth Factor)则是人干细胞有血清培养条件下培养的 一种必要的生长因子；Wnt3a是一种近年来发现的细胞生长因子，它和干细胞的Wnt信息调控的通路有关。4. BSA fraction V, BME5.本发明培养液成分的效用发明人通过研究发现，DMEM/F12和Neurobasal Medium是原代细胞培养的最好的 常用的基本培养液，它们可提供细胞成活的基本要求，为此，发明人设计了它们的结合更加 有利于干细胞的生存的配方。LIF、bFGF和Wnt3a的组合也利用了干细胞的多个信息调控 通路去增强干细胞的自我更新的能力；而其他的添加剂如B27和^supplements都含有多 种有利细胞生长的微量元素；BME则可增强细胞的分裂。我们利用无血清的培养液，比较有 和没有小鼠成千维母细胞群的情况下胚胎干细胞的生长情况。发现在无血清，无成千维母 细胞的培养条件下，胚胎干细胞的分裂、增殖和生长都无区别。取得了令人鼓舞的效果。所 述的组合的无血清的干细胞的培养液的培养效果好于含有血清的普通干细胞培养液。这可 能是由于血清中除了含有促进干细胞自我更新的因子外，也含有一些促进干细胞分化的因 子，因此，无血清无成纤维母细胞的培养液的效果显著优于所选的普通的含血清的培养 液，
图1-2。6.毒性研究本发明提供了检测组成的组合物对于细胞的毒性的评价。我们施用10倍于正常 剂量(指组合物中的剂量)的所述的组合物于受试验的胚胎干细胞，然后观察其干细胞的 增值和分化的情况，和细胞的成活率，各种成分都未显现毒性作用。7.培养液的制备
权利要求
1.用于胚胎干细胞建系和培养的胚胎干细胞培养液，其有效成分包括第一种成分，DMEM/F-12 (Invitrogen #10565-018)是人干细胞培养液的基本成分，它 又由多种成分组成。第二种成分，Neurobasal medium(Invitrogen #12348-0178)，是神经细胞常用的培养液。第三种成分，B27 supplement (Invitrogen #17504-044)，是一种又多种成分组成的细 胞培养添加剂第四种成分 N2 Supplement B(Stemcell Tech #07156), 第五种成分 BSA fraction V(Invitrogen #15260-037V)第六禾中成分 LIF (leukemia inf lammentory factor, Chemicon #Lif 2010),是小鼠干 细胞培养的一种必要的生长因子。第七种成分bFGF( β-Fibroblast Growth Factor)是人干细胞培养的一种必要的生长 因子。第八种成分Want3a是一种近年来发现的细胞生长因子，它和许多的信息调控的通路有关。第九禾中成分 ΒΜΕ(β-mecapto-ethanol，Invitrogen #21985-023) 第十种成分 Pen/Str印，抗菌素 Qnvitrogen #15140-122) 第十种成分中药成分。
2.如权利要求1所述的培养液，其中Neurobasalmedium，是神经细胞常用的培养液， 能促进胚胎干细胞的生长。
3.如权利要求1所述的培养液，其中B27supplement，是一种又多种成分组成的细胞 培养添加剂。
4.如权利要求1所述的培养液，其中N2Supplement BjMemcell Tech购买。
5.如权利要求1所述的培养液，其中第五种成分BSAfractionV，Whvitrogen购买。
6.如权利要求1所述的培养液，其中第六种成分LIF(leukemiainf lammentory factor)，是小鼠干细胞培养的一种必要的生长因子，能够使干细胞不断的分裂、增殖，维持 在原始的状态，见图一，从hvitrogen购买。
7.如权利要求1所述的培养液，其中第七种成分bFGF( β -Fibroblast Growth Factor)是人干细胞培养的一种必要的生长因子，能够使干细胞不断的分裂、增殖，维持在 原始的状态。
8.如权利要求1所述的培养液，去第八种成分Want3a是一种近年来发现的细胞生长因 子，它和许多的信息调控的通路有关。
9.权利要求2，3，4，5，和8中任一权利要求所述培养液的成分在制备用于人和动物的 干细胞和胚胎干细胞培养液中的用途。
10.如权利要求1所述的成分在培养干细胞，特别是胚胎干细胞方面的作用。
全文摘要
无血清胚胎干细胞培养液，本发明提供一种多种成分所组成的适用于多种干细胞的培养液，这种干细胞培养液不含动物血清，不需要小鼠或其他的成纤维母细胞。本发明的培养液可用来建立人和动物的胚胎干细胞系、培养人和动物的干细胞，尤其是可建立和培养用于临床疾病治疗用途的人的胚胎干细胞系。本发明还涉及所述的培养液在制备和保藏尤其是各种生长因子的比例的方法。
文档编号C12N5/0735GK102127520SQ20101002290
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者沈士亮, 沈赞 申请人:上海众申生物科技有限公司