人类子宫颈干细胞群及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于分离干细胞的方法，所述方法包括由子宫颈组织制备细胞悬 浮液，涉及由所述方法分离的干细胞，并且涉及从所述干细胞的培养物获得的条件培养基 (条件培养液，conditioned medium)。本发明还涵盖所述干细胞或条件培养基在用于治疗 或预防癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病慢性病症或感染性疾病，以及用于美容治疗中的应 用。因此，本发明涉及干细胞及其治疗或美容用途的领域。
【背景技术】
[0002] 干细胞的特征在于其自我更新和沿多谱系途径分化的能力。一种特别有前景的类 型的用于治疗应用的成体干细胞是所谓的间充质干细胞（MSC)。MSC，也被定义为多能间充 质基质细胞，是在体外作为塑料贴壁细胞增殖的细胞的异质群体，具有成纤维细胞样形态， 在体外形成集落，并且可以分化成中胚层谱系的细胞，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，以 及其他胚胎谱系的细胞。
[0003] 干细胞被认为存在于微环境（小生境，niche)中，其调节干细胞自我更新和组织 再生之间的平衡。干细胞微环境的概念最初参照哺乳动物造血描述，其中微环境代表了容 纳造血干细胞并保证其继续存在的专门的微环境。已经提出，微环境中的具有其分泌产物 的支持细胞会与干细胞行为相互作用并控制干细胞行为。为了支持干细胞的活性，根据该 模型，微环境内的条件在没有任何外部激活线索的情况下将有利于维持干细胞静止，但会 促进将需要出现的祖细胞的增殖和成熟，并且还将确保干细胞池的自我更新。
[0004] 一些作者已经报道了在来源于胚胎中胚层的软组织中存在多能成体细胞的不同 群。例如，已经报道了多能细胞可以从哺乳动物的骨骼肌和其他结缔组织、从人类脂肪 (lipoaspirated)组织或从骨髓中获得[所谓的多能成体祖细胞（MAPC)]。原则上，所有这 些分离的细胞群可以以与骨髓的MSC相似的方式用于结缔组织的修复和再生。然而，除了 MAPC，到目前为止，这些群均没有在表型水平被充分地表征。因此，尽管已经描述了在不同 的结缔组织中存在多能成体细胞，但是在本领域的当前状态，不可能识别和明确区分从软 组织中获得的不同的多能细胞类型，或者不可能获得基本上纯的群。目前，干细胞的表型特 征包括标记物的确定，尤其是如细胞表面受体；以及在体外培养中它们的分化能力的确定。 每种细胞类型具有表面标记物的某种组合，也就是说，它具有表达的某种分布，其表征了该 特定细胞类型，从而将其与其他区分开。
[0005] 成体干细胞的理想来源是在其中它们可以通过简单的、非侵入性的方法获得的来 源和允许足够数量细胞被分离的来源。特别是，来源应提供干细胞，该干细胞在没有重大风 险和不适的情况下可以容易地从活的受试者分离，并且该来源应该允许高产率以从其他细 胞类型以最小的污染获得，而没有过高的分离和培养的成本。
[0006] 虽然骨髓（BM)已经是用于多能MSC的分离的主要来源，脂肪组织是该细胞的另一 来源，但是BM和脂肪组织的收获是高度侵入性的过程。一个可替换的来源是脐带血，其可 以通过微创程序来获得，而不损害母亲或婴儿。在各种其他人类成体组织（包括胎盘、头皮 组织和肠干细胞）中识别了 MSC的其他来源。从BM、脂肪组织或脐带血液（UCB)分离的所 有细胞表现出典型的MSC特征：成纤维细胞形态、集落形成单位-成纤维细胞（CFU-F)的形 成、多能分化能力和一组典型的表面蛋白的表达。而来自三个来源的MSC表达了经典的MSC 标记蛋白，观察到关于⑶90、⑶105和⑶106的表达的显著差异。因此，MSC依据其来源可 以显示出不同的表型。
[0007] 获得骨髓的过程是痛苦的且产量非常低，通过体外扩增使细胞的数量显著增加是 必要的，以获得临床相关量。这个步骤增加了成本且使得该过程耗费时间，以及增加了材料 的污染和损失的风险。由于这些原因，非常期望能够从除了骨髓的间充质组织中分离多能 细胞。特别是，鉴于它们的手术可及性，方便的是能够从非骨软骨中胚层组织中分离细胞， 如但不限于，皮肤、脂肪和肌肉组织。
[0008] 因此，在现有技术中存在通过非侵入性和无痛收获来提供干细胞的可替代来源的 必要性。在这个意义上，子宫可以是干细胞的来源。然而，子宫是一个被分成不同部分的复 杂器官。具体地，人类子宫是一个纤维肌性器官，其可分为上肌子宫体和延伸到阴道中的下 纤维子宫颈。子宫体分为子宫底和子宫下段（或峡部），其大约在子宫动脉的过程和子宫颈 内口的水平。子宫颈是一个窄的圆柱形通道，在其下端其与阴道连接，且在其上端，子宫颈 变宽以形成子宫下段（峡部）；子宫下段进而加宽至子宫底（图18)。在妇科检查期间可以 从阴道内看见的子宫颈的下端被称为外宫颈。在外宫颈中心的开口（其被称为外口）打开 以允许子宫和阴道之间的通路。宫颈内膜环绕子宫颈内腔，其是通过子宫颈从外口进入子 宫的通道（图19)。宫颈内膜和外宫颈之间的重叠边界被称为转化区。转化区是其中优选 收集本发明的干细胞的区域。
[0009] 著名的加拿大组织学家Arthur Worth Ham，在他的教科书"Histology"（Ham, A. W. and Cormack，D. H. Ham，s Histology, 9th ed. Philadelphia:Lippincott，1987)(由许多 从业者推崇的不可或缺的参考文献）中描述了子宫体和子宫颈的不同的组织层。人类子宫 体由以下三个组织层组成：1)称为子宫内膜的内层是最活跃的层，并响应于循环性卵巢激 素的变化；子宫内膜是高度专门化的并且是月经和生殖功能必不可少的（来源于这个组织 层的子宫内膜干细胞）；2)中间层，或子宫肌层，构成了子宫体积的大部分，且是肌肉层，主 要由平滑肌细胞组成（来源于这个组织层的子宫肌层干细胞）；以及3)子宫的外层，浆膜 或子宫外膜，是一薄层由包住子宫的上皮细胞制成的组织。然而，子宫颈壁和内衬管的膜均 具有与子宫体不同的特性。事实上，子宫颈壁主要由结缔组织构成。子宫颈由被称为黏膜的 内衬组成，其由薄的、平坦的、鳞片状的被称为鳞状细胞的细胞和称为浆膜（光滑覆盖物） 的外衬组成。此外，子宫体的连接子宫颈的部分的壁，称为子宫下段或峡部，主要由平滑肌 构成。因此，组织学并且于是子宫的这两个部分（包括子宫下段的子宫体以及子宫颈）的 功能是不同的。
[0010] 国际申请W02011/042547公开了一种方法，用于从子宫肌层组织（特别地从子宫 颈上方的区域）提供干细胞，称为子宫体，其包括子宫底和子宫下段。而且，作者提到子宫 肌层的外植体（explant)通过脱落而取自子宫体的子宫下段。因为如上所述，子宫下段是 子宫颈的上端和在解剖学和组织学上与子宫颈不同的子宫体的考虑部分。然而，传统地已 知，下部子宫体的壁主要是由子宫肌层组织构成，因为子宫内膜层降低至该水平。尽管如 此，子宫颈的外壁主要由结缔组织构成。因此，不可能通过浅表细胞学取样从子宫颈获得子 宫肌层组织。因此，通过侵入性方法（如活组织检查、子宫肌层组织切片、子宫肌层移植体 或如子宫脱落物）获得生物材料，这需要一个高等级的脱落物以获得子宫肌层。因此，在用 于分离子宫肌层前体之间将子宫内膜、浆膜、脂肪和纤维组织的组织样本进行修整。在国际 申请W02011/042547中描述的干细胞群体表达了表面标记，如⑶31、⑶34和HLA-DR，其是 来自造血谱系的表面标记。相反，间充质干细胞不表达这些造血标记。
[0011] Baege Astrid C 和合作者（Baege Astrid C 等人? Proc Amer Assoc Cancer Res Annual Meeting.Vol 47,2006:938)公开了推定的上皮干细胞的分离，其不同于间充质干 细胞。重要的是注意到，本文公开的细胞群体与在人类乳头瘤病毒诱导的宫颈癌的潜在作 用相关联。
[0012] 此外，Maruyama T 等人（Maruyama T 等人? Reproduction ;2010 ;140:11-22)公开 了在子宫的生理学和病理学中子宫内膜和子宫肌层干细胞/祖细胞的作用，然而，该文献 没有提及到间充质宫颈干细胞。正如上面已经提到的，子宫肌层是子宫体的中间层，它构成 了子宫体积的大部分且是肌层，其主要由平滑肌细胞组成。
[0013]另一方面，Lopez J 等人（L6pez J 等人? Open Virol J. 2012 ;6:232-240)和 Xiaochun S 等人（Xiaochun S 等人.Cell Biol Int. 2011;35:119 - 123)公开了从人类子 宫癌分离和识别的干细胞。这些干细胞的缺点是它们有助于肿瘤的生长。在这个意义上， 已描述了（Ramasamy R等人，Leukemia, 2007)间充质干细胞是癌症干细胞微环境境的组成 部分，从而在支持肿瘤细胞的生长中起到至关重要的作用。因此，从癌症组织分离的干细胞 与从正常组织分离的干细胞相比在肿瘤性能并且确实地在其他性能上显示出差异。
【发明内容】
[0014] 本发明的作者已经发现，子宫颈组织（宫颈组织，子宫宫颈组织，uterine cervix tissue)可以被用作干细胞的来源。从该组织分离的细胞，称为子宫颈干细胞（UCESC)，与 从其他组织分离的间充质干细胞相比显示出了较高的抗炎活性、抗肿瘤能力、抗微生物活 性和生长速度，并且对于至少10个细胞通道能够保持其功能性和稳定的核型（染色体组 型）。此外，干细胞的新来源允许通过非侵入性的和无痛的方法来分离间质干细胞，因为可 以只通过在一个常规的妇科检查期间剥离所述器官来获得所述组织。
[0015] 基于干细胞的这种新来源和从其获得的细胞，本发明的作者已开发了以下发明方 面，其将在下面详细地公开。
[0016] 本发明的方法
[0017] 如上所述，本发明的作者已经发现，子宫颈组织（优选地，非癌子宫颈组织）可以 被用作干细胞的来源。
[0018] 因此，在一个方面，本发明涉及一种用于分离干细胞的方法，在下文中，"本发明的 方法"，包括：
[0019] (a)由子宫颈组织制备细胞悬浮液，
[0020] (b)从所述细胞悬液回收所述细胞，
[0021] (c)在允许细胞增殖的条件下，在合适的细胞培养基中孵育所述细胞，和
[0022] (d)选择干细胞。
[0023] 步骤（a)-(d)可以通过本领域技术人员已知的常规技术进行。干细胞的这种新的 来源的一个附加优点是，它允许从动物体以非侵入性和无痛的方式来获得干细胞。
[0024] 在本发明的上下文中，术语"非侵入性"是指一种过程，其中使用超出了用于妇科 检查的常用工具的工具，皮肤不被破坏且体腔不被探测。在本发明的上下文中，术语"无痛" 是指一种过程，该过程不会引起身体的疼痛。因此，本发明的方法是用于分离干细胞的非侵 入性和无痛的方法，因为所述干细胞所分离的来源是子宫颈。
[0025] 因此，在第一步骤[步骤（a)]中，本发明的方法包括由子宫颈组织制备细胞悬浮 液。
[0026] 术语"子宫颈组织"是指来自子宫颈的组织，即将子宫体和子宫腔与阴道分开的器 官。子宫颈是一个窄的圆柱形通道，在其下端其与阴道连接，且其在其上端，子宫颈变宽以 形成子宫下段（峡部）；子宫下段进而加宽至子宫底（图18)。在妇科检查期间可以从阴道 内可见的子宫颈的下端被称为外宫颈。在外宫颈中心的开口（被称为外口）打开以允许子 宫和阴道之间的通路。宫颈内膜环绕子宫颈内腔，其是通过子宫颈从外口进入子宫的通道 (图19)。宫颈内膜和外宫颈之间的重叠边界被称为转化区。转化区是优选收集本发明的 干细胞的区域。
[0027] 为了从动物体内去除组织，可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法来获得 子宫颈组织，侵入性的（如活组织检查）和非侵入性的方法（如宫颈的脱落）两者。优选 地，在常规的妇科检查期间通过剥落子宫颈来获得子宫颈组织，其假定了获得干细胞的非 侵入性和无痛的方式。子宫颈组织可以从任何合适的哺乳动物获得，例如，牛、羊、猪、狗、 猫、马、灵长类等，优选人类。
[0028] -旦获得了子宫颈组织，优选地，在进行处理以从材料的其余部分分离本发明的 细胞之前洗涤该组织。在一个规程中，子宫颈组织保持在生理上相容的盐水溶液（例如，磷 酸盐缓冲盐水（PBS))中或无血清培养基中。由于子宫颈组织的特殊性质，在一个具体实施 方式中，本发明的方法的步骤（a)包括酶促分解（解聚）子宫颈黏液。能够分解子宫颈黏 液的任何酶（例如，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等）可以用于本发明的方法中。酶处理的量 和持续时间将根据所用的条件变化，但这样的酶的使用在本领域中一般是已知的。可替换 地，或与这种酶处理相结合，子宫颈黏液可以使用其他处理来降解，如机械搅拌、声波能、热 能等。如果通过酶方法来完成降解，则期望中和在合适的时间段的酶，以最小化对细胞的有 害影响。
[0029] 降解步骤通常产生了凝集细胞的浆液或悬浮液和含有一般游离基质细胞的液体 部分（例如，红血细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及干细胞）。该方法中的下一阶段[步骤 (b)]是从所述细胞悬浮液中回收所述细胞，这意味着从其余部分分离凝集细胞。这可以通 过离心来完成，其迫使细胞进入由上清液覆盖的沉淀中。然后可以丢弃上清液并将沉淀悬 浮在生理上相容的流体中。此外，悬浮的细胞通常包括红细胞，并在大多数规程中期望溶解 它们。用于选择性地溶解红细胞的方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何合适的规 程（例如，在高_或低渗培养基中孵育，通过使用氯化铵溶解等）。当然，如果红细胞被溶解， 则剩余的细胞然后应从溶解产物中分离，例如通过过滤、沉淀、离心或密度分离。可以一次 或连续多次地对悬浮的细胞进行洗涤、再次离心和再悬浮，以达到更高的纯度。可替换地， 可以在细胞表面标记分布的基础上或在细胞大小和粒度的基础上分离细胞。
[0030] 在从细胞悬浮液中回收细胞之后，在允许细胞增殖的条件下，在适当的细胞培 养基中培养细胞[步骤（C)]。优选地，在适当的细胞密度和培养条件下使用合适的细胞 培养基，该细胞将在不分化的情况下被培养。因此，在合适的细胞培养基[例如，DMEM、 DMEM-F12、a-MEM、RPMI，通常补充有5-25% (例如20%)的适合的血清，如胎牛血清、胎 小牛血清、新生小牛血清、小牛血清、猪血清、羊血清、马血清、人血清或人血清、因子、氨基 酸等]的存在下在固体表面上在不分化的情况下培养细胞，并在允许细胞增殖的条件下孵 育。培养条件（即，PH、温度等）对于本领域技术人员来说是公知常识。优选地，在固体表 面上和在允许细胞粘附于所述固体表面并增殖的条件下培养细胞。
[0031] 如本文所用的，术语"固体表面"指的是允许本发明的细胞附着的任何材料。例 如，所述材料是塑料材料，如皮氏培养皿或细胞培养瓶，其被处理以促进哺乳动物细胞与其 表面的粘附性，例如商业上可获得的可选地涂覆有明胶、纤维连接蛋白、多聚-D-赖氨酸或 其他试剂的聚苯乙烯板。孵育后，洗涤细胞以便除去非粘附的细胞和细胞片段。
[0032] -旦细胞增殖，在培养中在相同的培养基中和相同的条件下可以维持这些细胞直 至它们达到足够的汇合，通常，约80%的细胞汇合，当必要时更换细胞培养基。在达到期望 的细胞汇合后，细胞可以通过使用分离剂（如胰蛋白酶）的连续传代并在适当的细胞密度 (通常2, 000-10, 000个细胞/cm2)接种到更大的细胞培养表面进行扩充。因此，然后在这 种培养基中在不分化的情况下传代细胞至少两次，同时仍保留它们的发育表型。更优选地， 在不丢失其发育表型的情况下，可以传代所述细胞至少10次（例如，至少15次或甚至至少 20次）。通常，以所需的密度铺板所述细胞，如在约100个细胞/cm 2至约100, 000个细胞/ cm2之间（例如，约500个细胞/cm 2至约50, 000个细胞/cm2,或者，更具体地，约1，000个 细胞/cm2至约20, 000个细胞/cm 2之间）。如果以较低的密度（例如约300个细胞/cm 2) 铺板，则细胞可以更容易地被克隆分离。例如，几天后，以这样的密度铺板的细胞将增殖成 同源群体。
[0033] 最后，该方法包括选择干细胞[步骤（d)]。该干细胞可以通过任何常规的方法来 选择，如免疫细胞化学（ICC)，流式细胞术等。免疫细胞化学是一种通过使用特异性抗体用 于评估细胞（培养的细胞、细胞悬浮液）中特异性蛋白或抗原的存在的技术，其中特异性 抗体结合至特异性蛋白或抗原，从而允许在显微镜下的可视化和检查。如本领域技术人员 已知的，待染色的细胞可以附着于固体支持物，以允许后续的步骤中的容易处理，其可通过 以下几种方法来实现：贴壁细胞可以在显微镜载玻片、盖玻片、光学合适的塑料载体等上生 长。另一方面，流式细胞术是一种基于激光的、生物物理学技术，其应用于细胞计数、分选、 生物标志物的检测和蛋白质工程，通过在流体流中悬浮细胞，以及通过电子检测装置转移 它们。一种特殊类型的流式细胞术是荧光激活的细胞分选或FACS。该流式细胞术提供了一 种方法，以用于基于每个细胞的特定光散射和荧光特性，将生物细胞的异质混合物分选在 两个或更多个容器中，一次一个细胞。这些方法以及待检测的以便识别或选择干细胞的细 胞标记物，例如细胞表面标记物，是本领域技术人员广泛已知的。
[0034] 如果需要的话，用于分离干细胞的任何步骤和程序可以手动执行。可替换地，分离 这些细胞的方法可以通过一个或多个合适的装置来促进和/或自动化，其实例在本领域中 是已知的。实施例1以详细的方式描述了来源于人类子宫颈组织的本发明的细胞的分离。 作为本发明的方法的结果，获得了子宫颈干细胞的均质细胞群。
[0035] 因此，在【具体实施方式】中，分离的干细胞：
[0036] (a)表达细胞标记物⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、波形蛋白、细胞角蛋白 (CKAE1AE3)、Klf4, 0ct4 和 Sox-2,以及
[0037] (b)不表达选自由以下组成的组中的至少一种细胞标记物：结蛋白、肌动蛋白 HHF35、0 -连环蛋白、p63、E-钙粘着蛋白、CD117、CD133、HLA-DR、TRA1-81、CD45、CD34 和 CD31〇
[0038] 感兴趣的表型的确认可以通过使用常规的方法来进行。细胞标记物，例如，细胞表 面标记物，可以通过任何合适的常规技术来识别，通常基于阳性/阴性选择，例如，可以使 用针对细胞表面标志物的单克隆抗体，必须确认细胞中所述细胞表面标志物的存在/不存 在，虽然其他技术也可以使用。
[0039]使用针