成体心脏干细胞群的制作方法
【专利说明】成体心脏干细胞群 发明领域
[0001] 本发明涉及一类特异的成体心脏干细胞的鉴定、分离、扩增和特性的阐明。阐明这 些成体干细胞的特性是由于它们天然地表达一类特异性的可以被用于辅助其分离和扩增 的分子标记。本发明细胞在提供、激活和/或诱导损伤心脏组织的修复上表现出前所未有的 能力。这些成体干细胞可被作为治疗试剂用于包括，但不限于，组织再生，特别是损伤的心 脏组织如心肌再生。
[0002] 发明背景
[0003] 现有技术中已描述过多种不同的心脏干细胞系，包括在WO 99/49015，W0 2005/ 012510,W02006/052925,ff002/09650,ff002/13760,ff003/103611,ff02007/100530,ff02009/ 073616，W02011/057249，W02011/057251，W02012/048010,W02006/093276和，W02009/ 136283中描述的细胞系。
[0004] 尽管这些干细胞系已通过不同的手段被分离，它们都共有很多相同的特性，实际 上可能是相同的或实质上一样的干细胞群。特别地，所述已知的成体心脏干细胞群都共有 某些特性、分子标记和形态学特点。所述已知的细胞共有同样的起源(心脏组织）、贴壁培养 时的形态，表达成体干细胞表面的分子标记CD90或CD44,并且大部分在扩增过程中的某些 时间点也表达c-kit，主要是在所述干细胞培养启示时。端粒酶也被表明在这些细胞中是活 跃的。此外，所有这些细胞都具有分化为心脏谱系细胞的能力，如平滑肌、内皮细胞或心肌 细胞。
[0005] 尽管现有技术中已经知道有多种不同的心脏干细胞系，仍然存在鉴定并阐明一种 能够被用作治疗用途的心脏干细胞系需要。在治疗的背景下，与接受者遗传上不一致的干 细胞系常常在疗效可见之前因对所述干细胞的免疫排斥而引发问题。另一成体来源的多能 干细胞所经常经历的问题是在注射到成体动物中时会有形成畸胎瘤的倾向，因此其作为治 疗药物的应用受到限制。
[0006]因此目前仍存在需要鉴定一具有治疗用途的潜力，但注射到病人体内时不具有形 成畸胎瘤倾向的成体心脏干细胞群。更进一步，需要不会引起免疫排斥风险的细胞。 发明概要
[0007] 本发明提供一新成体心脏干细胞群，其与已知细胞群在分子标记表达谱和形态上 不同，并且由于其低免疫原性及对同种异体、同源或免疫缺陷宿主施用时不会形成畸胎瘤 而适于治疗应用。本发明所述心脏干细胞还能调节接受者的对异源细胞的免疫应答并能诱 导血管发生。本发明所述细胞可分离自心脏组织，优选地分离自心肌组织，并在体外附着于 通常用于制备细胞库的表面上扩增。与其他前述细胞不同，本发明所述细胞为端粒酶逆转 录酶阴性，所以其扩增能力有限，预防了肿瘤形成。
[0008] 本发明所述成体心脏干细胞的心脏保护、免疫调节能力和心脏再生潜能使其成为 治疗诸如缺血性心脏病、自身免疫疾病、伤口愈合过程或再生治疗等不同疾病的合适的治 疗工具。特别地，下述由本发明所述成体心脏干细胞所介导的现象使其成为治疗与细胞死 亡和炎症过程有关的疾病的有用的治疗工具：
[0009]-由这些细胞产物所介导的心脏保护信号将限制创伤之后细胞的损失。
[0010]-所述成体心脏干细胞的免疫调节能力将调节T细胞和巨噬细胞介导的炎症过程。 尽管创伤后启始阶段的免疫应答对去除细胞碎片和启始伤疤形成是关键的，延长的炎症过 程将不会使伤疤消除和组织再生。
[0011] -最后，大鼠模型的体内实验表明所述成体心脏干细胞具有诱导新生组织形成、减 少伤疤的尺寸和增加新生肌纤维存在的能力。这将通过所述成体心脏干细胞激活内源干细 胞的能力被介导。
[0012] 因此，所有这些由本发明成体心脏干细胞介导的活性是它们称为治疗与细胞死亡 和炎症过程有关的疾病的有用的治疗试剂。此外，这些细胞在需要形成新生组织的疾病中 可被用于促进组织再生。在这个意义上，人缺血性心脏病可使用这些细胞进行治疗。所述成 体心脏干细胞在该疾病的急性阶段将会限制细胞的丧失，调节免疫应答以使再生更快，最 后还将激活内源组织的常驻细胞促进新生组织形成。
[0013] 成体心脏干细胞和成体心脏干细胞群
[0014] 本发明提供成体心脏干细胞，特别地以一大体上纯的成体心脏干细胞群的形式提 供，其中所述成体心脏干细胞(CSCs)或所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达分子标记 S0X17和GATA4,并且其中所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群不表达 分子标记 0ct4，Nanog 和 c_ki t 〇
[0015] "成体"是指所述干细胞不是来源于胚胎的。在一种实施方案中，"成体"意为胚胎 后或"出生后"。对于本发明的干细胞，术语"成体干细胞"意为所述干细胞分离自生长阶段 在胚胎期之后的动物的组织或器官。在一些情况下，本发明的干细胞也可能分离自出生后 阶段。所述细胞可分离自哺乳动物，如大鼠、小鼠、猪或人。成体干细胞不像胚胎干细胞，后 者通过其起源-胚囊的内细胞团来界定。根据本发明的成体干细胞可分离自任何非胚胎的 组织，并将包括初生儿、少年、青年和成人个体。通常本发明所述干细胞会分离自一非新生 哺乳动物，例如分离自一个非新生的人、大鼠、小鼠或猪。优选地，本发明所述干细胞分离自 人，因此是人成体心脏干细胞或以大体上纯的人成体心脏干细胞群。
[0016] 本发明所述成体心脏干细胞及所述大体上纯的人成体心脏干细胞群可被分离获 得。
[0017] 术语"分离"表示其所指的细胞或细胞群不在天然的环境中。所述细胞或细胞群大 体上从周边的组织被分离出来。在一些实施方案中，如果样品包括至少大约75%，在一些实 施方案中至少大约85%，在一些实施方案中至少大约90%，在一些实施方案中至少大约 95 %的成体干细胞，则所述细胞或细胞群被大体上从周边的组织中被分离出来。换言之，如 果样品包括少于大约25%，在一些实施方案中少于大约15 %，在一些方案中少于大约5 %的 物质不是成体干细胞，则所述样品大体上从周边的组织中被分离出来。所述百分比值指重 量或细胞数百分比。该术语包括取自其自身来源的生物体、随后又再次植入某生物体的细 胞。所述包括再次植入的细胞的生物体可以是所述细胞所取自的同样的生物体，或者可以 是不同的生物体，即相同物种的不同个体。
[0018] 所述新成体心脏干细胞和所述新成体心脏干细胞群的分子标记表达谱可以通过 额外的分子标记的存在和/或不存在，或通过特定的存在或不存在的分子标记组合的表达 谱来进一步界定。在每种情况下，所述特定的分子标记组合可作为在一群细胞内的特定表 达谱和/或群内的单个细胞的特定分子标记表达谱存在。
[0019] 因此，在一种实施方案中本发明提供了一种分离的多能成体心脏干细胞，其中所 述细胞表达以下分子标记：（a) SOX 17和GATA4，并且其中所述细胞不表达以下分子标记：（b) 0ct4，Nanog，c-ki t和端粒酶逆转录酶，其中所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或 多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。本发明还提供了一大体上纯的成体心 脏多能干细胞群，其中所述细胞群表达以下分子标记：（a)S0X17和GATA4;和/或其中所述细 胞群不表达以下分子标记：（b)0ct4,Nanog，c-kit和端粒酶逆转录酶，其中所述细胞能分化 为以下细胞类型中的一种或多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。
[0020] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达S0X17和GATA4中的一种或多种。在进一步的实施 方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可 检测到的水平表达SOXl 7和GATA4。
[0021 ]在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的成体心脏干细 胞中至少大约95%在可检测到的水平表达SOXl 7和GATA4。更加特定地，本发明所述大体上 纯的成体心脏干细胞群中的成体心脏干细胞的至少大约95%、96%、97%、98%、99%或 100 %在可检测到的水平表达SOXl 7和GATA4。
[0022] 本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细 胞还可表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WTI，CCL2，IL-1 a，CSF3，PDGF-β， CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14种或全部。
[0023] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或大体上纯的所述成体心 脏干细胞群的细胞还可表达IL-Ιβ并且任选地表达⑶49c和/或HHEX。从这个意义上讲，在一 特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的 细胞中的至少大约95%在可检测到的水平表达IL-Ιβ，⑶49c和HHEX。更加特定地，本发明所 述大体上纯的成体心脏干细胞中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95%、96%、 97%、98%、99%或100%在可检测到的水平表达IL-10，CD49c和HHEX。
[0024] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达S0X17，GATA4，IL-Ιβ，⑶49c和HHEX，并且任选地 在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WTI，CCL2，IL-1α， 〇5卩3，卩〇6卩-0，〇)166,〇)1〇5,〇)9〇,〇)44,〇)29，说勵2，1型腿(：和/或比8中的1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14种或全部。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干 细胞群中的本发明所述的成体心脏干细胞的至少大约90%、91%、92%、93%、94%或95% 在可检测到的水平表达S0X17，GATA4，IL-Ιβ，CD49c和HHEX，并且任选地在可检测到的水平 表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WTI，CCL2，IL-1 a，CSF3，PDGF-β，CD 166， CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和 / 或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 种或全部。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述的成体 心脏干细胞的至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平表达S0X17， GATA4，IL-Ιβ，CD49c和HHEX，并且任选地在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或 多种，gp KDR，HEY2，WTI，CCL2，IL-I α，CSF3，PDGF-β，CD 166，CD 105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I 型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部。
[0025] 在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体 心脏干细胞群在可检测到的水平表达CD31。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约60% (优选地至少62%) 在可检测到的水平表达CD31。因此，在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞表达以下 分子标记中的一种，两种或全部：（a)⑶31，⑶49c和/或HHEX;和/或其中所述细胞不表达以 下分子标记中的一种，两种或全部：（b)⑶133，Nkx2.5和/或CXCR4蛋白。在另一实施方案中， 本发明所述大体上纯的成体心脏多能干细胞群表达以下分子标记中的一种，两种或全部： ⑶31，CD49c和/或HHEX;其中所述细胞群不表达以下分子标记中的两种或全部：CD133， Nkx2.5 和/或 CXCR4蛋白。
[0026] 因此，在一实施方案中本发明提供一种分离的多能成体心脏干细胞，其中所述细 胞表达以下分子标记：S0X17，GATA4，IL-Ιβ，CD31，CD49c和HHEX;且其中所述细胞不表达以 下分子标记:0ct4，Nanog，c-ki t，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白，Nkx2.5和⑶133，其中所述细 胞能够分化成以下细胞类型中的一种或多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细 胞。本发明还提供一大体上纯的成体心脏多能干细胞群，其中所述细胞群表达以下分子标 记：（a)SOXl7，GATA4，IL-Ιβ，CD31，CD49c和HHEX，并且其中所述细胞不表达以下分子标记： 卬)0(^4，似11(^，(3-1^1端粒酶逆转录酶，0乂0?4蛋白，他12.5和0)133，其中所述细胞能够分 化为以下细胞类型中的一种或多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。
[0027] 优选地，本发明所述成体心脏干细胞分离自心肌组织。
[0028] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群在可检测到的水平不表达c-ki t，0ct4和/或Nanog中的一种或多种。在更 进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏 干细胞群在可检测到的水平不表达c_kit，0ct4和Nanog中的任意一种。
[0029] 在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述 成体心脏干细胞中的至少大约95%在可检测到的水平不表达c-kit蛋白。更加特定地，本发 明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95%、 96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平不表达c-kit蛋白。
[0030] 在一进一步特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本 发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95 %在可检测到的水平不表达c-ki t蛋白，0ct4和/ 或Nanog中的一种或多种。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞 中的至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平不表达(：-1^七蛋白， 0ct4和/或Nanog中的一种或多种。
[0031] 在一进一步特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本 发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95 %在可检测到的水平不表达c-ki t蛋白，0ct4和 Nanog中的任意一种。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞中的 至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平不表达c-kit蛋白，0ct4和 Nanog中的任意一种。
[0032] 在另一特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上 纯的成体心脏干细胞群还可以在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/或⑶133中 的一种或多种。在进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体 上纯的成体心脏干细胞群还可以在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和⑶133中的 任意一种。
[0033] 在进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯 的成体心脏干细胞群的细胞中的至少95 %在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/ 或CD133中的一种或多种。更佳特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的所述 成体心脏干细胞中的至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平不表 达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/或⑶133中的一种或多种。本发明所述成体心脏干细胞和/或本发 明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞还可不表达以下分子标记中的一种或多种，即 CD45，CD34，CDl Ib，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80和/或CD86中的1，2,3,4,5,6种或全部。
[0034] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群中的细胞表达分子标记S0X17和GATA4的组合，并且不表达分子标记 0ct4，Nanog和c-kit的组合。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞 群中的成体心脏干细胞中的至少大约95%，例如至少大约95%、96%、97%、98%、99%或 100 %表达分子标记S0X17和GATA4的组合，并且不表达分子标记0ct4，Nanog和c-ki t的组 合。
[0035] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群的细胞表达分子标记3(?17,64了44，11^-1|3^049(3和^^乂的组合，并且不 表达分子标记0(^4，似11(^，(3-1^1他12.5,0乂〇?4蛋白，端粒酶逆转录酶和〇)133的组合。在 一特定实施方案中本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细 胞群的细胞中的至少大约95%，例如至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%表达分 子标记S0)(17，GATA4，IL-Ιβ，CD49c和HHEX的组合，并且不表达分子标记0ct4，Nanog，c-kit， Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和⑶133的组合。
[0036] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群表达分子标记3(?17,64了44，11^-1|3^049(3和!1册乂的组合并且任选地在可 检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WTl，CCL2，IL-la，CSF3， 卩〇6卩-0{〇166,〇)1〇5,〇)9〇，〇〇44,〇)29，拟灿2，1型册1(：和/或11^8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14种或全部，且在可检测到的水平不表达分子标记0ct4，Nanog，c-kit， Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和CD133，任选地还有CD45，CD34，CDl Ib，CD45，CD34， ⑶11b，端粒酶逆转录酶，CD40,⑶80和/或⑶86的组合。在一进一步特定的实施方案中，本发 明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的至少大约 95%，例如至少大约95%、96%、97%、98%、99%或100%在可检测到的水平表达分子标记 SOX17，GATA4，IL-10，CD49c和HHEX，任选地还有以下分子标记中的一种或多种，即KDR， HEY2，WTI，CCL2，IL-1a，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或 IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部的组合，并且在可检测到的水平不 表达分子标记0ct4，Nanog，c_kit，Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和⑶133，任选地还 有 CD45，CD34，CDl Ib，CD45，CD34，CDl Ib，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80 和/或 CD86 的组合。
[0037] 在某些特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上 纯的成体心脏干细胞群表达分子标记3(^17,64了44，111，册￥2和1(01?中的全部。在以进一步 特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干 细胞群表达分子标记S0X17，GATA4，CD44，CD90，CD105，CD166，WTl，HEY2和KDR中的全部。优 选地，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达以 下分子标记：CD31，IL-10，CD44，CD90，CD105, CD166，WT1，HEY2，KDR，CCL2, IL-Ia，CSF3， PDGF-b，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL-8 ;并且不表达以下分子标记：CD45，CXCR4蛋白， Nkx2·5，CD34，CDlIb，CD40，CD80和/或CD86。
[0038] 在一进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大 体上纯的成体心脏干细胞群不表达分子标记0ct4，Nanog，c-ki t，⑶40，CD80和⑶86中的任 意一种。在还进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯 的成体心脏干细胞群不表达分子标记0ct4，Nanog，c-kit，⑶45和端粒酶逆转录酶中的任意 一种。
[0039] 在本发明的某些实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体 上纯的成体心脏干细胞群具有以下分子标记表达谱：S0X17，GATA4，CD44，CD90，CD105，WT1 和KDR阳性，以及0ct4，Nanog，c-kit，⑶45和端粒酶逆转录酶阴性。
[0040] 本发明还提供一"混合细胞群"，包括占本发明所述成体心脏干细胞的至少大约 0.5%的（在其他方面至少1%，5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%或70%)不是本发明 所述成体心脏干细胞的细胞，例如，但不限制于，来源于脂肪组织或骨髓的间充质干细胞， 心外膜细胞，内皮细胞，周细胞和成纤维细胞。优选地，所述混合细胞群包括间充质干细胞。 更优选地，所述混合细胞群中至少大约80% (在其他方面至少85%，90%，91 %，92%，93%， 94%，95%，96%