，97%，98%或99.5%)是间充质干细胞。
[0041] 关于本发明中大体上纯的细胞群中的"大体上纯的"是指一干细胞群，其中所述细 胞群本质上仅包括本发明的成体心脏干细胞，即所述细胞群大体上是纯的。在本发明的许 多方面，所述细胞群包括至少大约80% (在其他方面至少85%，90%，91 %，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.5%，99.9%或 100%)本发明所述成体心脏干细胞。
[0042] 术语"分子标记"，如本发明中用到的，包括任何其存在，浓度，活性和磷酸化状态 能够检测和用于确认细胞表型的生物分子。
[0043] 术语"表达"用于描述细胞内的分子标记的存在。为了被认为是在表达，一种分子 标记必须在可检测到的水平存在。"可检测到的水平"是指所述分子标记可通过标准的实验 室方法如PCR，杂交，免疫荧光，ELISA或FACS分析中的一种被检测到。"表达"可以指，但不限 制于，一种蛋白、一种蛋白磷酸化的状态或一段编码蛋白的mRNA可检测到的存在。一个基因 如果表达可以合情合理地在30个PCR循环后被检测到，优选地在37个PCR循环后被检测到， 则被认为被本发明所述细胞或本发明所述群里的细胞所表达，对应细胞内的表达水平大约 每个细胞100个拷贝。术语"表达"（express ,expression)具有对应的意义。在低于该阈值的 表达水平下，一种分子标记被认为没有表达。本发明的成体心脏干细胞中的一种分子标记 的表达水平与另一种细胞，例如一种间充质干细胞中所述同样分子标记的表达水平的比较 可通过比较分离自同一物种的所述两类细胞进行。优选地这一物种是哺乳动物，并且更优 选地这一物种是人。这样的比较可以便利地通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验进 行。
[0044] 本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述成体心脏干细胞群的特性被阐明是 由于它们的某些分子标记具有独特的表达水平。此处显示本发明所述成体心脏干细胞和/ 或本发明所述成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达众多特异性的分子标记。
[0045] 如果所述成体心脏干细胞群中的本发明所述细胞的至少大约80%中一种分子标 记表现为可以被检测到，则本发明所述成体心脏干细胞群被认为表达这种分子标记。在其 他方面，所述群中的本发明所述细胞的至少大约85%，或至少大约90%，或至少大约95%， 或至少大约97%，或至少大约98%或更多中的分子标记表现为可以被检测到。表达可以通 过使用任何适当的手段，如RT-PCR实验，免疫印迹，免疫荧光，ELISA或通过荧光激活的细胞 分选(FACS)被检测到。应当强调的是提供这一列方法仅仅是意在举例，而不是为了限制。
[0046] 在一可选的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯 的成体心脏干细胞群被认为表达了 一种分子标记，如果所述分子标记的表达水平在本发明 所述细胞中高于在对照细胞中，例如，在间充质干细胞中。在此处的上下文中，"高于"是指 在本发明所述细胞群中所述分子标记的表达水平至少2,3,4,5，10，15,20倍高于在对照细 胞中的水平。
[0047] 在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群中SOX 17和GATA4的mRNA转录本的水平至少大约10倍于，例如大约10倍 于，大约15倍于或大约20倍于或更多倍数高于获取自骨髓或脂肪组织中的间充质干细胞的 同样的mRNA转录本的相应水平。
[0048]在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群中WTl，HEY2和/或KDR的mRNA转录本的水平至少大约10倍于，例如大约10 倍于，大约15倍于或大约20倍于或更多高于获取自脂肪组织中的间充质干细胞的同样的 mRNA转录本的相应水平。
[0049] 在一进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大 体上纯的成体心脏干细胞群中IL-la，集落刺激因子3(CSF3)和/或TOGF-B的mRNA转录本水 平至少大约5倍于，例如大约5倍于，大约10倍于或大约15倍高于或更多倍数于获取自脂肪 组织中的间充质干细胞的同样的mRNA转录本的相应水平。
[0050] 本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的特 性还可以被阐明，因为本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏 干细胞群在可检测到的水平上不表达一种特殊的分子标记或分子标记的组合。这些当中有 许多表示分化或部分分化的细胞。如此处所界定，这些分子标记被称为阴性分子标记。
[0051] 在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群被认为不表达一种 分子标记，如果存在于此的所述成体心脏干细胞的至少大约80%中所述分子标记不显示出 可检测到的表达。在其他实施方案中，存在于此的所述成体心脏干细胞的至少大约85%，至 少大约90 %或至少大约95 %或至少大约97 %或至少大约98 %或至少大约99 %或至少大约 100%中所述分子标记不显示出可检测到的表达。同样，通过使用RT-PCR实验，免疫印迹，免 疫荧光，ELISA或使用FACS可以证明可检测到的表达的缺失。
[0052]此处所描述的分子标记被认为没有被本发明所述成体心脏干细胞表达，如果表达 不能合乎情理地通过PCR的30个循环的水平检测到，对应细胞内的表达水平大约每个细胞 不到大约100个拷贝和/或不能够通过免疫荧光，免疫印迹，ELISA或FACS被轻易地检测到。
[0053]本发明特异的分子标记
[0054]本发明所指的分子标记包括所述分子标记的特异性参考序列，以及任何这些分子 标记的已知的直系同源基因。所述分子标记包括S0)(17，GATA4，KDR，WTl，CCL2，IL-Ia，IL-8， IL6，G-CSF，CXCLI，sICAM-1，CSF3，PDGF-β，CD166，CD10 5，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC， CD45，CD34，CDl lb，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80，CD86，CD31，IL-Ιβ，CD49c，HHEX，CXCR4蛋 白，Nkx 2.5和CDl33。
[0055] 术语Nanog包括Nanog及其任何直系同源基因，包括但不限于2410002E02Rik，ENK， ecat4同源框转录因子Nanog，以及同源框转录因子Nanog-delta 48。
[0056] 术语Oct-4包括Oct-4及其任何直系同源基因，包括但不限于Pou5fl，P0U结构域5 型转录因子I，〇ct-3，0ct-3/4，0ct3，0tf-3，，0tf-4，0tf3-rs7，及0tf3g。
[0057] 术语c-kit包括c-kit及其任何直系同源基因，包括但不限于CD117，Fdc，Gsfscol， Gsfsco5，Gsfsow3，SCOl，SC05，S0W3，Ssm，Tr-kit及KIT。
[0058] 术语TERT包括TERT及其任何直系同源基因，包括但不限于端粒酶逆转录酶，EST2， TCSl，TP2，TRT，hEST2及端粒酶催化亚基。
[0059] 术语S0X17包括Soxl7及其任何直系同源基因，包括但不限于NG_028171. IGI: 325053743。
[0060] 术语⑶90包括⑶90及其任何直系同源基因，包括但不限于Thyl，胸腺细胞抗原1， theta，T25，Thy-l，Thy-l·2，Thyl·1及Thyl·2。
[0061] 术语⑶166包括⑶166及其任何直系同源基因，包括但不限于Alcam(激活的白细胞 细胞粘附分子），AI853494，BEN，DM-GRASP，MGC27910，MuSC&SCl。
[0062] 术语cdl Ib包括cdl Ib及其任何直系同源基因，包括但不限于Itgam(整合素 αΜ)， CDllb/CD18，CR3，CR3A，F730045J24Rik，Ly-40，MACl，Mac-l，Mac-la，CDllB(pl70) ;Mac-la; 细胞表面糖蛋白MAC-Ia亚基;补体成分受体3a，补体成分受体3a-a，3型补体受体，白细胞粘 附受体MOl，和巨噬细胞抗原α。
[0063] 术语⑶29包括⑶29及其任何直系同源基因，包括但不限于ITGBl，整合素，β?纤维 连接蛋白受体，β多肽，MDF2，MSK12，FNRB，GPIIA，MDF2，MSKl 2，VLAB，0TTHUMP00000046253， 0TTHUMP00000063731，0TTHUMP00000063732; 0TTHUMP00000063733，纤维连接蛋白受体 β 亚 基，整合素 VLA-你亚基及整合素 β?。
[0064] 术语CD105包括CD105及其任何直系同源基因，包括但不限于ENG，endolgin，RPll- 228B15.2，END，FLJ41744，HHT1，0RW及0RW1。
[0065] 术语Gata-4包括Gata-4及其任何直系同源基因，包括但不限于GATA-4锌指蛋白转 录因子。
[0066] 术语⑶31包括⑶31及其任何直系同源基因，包括但不限于PECAMl，血小板内皮细 胞粘附分子，CD31 /EndoCAM，PECAM-I 及 CD31 /EndoCAM 粘附分子。
[0067] 术语IL-Ιβ包括IL-Ib及其任何直系同源基因，包括但不限于IL_lf3，ILHETA， IL1F2及catabolin。
[0068] 术语CD49c包括CD49c及其任何直系同源基因，包括但不限于ITGA3，GAP-B3，VCA- 2，VLA3a，通过单克隆抗体J143鉴定得到的抗原及MSK18。
[0069] 术语HHEX包括HHEX及其任何直系同源基因，包括但不限于HEX，H0X11L-PEN及 PRHX0
[0070] 术语CXCR4蛋白包括CXCR4蛋白及其任何直系同源基因，包括但不限于融合素或 CDl84，D2S20IE，FB22，HM89，HSY3RR，LAP3，LCRl，LESTR，NPY3R，NPYR，NPYRL，NPYY3R及WHIM。
[0071] 术语Nkx 2.5包括Nkx 2.5及其任何直系同源基因，包括但不限于CHNG5,心脏特异 性同源框，CSX，CSXl，HLHS2，NKX2-5，NKX2E，NKX4-1 及VSD3。
[0072] 术语CD133包括CD133及其任何直系同源基因，包括但不限于promininl，PROMl， MCDR2，STGD4，⑶RD12，RP41，AC133，MSTP061，PROMLI，hProminin，造血干细胞抗原及类 promininl〇
[0073] 细胞形态及其他特征
[0074] 本发明所述成体心脏干细胞群由具备独特形态的细胞所构成。典型地，本领域所 已知的心肌球衍生细胞直径至少为20μπι。然而，本发明所述成体心脏干细胞典型地更小且 直径小于20μηι。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明 所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞的平均直径为< 18_，< 17μπι，< 16μπι，< 15μηι，< 14μηι或者甚至更小。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞 群或本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞的平均直径的范围为2大约 ΙΟμπι至 < 大约15μηι。在一进一步实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或 本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少90%，例如至少95%，至 少96%，至少97%，至少98%，至少99%或更多的直径范围为2大约1(^111至<大约154111。
[0075] 本发明所述成体心脏干细胞的形态使所述细胞群对治疗应用尤其有益，因为它们 相对小的尺寸使其更适合对冠状及其他血管施用。例如，本发明所述大体上纯的成体心脏 干细胞群特别适合对冠状动脉，冠状静脉，和/或直接对心肌施用。本发明所述大体上纯的 成体心脏干细胞群特别适合通过注射或导管施用。
[0076] 本发明所述成体心脏干细胞具有无性增殖能力，即，所述细胞能够形成克隆。术语 "无性增殖"涉及到本发明所述细胞的无性增殖的能力。所述术语意在表达单细胞接种后能 够增殖并重现原始的培养。
[0077] 在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群被认为具有无性增殖能 力，如果所述成体心脏干细胞中的至少大约10%在作为单个细胞接种后增殖并建立起细胞 培养。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所 述成体心脏干细胞在一些实施方案中至少大约15%，在一些实施方案中至少大约20%，在 一些实施方案中至少大约25%，以及在一些实施方案中至少大约30%或更多具有无性增殖 能力。
[0078] 本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发 明所述成体心脏干细胞还能够自我更新。即，本发明所述成体心脏干细胞产生具有与母细 胞一样的分子标记表达特性谱和发育潜能的子细胞。这一特性可通过本发明所述细胞的培 养在经历多次传代后仍未失去分子标记表达谱的能力来确定。然而，本发明所述成体心脏 干细胞不能被无限次传代。本发明所述成体干细胞可扩增至20次而不改变任何特性。在一 实施方案中，本发明所述成体干细胞可被扩增至50次而不改变任何特性。
[0079] 本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发 明所述成体心脏干细胞还表现出高度的基因组稳定性。"高度的基因组稳定性"是指本发明 所述大体上纯的成体干细胞群可被传代多达5次，扩增和/或对个体施用而用比较基因组杂 交分析无任何染色体改变的证据。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的干细胞群 中的细胞的《大约25%，例如《大约20%，《大约15%，《大约10%或更少表现出染色体改 变。术语"染色体改变"包括染色体结构的任何重排，其允许染色体结构与正常预期的染色 体结构不同。例如，这一术语包含了染色体移位，染色体断裂和染色体倍增或丢失。
[0080] 本发明所述成体心脏干细胞悬浮培养时能形成心肌球。术语"心肌球"为本领域所 熟知并包括由心脏干细胞的克隆构成的假拟胚体。"拟胚体"或"假拟胚体"在本申请中被用 作同义词，是在处于应用给出的培养条件下的启始分化成为不同类型细胞的一团细胞的聚 集体。
[0081] 在某些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群或本发明所述的混合细 胞群中的本发明所述成体心脏干细胞被认为能形成假拟胚体，如果本发明所述大体上纯的 成体干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约 20%能形成假拟胚体。在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群或本发明 所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中至少大约25%，至少大约30%或至少 大约35 %或更多能形成拟胚体。
[0082] 通常地，这类假拟胚体通过悬滴法制备。然而，本发明所述细胞在不覆盖负电荷的 细菌培养皿中用生长培养基培养就容易形成拟胚体。对于本领域熟练的人员来说非常清楚 这一界定并非意在限定，并且本领域任何已知的制备拟胚体的方法都可以使用。本发明所 述细胞以低密度平铺于超低粘附力平皿上时还具备形成假拟胚体的能力是其自我更新能 力的一个特性，可以开发利用于这一特性将它们从本发明培养中存在的来源于相同组织的 其他非成体心脏干细胞的细胞中分离和分开。本发明所述成体心脏干细胞在细胞迀移试验 中还能诱导单核细胞迀移和/或单核细胞的募集。一优选的细胞迀移试验如实施例3D所描 述。"能诱导单核细胞迀移或募集"是指在此处所描述的细胞迀移试验中，前面培养本发明 所述成体干细胞的培养基当置于小室下面时，诱导置于小室上面的单核细胞穿过5微米的 膜孔到小室下面，速率比前面用于培养间充质干细胞(MSC)的培养基诱导的速率快至少 1.5,2,3,4,5或更多倍。
[0083] 本发明所述成体心脏安细胞还能诱导单核细胞增殖。"诱导单核细胞增殖"是指本 发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群与单核细胞共培养致使单核细胞增殖比单核细胞 单独的基准速率或单核细胞与间充质干细胞共培养至少快2，3，4，5，10，15，20或更多倍。单 核细胞增殖可通过任何本发明描述的或本领域已知的方法测定。
[0084] 诱导单核细胞募集，迀移和/或增殖的能力可能对本发明所述成体心脏干细胞的 治疗应用是重要的。本发明的发明人，在希望不被理论所约束的前题下，相信在一个体施用 后，本发明所述成体心脏干细胞会诱导单核细胞的募集和增殖。所述单核细胞反过来在调 节个体的免疫应答上发挥作用。单核细胞的存在也可能诱导该个体的血管发生。
[0085]本发明所述成体心脏干细胞还能调节T淋巴细胞应答。所述T淋巴细胞应答的调节 可通过任何本领域已知的或本发明所描述的方法进行测定。以优选试验在实施例3E中被给 出。"调节T淋巴细胞应答"是指本发明所述成体心脏干细胞能够调节激活的T细胞增殖，并 且特别地能够激活并扩增调节性T细胞群和/或下调CD4+和CD8+T细胞的增殖。在一特别的实 施方案中，包括本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群和调节性T细胞的悬浮共培养增 使增殖的调节性T细胞的比例与单独培养的T细胞相比增加了10% ,20% ,30% ,40% ,50%， 60% ,70% ,80% ,90% ,100% ,150% ,200%或更多。在另一特别的实施方案中，包括本发明 所述大体上纯的成体心脏干细胞群和PHA激活的T细胞的悬浮共培养使CD4+和CD8+T细胞的 增殖与单独培养的PHA激活的T细胞相比减少了 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%， 80%，90%或更多。在另一实施方案中，当与丝裂霉素 C处理过的本发明所述成体心脏干细 胞共培养时，通过IL2加 CD3/CD28Dynabeads激活的人原代T细胞的倍增次数与没有本发明 所述成体心脏干细胞的阴性对照相比降低了 10 %，20 % ,30% ,40% ,50% ,60% ,70%， 80%, 90%或更多。
[0086] 这些T淋巴细胞调节属性可能对本发明所述成体心脏干细胞的低免疫原性有所贡 献，因此也就对本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群的低免 疫原性有所贡献，这反过来使它们适用于治疗并适于作为同种异体细胞施用。本发明所述 成体心脏干细胞表现出弱免疫原性表型。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发 明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞不表达分子标记CD40，CD80,和/SCD 86。本发明所述成体心脏干细胞的低免疫原性及弱免疫原性表型允许所述细胞避免接受者 免疫系统的急性排斥，因此防止和/或延迟了从接受者体内的消除。本发明所述成体心脏干 细胞因此仍然在接受者体内会存在一段时间，足够使治疗的有益效果产生。所述调节接受 者免疫应答的能力也对治疗用途有益，因为其对本发明所述成体心脏干细胞预防损伤组织 中伤疤的形成和促进心肌再生有所贡献。
[0087] 本发明所述成体心脏干细胞或者不触发体外或体内的免疫应答，或者所触发的免 疫应答比同种异体细胞群注射到个体内所预期能触发的免疫应答大幅度减弱。在本发明的 某些方面，所述成体心脏干细胞和/或所述大体上纯的成体心脏干细胞群被认为没有触发 免疫应答，如果所述成体心脏干细胞和/或所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的至少大 约70%没有触发免疫应答。在一些实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细 胞中至少大约80%，至少大约90%，至少大约95%，至少大约99%或更多不触发免疫应答或 仅触发弱免疫应答。优选地，本发明所述细胞不触发由抗体介导的免疫应答或不触发体内 体液免疫应答，或触发比注射一种同种异体细胞后所预期触发的免疫应答更弱的免疫应 答。
[0088] "弱免疫应答"是指由本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成 体心脏干细胞群所触发的免疫应答与对照的同种异体细胞或细胞群所触发的相应的免疫 应答水平相比减少了大约40%，《大约30%，《大约25%，《大约20%或《大约10%或更 少。
[0089] 免疫应答的缺失，或弱免疫应答的存在可以用任何常规方法或如本发明实施例中 所描述来测定，优选地如实施例4A所描述。在一实施方案中，所述成体心脏干细胞和/或本 发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群将会被认为没有触发免疫应答或仅触发弱免疫应 答，如果针对本发明注射的细胞所产生的同种异体抗体的水平低于针对注射的对照细胞， 如间充质干细胞(MSCs)或来自不配对的个体的终端分化细胞，所产生的同种异体抗体水平 的10%。特定地，针对本发明注射的细胞所产生的同种异体抗体的水平是针对注射的对照 细胞，如间充质干细胞或来自不配对的个体的终端分化细胞，所产生的同种异体抗体水平 的 < 大约9%，<大约8%，<大约7%，<大约6%，<大约5%，<大约4%，<大约3%，<大 约2%，<大约1%，<大约0.5%或更低。
[0090] 在一特别优选的实施方案中，所述针对所述本发明中注射的细胞或细胞群所产生 的同种异体抗体的水平通过常规手段如流式细胞术不能被检测到。
[0091] 在一实施方案中，所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干 细胞群会被认为没有触发免疫应答或仅触发弱免疫应答，如果所述大体上纯的成体心脏干 细胞群与来源于不配对