合。此外它们可用于防止同种异体器官移植的排斥。 由于本发明所述细胞具有血管形成的能力，它们可用于缺血性疾病，像严重肢体缺血。
[0168] 因此本发明提供了治疗自身免疫疾病，炎症过程，慢性溃疡及促进伤口愈合的方 法，包括对接受对象施用本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏干 细胞群，本发明所述混合细胞群或本发明所述药物组合物。本发明还提供防止同种异体器 官移植排斥的方法，包括将本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏 干细胞群或本发明所述混合细胞群施用于接受对象。
[0169] -般本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或 本发明所述混合细胞群通过注射或植入引入到对象的体内。一般本发明所述成体心脏干细 胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群会被直接注射进 入预期它们在其中发挥作用的组织。在特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞，本 发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群，本发明所述混合细胞群或本发明所述药物组合物 在静脉内，动脉内，冠状血管内或心肌内施用。
[0170] 本发明所述成体心脏干细胞可按IX IO6至50 X IO6个细胞的剂量，优选地按25 X IO6至45 X IO6个细胞的剂量，更优选地按35 X IO6至40 X IO6个细胞的剂量，最优选地按38 X IO6个细胞的剂量施用。
[0171] 在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏 干细胞群或本发明所述混合细胞群可用于心脏组织再生，包括用于心肌的再生。在此实施 方案中，本发明所述细胞可以直接跨心内膜注射或植入受损的心脏组织;在动脉内用针导 管将所述细胞注射进入心肌;使用气囊导管插入动脉灌注损伤的组织区域，或相反;通过向 冠状静脉内注射所述细胞对所述损伤的区域进行引流的方式注射进入或植入损伤的心脏 组织中，一可选的处理心肌的实施方案是经导管经心内膜注射，可使用或不使用带有如 NOGA系统或任何其他类似的注射系统的电子作图。在一实施方案中，本发明提供了本发明 所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏多能干细胞群或本发明所述混合细 胞群，任选地粘附于一生物相容性植入物，在心脏组织再生中的用途。
[0172] 在另一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合 细胞群可粘附于一生物相容性植入物上被植入损伤的组织。在本实施方案中，本发明所述 大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可在植入到对象体内之前在体外 就粘附于所述生物相容性植入物上。如本领域任何技术人员所清楚的，众多粘附剂中的任 何一种在植入前都可用于将所述细胞粘附于所述植入物上。这里仅意在举例，这些粘附剂 可包括血纤维蛋白，整合素家族中的一个或多个成员，钙粘着蛋白家族中的一个或多个成 员，选择素家族中的一个或多个成员，细胞粘着分子(CAMs)中的一种或多种，免疫球蛋白家 族中的一个或多个成员以及人造粘附剂中的一种或多种。提供这一列名单用意仅在于注释 说明，而不是意图进行限定。对于本领域技术人员而言非常清楚一种或多种粘附剂的任何 组合都可使用。
[0173] 在另一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合 细胞群在将基质植入对象之前可以被包埋于基质中。一般地，所述基质会被植入对象的损 伤组织。基质的例子包括基于胶原的基质，基于血纤维蛋白的基质，基于层黏连蛋白的基 质，基于纤维连接蛋白的基质和人造基质。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意 图进行限定。
[0174] 在一进一步的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所 述混合细胞群可以与一基质形成组分一起被植入或注射进入对象体内。这可能允许所述细 胞在注射或植入后形成基质，确保所述细胞在对象体内保持在适当的部位。基质形成组分 的实施例包括血纤维蛋白胶液态烷基，氰基丙烯酸盐粘合剂单体，增塑剂，多糖如右旋糖 苷，含有乙撑氧的寡聚物，模块共聚物如泊洛沙姆和普兰尼克，非离子型表面活性剂如吐温 和Triton'8'，以及人造的基质形成组分。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意 图进行限定。对于本领域技术人员而言非常清楚一种或多种基质形成组分的任何组合都可 使用。
[0175] 在一进一步的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所 述混合细胞群可被包含与一微球内。在此实施方案中，所述细胞可封装于所述微球的中心。 同样在此实施方案中，所述细胞可包埋于所述微球的基质材料中。所述基质材料可包括任 何合适的可生物降解的多聚物，包括但不限于藻酸盐，聚乙二醇(PLGA)，及聚氨酯。提供这 一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。
[0176] 用作治疗用途和治疗方法时，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或所述混 合细胞群将会按治疗上有效的剂量施用于对象。体内或离体要投放的细胞数量基于一些参 数，包括:对象的体重，组织损伤的严重程度，以及对象体内的存活细胞数。一典型的细胞数 可以是大约I X IO6至I X IO8个细胞，更加特定地IO6至IO7个细胞每公斤体重。一般地，一个 疗程投中送到对象体内的细胞总数会是大约I XIO6至I XIO8个细胞。
[0177] 如上所述，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群具有数个特性使其特别适用 与治疗用途。特别地，低免疫原性，在接受者体内调节T细胞应答的能力，诱导血管发生的能 力和促进心肌再生并诱导内源心肌细胞再生的能力都对治疗效果作出了贡献。因此本发明 提供了一种治疗心血管疾病和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群用于治疗心血 管疾病的治疗用途，其中所述大体上纯的成体心脏干细胞群通过以下机制中的一种或多种 诱导心脏组织修复：
[0178] (a)单核细胞的募集；
[0179] (b)免疫调节；
[0180] (C)血管发生的激活；
[0181] (d)促进心肌再生和/或
[0182] (e)诱导内源心肌细胞的再生。
[0183] 因此，在本发明一实施方案中提供了一种治疗罹患心血管疾病或缺血性损伤的个 体的方法，包括对所述个体施用本发明所述成体心脏干细胞群，本发明所述一大体上纯的 成体心脏多能干细胞群，本发明所述一混合细胞群或本发明所述一药物组合物的步骤。本 发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的低免疫原性和/或本发明所述大体上纯的成体心 脏干细胞群的免疫调节能力使本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在施药后避免被 所述接受个体的免疫系统急性排斥和/或消除。因此，在至少24小时的时间段内，例如36小 时，48小时，72小时，4天，5天，6天，1周，2周，1个月或更长时间内，在所述个体的体内仍存在 数量可被检测到的被施用的细胞。在一特定的实施方案中，24小时后，施用的细胞中至少大 约50 %或更多，例如至少大约60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，99 %或更多，在所述个体中仍存 在。
[0184] 所述施用细胞的滞留允许所述细胞形式其治疗心血管疾病或缺血性疾病的功能。 例如，所述细胞能够发挥其免疫调节效果，诱导单核细胞的募集和/或激活，诱导血管发生 和/或诱导内源心肌细胞的再生长达大约24小时或更长，例如长达36小时，长达48小时，长 达72小时，4天，5天，6天，1周，2周，1个月或更长。
[0185] 尽管来自本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞在所述个体的体内保 持的时间长到足以发挥治疗效果，但所述细胞不会永久地滞留于所述个体的体内。足够发 挥治疗效果的时间为至少24小时并可能长达1个月或更长。例如，所述细胞可被滞留长达 36,48,72小时，4天，5天，6天，1周，2周或1个月。
[0186] 本发明所述成体心脏干细胞和所述大体上纯的成体心脏干细胞群的一更进一步 的有益属性是其在免疫缺陷的个体中施药后不会诱导肿瘤，如实施例4E所述。
[0187] 本发明所述成体心脏干细胞和所述大体上纯的成体心脏干细胞群还可以按至少 50 X IO6个细胞的剂量通过在冠状血管内施药的方式施用而不显现出任何心脏毒性。在本 发明的情况下，心脏毒性通过检测有没有特定的心脏酶的水平升高到超过一般可接受的上 限来测量。特别地，心肌肌钙蛋白I (cTnl )，肌酸激酶-MB(CK_MB)和/或肌红蛋白（MB)的水平 指示心脏毒性。如本发明实施例4D所述，这些酶的水平在施用本发明所述大体上纯的成体 心脏干细胞群于一个体后没有升高。本发明还提供一药物组合物，包括：（a)本发明所述成 体心脏干细胞，（b)本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群，或(c)本发明所述一混合 细胞群及一药学上可接受的载体。优选地，本发明所述药物组合物包括从IX IO6到50 X IO6 个细胞，优选地25 X IO6到45 X IO6个细胞，更优选地35 X IO6到45 X IO6个细胞，最优选地38 X IO6个细胞。
[0188] 所述药学上可接受的载体可包括一细胞培养基，其支持所述细胞的活性。所述培 养基通常是无血清的以避免在接受者体内刺激免疫应答。所述载体通常溶于缓冲液和/或 无热源的。
[0189] 药学上可接受的载体及稀释剂包括盐水，液体缓冲溶液，溶剂和/或分散培养基。 这样的载体及稀释剂的使用为本领域所熟知。所述溶液优选地为无菌的且流动性程度达到 能够轻易地注射。在许多实施方案中，所述溶液在生产和储藏条件下稳定并且通过使用，例 如对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫汞撒来避免保存中被微生物活动所污 染。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。本发明所述成体干细胞组 合物溶液可通过向一药学上可接受的载体或稀释剂及，如果需要，其他上述所列举的已经 过滤除菌的成分中加入本发明所述的成体干细胞制得。
[0190] -些能用作药学上可接受的载体的材料和溶液的例子包括：（1)糖，如乳糖，葡萄 糖和蔗糖；（2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；（3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙 基纤维素和醋酸纤维素；（4)分装黄芪胶；（5)麦芽糖；（6)明胶；（7)滑石；（8)赋形剂，如可可 油和栓剂蜡；（9)油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；（10)甘 醇，如丙二醇；（11)多羟基化合物，如丙三醇，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；（12)酯，如油酸乙 酯和月桂酸乙酯；（13)琼脂；（14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；（15)褐藻酸；（16)无热源 的水；（17)等渗盐水；（18)林格氏溶液；（19)乙醇；（20)pH缓冲溶液；（21)聚酯纤维，聚碳酸 酯和/或聚酐；以及(22)其他无毒性兼容的用于药物配方的物质。提供这一列名单用意仅在 于注释说明，而不是意图进行限定。
[0191] 在一特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述 药物组合物可在冷冻培养基中冷冻。任何在低于大约_20°C的温度(例如低于大约_40°C，或 低于大约-80°C的温度）下还能保存所述细胞的活力的培养基都适于用作冷冻培养基。例 如，所述冷冻培养基可包括2.5 %到10 %的DMSO。更加特定地，所述冷冻培养基可包括5- 7.5% 的DMSO。
[0192] 冷冻培养基可以基于本发明所述培养基或扩增培养基，还包括胎牛血清或人血清 或其他任何在所述细胞解冻后还能维持细胞完整性的蛋白或蛋白混合物。本发明所述细胞 还可冻存于基于右旋糖苷的无蛋白培养基中。
[0193] 解冻后，本发明细胞可经洗涤除去DMSO或其他冷冻培养基组分再施用或重悬于施 用缓冲液。施用缓冲液可为任何能够注射进病人体内后不产生毒性的生理溶液。施用缓冲 液可包括3-15 %蛋白质，如人血清白蛋白。
[0194] 本发明所述药物组合物还可用于本发明所述的治疗或治疗用途方法中的任何一 种。
[0195] 一般的定义
[0196] 术语"大约"与数值相关时是指该数值的+/-10%。术语"大约"与数值相关时还包 括该数值的+/-5 %。
[0?97]术语"包括"（comprise，comprising)用于包括性的，开放性的意思，意指其他的要 素可被包括在内。术语"包括"还包含术语"由…组成"和"基本上由…组成"并可与之互换使 用。
[0198]术语"大体上纯的"包括"完全纯的"并可与此术语互换使用。
[0199]附图简要说明
[0200] 图1、生产本发明所述心脏干细胞流程的示意图。
[0201] 图2、A)本发明所述心脏干细胞(CSCs)与源自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞相 比SOXl7和GATA4的具有更高的mRNA表达(通过qPCR测定）；
[0202] B)CSCs表达S0X17和GATA4蛋白，由蛋白表达阵列研究可以观察到。
[0203]图3、A)通过流式细胞术分析发现在CSCs中c-kit没有表达或表达水平非常低。C-kit具有代表性的表达(黑色线条)已示出。灰色填充区域显示同型对照。
[0204] B)流式细胞术分析揭示CSCs中0)45,001113,0034,0乂0?4和0)133在其细胞膜上表 达为阴性。CD45,⑶11b，⑶34，CXCR4和⑶133的表达(黑色直方图）对应于同型对照（灰色填 充的直方图）被不出。
[0205]图4、A)CSCs不表达端粒酶。通过对CSCs进行qPCR分析没有观察到端粒酶催化亚基 的表达。
[0206] B)CSCs中的端粒重复片段扩增流程(TRAP)端粒酶活性与MSC或HDF比较。在CSCs中 未观察到端粒酶活性。
[0207] C)人CSCs体外充分扩增后(>30次群倍增)进行细胞化学分析检测衰老相关β半乳 糖苷酶活性(SA-i3Gal)。体外扩增后，部分CSCs与X-gal孵育后变蓝，表明这些细胞衰老了。
[0208] 图5、A)经蛋白质阵列分析CSCs不表达0ct3/4或Nanog。
[0209] B)经 Western 杂交分析 CSCs 不表达 0ct3/4 或 Nanog。
[0210] 图6、A)ELISA研究已示出CSCs如何在工作细胞库和在终产品（FP)中表达大量的 CCL2。间充质干细胞被用作对照细胞系。
[0211] B)CSCs表达11^-8，几-6,0乂(^6,810厶11和11^-1€[蛋白，由蛋白表达阵列研究可观察 到。
[0212 ] 图7、CSCs表达I型MHC但不表达共刺激分子CD40，CD80和CD86。
[0213]图8、A)在分离和体外扩增后分析CSCs的细胞大小。
[0214] B)CSCs分离后具有圆形的形态。
[0215] C)CSCs在体外扩增时获得了类基质细胞的形态。
[0216] D)CSCs在传至第2代(P2)和第7代(P7)时有无性增殖能力。
[0217] E)和F)在超低粘附性平板上接种一个单细胞时CSCs能够形成心肌球并悬浮生长。
[0218] 图9、A)细胞迀移试验Transwell平板。
[0219] B)CSCs具有较强的募集单核细胞的能力。
[0220] OCSCs对激活的T细胞展示出免疫调节能力。
[0221] 图10、A)由CSCs分泌的生长因子促进生存。
[0222] B)所述由CSCs分泌的因子的促存活能力也在H9c2细胞中在血清去除后进行分析。
[0223] 图11、A)CSCs分化为心脏细胞谱系的潜力通过免疫荧光进行分析。在特定的分化 培养基中培养后CSC细胞展现出对应于平滑肌，内皮细胞和心肌细胞的分子标记的表达。
[0224] B)此外，CSCs在适当的培养基中培养后也能分化成脂肪细胞和骨细胞。脂肪细胞 的分化通过油红〇染色（以示出细胞质脂滴)进行分析，而骨细胞分化通过茜素红染色（以指 示出钙的沉积)确证。
[0225] 图12、本图所示比较基因组杂交分析对应一人类女性的基因组且未观察到染色体 改变，如倍增或缺失。
[0226] 图13、同种异体的CSCs在冠状血管内施用后未引起强体液应答。
[0227] A)同种异体的猪CSCs通过冠状血管内注射到免疫活性的梗塞的猪体内，在细胞施 用前或15或30天后采集血样。在第30天同样的细胞按新的剂量通过静脉内注射到体内，并 且血样在第二次注射后第3，7，15和30天采集。
[0228] B)特异的免疫反应性的免疫球蛋白（IgG和IgM)的存在在不同的血样中进行分析。 在最初的30天中针对被注射的细胞无法找到特异的免疫反应性的I gG。反之，在第二次注射 后我们在第7,15和30天观察到了同种异体CSCs特异的IgM和IgG的存在。这些结果表示尽管 同种异体CSCs在施用后不会触发强体液应答，它们仍被识别并很可能被产生免疫记忆的免 疫系统消除，免疫记忆在第二次注射后引发了更强和更快的应答。
[0229] 图14、CSCs注射24小时候还留在心脏中。使用到GFP标记细胞的示踪实验表明CSCs 至少在注射后24小时仍留在梗塞区域。人CSC用GFP(>)标记并注射到免疫缺陷大鼠的心肌 内，大鼠在此7天前已形成梗塞。24小时后处死动物，通过组织学分析到GFP阳性细胞的存 在。荧光标记的微球与所述细胞一起共注射以能够坚定到注射部位(实心箭头）。细胞核用 DAPI染色(*)。
[0230] 图15、A)免疫缺陷大鼠通过连接冠状动脉前降支形成梗塞，并且来自不同供体的 CSCs被移植到心肌内（5xl05)并与注射PBS的动物对比。前壁(AW)增厚的水平在移植有CSCs 的动物中显著更高。
[0231] B)与对照动物相比，在用细胞处理过的大鼠中通过采用Masson三色染色的组织学 分析也显示伤疤的大小显著下降，并且在受影响的区域心肌细胞增加。
[0232] 图16、注射溶液(安慰剂)或剂量为50 X IO6的人CSC已通过冠状血管内注射到健康 的猪的体内。心脏酶在基线和细胞注射后24小时进行检测，并未观察到毒性。
[0233] 图17、使用特异性探针(来自Life Technologies的TaqMan探针）的定量PCR(qPCR) 分析显示与用作对照细胞系的间充质干细胞相比，在CSCs中GATA4，SOXl7，WTl，HEY2，KDR， HHEX和HAND2过表达。GUSB基因被用作内源对照基因。数值为相对定量的Log2对数值。
[0234] 图18、流式细胞分析揭示CSCs在其细胞膜上高水平表达CD166，CD90，CD44，CD105， ⑶31和⑶49c(黑色直方图）。同型对照如灰色的填充的直方图所述。 实施例
[0235] 实施例1细胞的分离与扩增
[0236] 本发明所述细胞分离自从右心耳获得的心脏穿刺与处死的动物（小鼠，大鼠，猪 等)的心脏。通过将穿刺样本切成小碎片（< Imm3)并用2型胶原酶(Worthington生物化学公 司，Lakewood，新泽西，美国）处理3个循环每次30分钟获得一细胞悬液。心肌细胞通过离心 和使用40μπι细胞滤网过滤去除。在CD45阳性细胞被免疫耗竭并依照生产商说明书使用微珠 (MiItenyi生物科技，Bergish Gladbach，德国）筛选CSCs后获得心脏干/组细胞。所述用到 的微珠为CDl 17(c-kit)微珠，但其他微珠也可以使用，应为CSCs的分离并不依赖于c-kit的 存在。
[0237] 分离后，所述细胞在分离培养基(DMEM/F12培养基添加10%胚胎干细胞级的胎牛 血清(FBS ESCq)，L-谷氨酰胺（2mM)，青霉素-链霉素（IOOU/mL和100yg/mL)，bFGF(IOng/mL) 以及ITS( Invitrogen，马德里，西班牙及圣-欧班，法国），IGF-II (30ng/mL)和EGF(20ng/mL) (Peprotech，Neui I ly-sur-Seine，法国）和hEP0( Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）（见表1)) 中接种于基质胶(BD生物科学，马德里，西班牙)包被的平板。
[0238] 表1 CSC分离培养基
[0241]所述细胞于37°C在3%02的气氛下生长，以此促进发挥恰当的功能并模拟生理/病 理的条件。细胞接种一周后，分离培养基由扩增培养基所取代，扩增培养基是DMEM/F12和 Neurobasal培养基（I: 1)并添加有10%FBS ESCq，L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素，B27(I X )， N2(l X )，β-巯基乙醇（50μΜ)，ITS和生长因子(bFGF，IGF-II，EGF)的组合(见表2)。
[0242]表2扩增培养基
[0244] 所述细胞在扩增培养基中和3%02的气氛下生长，然后在传至第4代倍增21次后冻 存一制得工作细胞库(WCB)。随后分析所述细胞的表达谱。表达谱正确的细胞被解冻并扩增 直到第5代（累计倍增25次），这样形成所述终产品(FP)其中细胞的质量进行了分析。质量控 制(QC)在生产过程中完成一确保所述终产品的一致性，纯度和安全性。
[0245] 实施例2 CSCs中mRNA与蛋白质表达的阐明
[0246]
[0247] 根据实施例1所述方法获得的S0X17和GATA4在所述心脏干细胞(CSCs)中的mRNA表 达与来自骨髓或来自脂肪组织的间充质干细胞(MSCs)进行了比较。来自CSCs与来自MSCs的 mRNA被分离，并制得cDNA用于qPCR和表达阵列实验。
[0248] 为了