个体的T细胞一起孵育所诱导的IL2，IFNA，TNFf3，IL4，IL5，ILlO， IL3，TNFa和/或TGFI3中的一种或多种的水平低于来源于不配对个体的相同T细胞群与终端 分化细胞或间充质干细胞一起孵育后的IL2，IFNA，TNFf3，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFc^P/STGF β中的一种或多种的表达水平的大约50%。在一些实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干 细胞群与来源于不配对个体的T细胞一起孵育所诱导的IL2，IFNA，TNFf3，IL4，IL5，ILlO， IL3，TNFa和/或TGFI3中的一种或多种的水平低于来源于不配对个体的相同T细胞群与终端 分化细胞或间充质干细胞一起孵育后的IL2，IFNA，TNFf3，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFc^P/STGF β中的一种或多种的表达水平的大约40%，大约30%，大约25%，大约20%，或大约10%，或 更低。在一特定的实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干细胞群与来源于不配对个体的T 细胞一起孵育后所诱导的IL2和IFNA的水平低于终端分化细胞与来源于不配对个体的相同 T细胞一起孵育后的IL2和IFNA表达水平的大约50% (例如，<大约40%，<大约30%，<大 约25%，《大约20%，《或大约10%或更低）。
[0092] 在另一实施方案中，紧随上文描述的试验所产生的免疫应答可通过检测所述试验 中的T细胞增殖速率来测量。在一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群会 被认为没有触发免疫应答，如果来源于不配对个体的T细胞在与所述大体上纯的成体心脏 干细胞群一起孵育后其增值速率低于相同的T细胞群与分离自不配对个体的终端分化细胞 或PBMCs-起孵育后的所述T细胞的倍增速率的大约50%。在一些实施方案中，所述分离的 成体心脏干细胞与来源于不配对个体的T细胞一起孵育后诱导的增殖速率低于相同的T细 胞群与分离自不配对个体的终端分化细胞一起孵育后的所述T细胞倍增速率的大约40%， 大约30%，大约25%，大约20%，或大约10%或更低。
[0093] 提供上文所描述的试验仅仅是为了注释说明，而并非意图穷尽所有情况。熟练人 员将知晓各种可替代的试验，这些可被使用。优选的试验在本发明实施例中给予了描述。
[0094] 本发明所述成体心脏干细胞还能够分泌抗凋亡因子。抗凋亡因子的分泌可按本发 明所描述来测量，并且特别地如实施例3F所描述。在特定的实施方案中，抗凋亡因子的分泌 可通过比较接触用于扩增本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群的培养基的创伤心 肌细胞与接触用于扩增间充质干细胞培养基的创伤心肌细胞的细胞活性来测量。在一特别 的实施方案中，接触到本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞的细胞活性至少比 对照高2,3，4,5,10或更多倍。
[0095] 本发明所述成体心脏干细胞还能够促进心肌再生，例如，通过诱导内源心肌细胞 的再生，促进新生肌肉形成和/或阻止伤疤形成和重塑心脏组织。实施例4C中给出一优选的 测量心肌再生促进的试验。
[0096] 本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的或本发明所述混合细胞群中的心 脏干细胞还是多能的。"多能"是指所述干细胞能够产生来自多种谱系的细胞类型，但谱系 的数量有限。
[0097] 特别地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的或本发明所述混合细胞群 中的细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞，心肌细 胞和/或平滑肌细胞。
[0098] 产生本发明所述成体心脏干细胞群的方法
[0099]本领域已知的从心脏组织中制备心脏干细胞的方法有很多。本发明提供了一种制 备所述成体心脏干细胞和/或根据本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群。在鉴定得 到了一些想要获得的成体心脏干细胞群所独有的分子标记后，发明人开发获得了一种制备 所述群的方法，包括以下步骤：
[0100] (a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液;并且
[0101] (b)筛选至少表达S0X17和GATA4的细胞。
[0102] 所述筛选可通过使用任何常规手段检测至少S0X17和GATA4的表达，并弃去不表达 这些分子标记的细胞来进行。在一特别的实施例中，在步骤(a)后获得一团细胞沉淀，并且 在mRNA水平高表达S0X17和GATA4的细胞被筛选出准备进行进一步处理。
[0103] 本发明所述方法可进一步包括扩增步骤(b)中筛选到的细胞的步骤，即步骤(c)。 在本实施方案中，本发明提供了一种制备根据本发明所述一大体上纯的心脏干细胞的方 法，包括以下步骤：
[0104] (a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液；
[0105] (b)筛选至少表达S0X17和GATA4的细胞；以及
[0106] (c)扩增步骤(b)中筛选的细胞。
[0107] 所述扩增步骤提供了包括细胞数量更多的一大体上纯的成体心脏干细胞。因此所 述扩增步骤对于增加本发明细胞群的规模有益，所述细胞群可用于下游的用途，如本发明 所描述的治疗应用。
[0108] 本发明所述方法可进一步包括确认由步骤(c)产生的所述大体上纯的干细胞群仍 然至少S0X17和GATA4还在表达的步骤，即步骤(d)。因此，本发明所述方法可以包括确认源 自步骤(c)的已扩增的细胞中至少SOX 17和GATA4的表达的步骤。在本实施方案中，本发明提 供了一种制备根据本发明所述一大体上纯的心脏干细胞的方法，包括以下步骤：
[0109] (a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液；
[0110] (b)筛选至少表达S0X17和GATA4的细胞； (c)扩增步骤(b)中筛选的细胞；以及
[0112] (d)确认源自扩增步骤（c)的所述大体上纯的干细胞群至少仍在表达S0X17和 GATA4。优选地，确认源自扩增步骤（c)的所述大体上纯的干细胞群至少仍在表达SOXl7， GATA4和IL-Ιβ并且不表达以下分子标记:0ct4，Nanog，C_ki t，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白 和Nkx 2.5;并且任选地，确认所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种:脂肪细 胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。
[0113] 本发明所述方法可从任何一致的包括一成体心脏干细胞群的悬液开始。然而，在 一特定实施方案中，所述方法还包括制备所述启始包含一成体心脏干细胞群的细胞悬液。 在一实施方案中，这种细胞悬液从心脏组织，如心脏活体组织检测(例如获取自心脏外科手 术，在心脏插入导管的过程中通过活检导管获得，或获取自处死的动物的心脏）。因此，在本 实施方案中，本发明方法包括从心脏组织中分离一成体心脏干细胞群的步骤和扩增所述细 胞群然后筛选所述细胞的步骤。在本实施方案中，本发明所述方法包括以下步骤：
[0114] (a)制备包含来自心肌组织的细胞悬液；
[0115] (b)分离成体心脏干细胞群；
[0116] (c)扩增所述成体心脏干细胞群；以及
[0117] (d)筛选至少表达S0X17和GATA4的细胞。
[0118] 优选地，步骤(d)包括筛选至少表达S0X17，GATA4和IL-Ιβ，并且，任选地，表达CD31 且不表达以下分子标记:Oc t4，Nanog，c-ki t，端粒酶逆转录酶，CXCR4和Nkx2.5;并且能够分 化为以下细胞类型中的一种或多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞的细胞。
[0119] 从心脏组织中分离一成体心脏干细胞群可通过任何本领域已知的手段进行。在一 特定的实施方案中，来自心脏组织的细胞经过滤除去心肌细胞并经过免疫耗竭去除CD45阳 性细胞。所述耗竭的细胞可随后任选地经过免疫选择获得CD117(c-kit)阳性细胞。然而，根 据本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群为c-kit阴性，所以发明人相信这一步是任选 的并且如果存在的话还可能导致免疫选择的结果不真实。有可能这一步仅仅代表了附加的 尺寸过滤步骤，且可被包含有任何免疫选择性的抗体或根本不包含任何抗体的珠过滤所代 替。可选地，最初用针对CD117的免疫选择所分离到的细胞可能产生表达c-kit的最初始的 成体心脏干细胞群。然而，清楚的是，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群是c-kit阴 性的，这意味着任何在起始时存在的c-kit的表达在随后的筛选步骤或筛选和扩增步骤中 丧失了。所述细胞的分子标记表达谱在所述方法的步骤与步骤之间可能会改变，而且特别 是在启初的包含一成体干细胞群的悬液和产生自所述筛选步骤的细胞之间。
[0120] 所述扩增所述成体心脏干细胞群的步骤可包括在适合的，有助于细胞生长的条件 下（例如在含3%O2气氛中）在扩增培养基中培养分离的成体心脏干细胞群。所述扩增的成 体心脏干细胞群然后可被冷冻保存以创建一个工作细胞库(WCB)。例如，所述成体心脏干细 胞群可在传代4次倍增21次以后冷冻保存以构建一个WCB。然后可以分析所述细胞的表达 谱。
[0121] 在一进一步特定的实施方案中，一种制备根据本发明所述大体上纯的成体心脏干 细胞的方法，包括以下步骤：
[0122] (a)制备包含来自心肌组织的细胞悬液；
[0123] (b)分离成体心脏干细胞群；
[0124] (c)扩增所述成体心脏干细胞群；
[0125] (d)制备一包括多种细胞系的工作细胞库(WCB)或多个每个库具有一个细胞系的 工作细胞库；
[0126] (e)从所述工作细胞库中或从至少表达SOXl 7和GATA4的工作细胞库中筛选那些细 胞系；优选地，从所述工作细胞库中或从所述至少表达SOXl7，GATA4，IL-Ιβ以及任选地， ⑶31并且不表达以下分子标记:0ct4，Nanog，c_ki t，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白和Nkx2.5 的工作细胞库中筛选那些细胞系;并且，任选地，确认所述细胞能够分化为以下细胞类型中 的一种或多种:脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞的细胞系；
[0127] (f)扩增所述筛选的细胞系；以及
[0128] (g)确认在最终的大体上纯的成体心脏干细胞群中至少S0X17和GATA4的表达，优 选地，确认在最终的大体上纯的成体心脏干细胞群中至少SOX 17，GATA4，IL-Ιβ以及任选地， ⑶31的表达，以及以下分子标记的不表达:0ct4，Nanog，c-ki t，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白 和Nkx2.5。
[0129] 在本发明的这一方法的一特定的实施方案中，在步骤(b)和(c)之间有一步筛选步 骤，包括筛选至少表达S0X17和GATA4的细胞用于进一步处理。更加特定地，在细胞已经被扩 增至少3代后进行增加的一步筛选步骤，其可以包括17次倍增。在传到第3代时，获得一团细 胞沉淀并且高水平表达S0X17和GATA4的mRNA的细胞被筛选出并进一步扩增形成工作细胞 库。所述细胞的表型在WCB阶段通过流式细胞术和qPCR得以确认，并且细胞扩增后产生终产 品。
[0130] 在本发明所述方法的任意一种中，所述筛选步骤和/或所述确认步骤可任选地还 包一种或多种进一步的分子标记的筛选或检测。这些分子标记包括WTl，HEY2,KDR，PDGF， CCL2，ILla和/或CSF3。在一特定的实施方案中，所述筛选步骤包含筛选表达S0X17，GATA4， WTl和HEY2全部这几种分子标记的细胞。在一进一步特定的实施方案中，所述筛选步骤包含 筛选表达3〇)(17,64了44，11'1，冊￥2，1(〇1?，？〇6?-0，〇(^2，11^1€[和05?3全部这几种分子标记的细 胞。在一特定的实施方案中，所述确认步骤包含确认所述细胞表达S0X17，GATA4，WT1和HEY2 全部这几种分子标记。
[0131] 术语"工作细胞库"在本发明中作常规的意义使用，并会得到本领域技术人员的充 分理解。一个"工作细胞库"是一源自母细胞库或来自原代分离的细胞群的细胞培养物并且 意在用于准备生产可用于制备本发明所述药物组合物的细胞培养物(也被称作"终产品"）。
[0132] 尽管通过其他方法也可能生成本发明所述细胞，本发明的发明人发现筛选至少表 达S0X17和GATA4的细胞的步骤提高了生产大体上纯的成体心脏干细胞群的效率，其具有所 声称的干细胞群的全部优势属性。
[0133] 筛选自所述WCB的细胞和/或细胞系随后可被解冻并扩增。在一些实施方案中，所 述筛选的细胞系可被扩增至直到第5代(累计25次倍增），这样制成所述终产品(FP)，其中细 胞的质量被分析。质量控制(QC)可在生产过程中进行以确保所述终产品的一致性，纯度和 安全性。
[0134] 最终的核实步骤，以确认在最终的，大体上纯的成体心脏干细胞群中至少S0X17和 GATA4表达，有益于质量控制的目的以及确认所述终产品是根据本发明所述一大体上纯的 成体心脏干细胞群。
[0135] 本发明还延伸至通过本发明所述方法获得的或能够获得的成体心脏干细胞及一 大体上纯的成体心脏干细胞群。
[0136] 所述成体心脏干细胞群可被分离自任何本领域已知的适合的培养基。术语"培养 基"（culture medium ,medium)在被领域被承认，并通常指任何用于活细胞栽培的物质或制 剂。术语"培养基"，在被用在细胞培养相关的时候，包括细胞周围的环境组分。培养基可以 是固体，液体，气体或一种相与物质的混合物。培养基除了不支持细胞生长的液体培养基外 还包括液体生长培养基。培养基还包括凝胶培养基，如琼脂，琼脂糖，明胶和胶原基质。典型 的气体培养基包括生长在陪替式培养皿或其他固体或半固体支持物上的细胞被接触到的 气相。术语"培养基"还指意图用于细胞培养的材料，即使其还未与细胞接触。换句话说，一 种富有营养的准备用于细菌培养的液体就是一种培养基。类似地，一种与水或其他液体混 合后即变得适合用于细胞培养的粉状混合物可被称为"粉状培养基"。"限定培养基"指由化 学上限定的(通常是纯化过的）组分组成的培养基。"限定培养基"不包含成分基本没有阐明 的生物提取物，如酵母提取物和牛肉汤。"富集培养基"包括了设计为支持某一特别物种中 大部分或全部活体形式生长的培养基。富集培养基常包括复杂的生物提取物。"适于高密度 培养物生长的培养基"是指当其他条件(如温度和氧气传输率)允许这种生长时任何允许细 胞培养物达到数值为3或更大的0D600值的培养基。术语"基础培养基"指一种促进多类无需 任何特殊营养添加成分的微生物的生长的培养基。大多数基础培养基通常包括四组基础化 学物质：氨基酸，碳水化合物，无机盐和维生素。基础培养基通常作为更加复杂的培养基的 基础，在所述更加复杂的培养基中还要添加诸如血清，缓冲液，生长因子之类的添加成分。 一方面，所述生长培养基可以是一种复杂的培养基，含有必要的生长因子以支持本发明所 述细胞的生长和扩增而同时维持了其自我更新能力。基础培养基的实例包括，但不限于， Eagles基础培养基，Minimum基本培养基，Dulbecco ' s改进型Eagle培养基，培养基199，营养 混合物Ham's F-IO和Ham's F-12，McCoy's 5A，Dulbecco's MEM/F-12，RPMI 1640和 Iscove ' s改进型Dulbecco ' s培养基（IMDM)。
[0137] 在一优选的实施方案中，所述分离培养基包括EGF，bFGF，IGFII和ITS。所述分离培 养基可以进一步包括DMEM/F-12培养基，FBS，L-谷酰胺，青霉素-链霉素和/或hEPO。在一特 定的优选实施方案中，所述分离培养基包括以下特别指定浓度的组分中的一种或多种：
[0138] DMEM/F-12培养基，浓度为大约80-95%，例如85-90%，或86%，87%，88%或89% ;
[0139] 胎牛血清，浓度为大约5-15%，例如7-13%，8-12%或9%，10%，11%或12% ;
[0140] 青霉素-链霉素，浓度为大约0.5-2%，例如0.75-1.5%，0.8-1.2%或0.9%，1%或 1.1 %，或可选地浓度分别为l〇〇U/ml和100μg/ml;
[0141 ] bFGF，浓度为大约5_15ng/ml，7_13ng/ml，8_12ng/ml或9ng/ml，10ng/ml，llng/ml 或12ng/ml;
[0142] EGF，浓度为大约 10-30mg/ml;
[0143] IGF II，浓度为大约20-40ng/ml;
[0144] ITS，浓度为大约 0 · 01-lx，例如 0 · 25-0 · 75x或 0 · 5x;和/或
[0145] hEPO,浓度为大0 ·0001-0 · 05U/ml，例如，0 · 001-0 · 01U/ml，0· 0025-0 ·0075U/ml或 0·004-0·006U/ml或0·005U/ml。
[0146] 在一特定的实施方案中，所述分离培养基包括DMEM/F-12培养基，胎牛血清，L-谷 酰胺，青霉素-链霉素，EGF，bFGF，IGFII，ITS和hEPO中的全部。
[0147] 所述成体心脏干细胞群可在任何本领域已知的合适的培养基中进行扩增。在一优 选实施方案中，所述扩增培养基包括EGF，bFGF，IGFII和ITS。所述扩增培养基可进一步包括 DMEM/F-12培养基，Neurobasal培养基，胎牛血清-ESCq，L-谷酰胺，青霉素-链霉素，B27，N2， 和/或β-巯基乙醇。
[0148] 在一特定的优选实施方案中，所述分离培养基包括以下特别指定浓度的组分中的 一种或多种：
[0149] DMEM/F-12培养基，浓度为大约40-50%，例如42-45%，或42%，43%，44%或45% ;
[0150] Neurobasal培养基，浓度为大约40-50%，例如42-45%或42,43%，44%或45% ;
[0151] FBS-ESCq，浓度为大约5-15%，例如7-13%，8%_12%或9%，10%，，11%或 12% ;
[0152] L-谷酰胺，浓度为大约0.，例如，1.5mM-2.5mM或2mM;
[0153] 青霉素-链霉素，浓度为大约0.5-2%，例如0.75%-1.5%，0.8%-1.2%，或0.9%， 1%，或1.1%，或可选地，浓度分别为100U/ml和100μg/ml ;
[0154] β-巯基乙醇，浓度为大约 40-60μΜ，例如 45-55μΜ，47-52μΜ 或 50μΜ;
[0155] Β27，浓度为大约 0 · Ol-Ix，例如 0 · 25-0 · 75χ或 0 · 5χ;
[0156] Ν2，浓度为大约 0· Ol-Ix，例如 0.25-0 ·75χ或 0·5χ;
[0157] bFGF，浓度为大约5_15ng/ml，7_13ng/ml，8%_12ng/ml或9ng/ml，10ng/ml，ling/ ml 或12ng/ml;
[0158] EGF，浓度为大约 10-30mg/ml;
[0159] IGF II，浓度为大约20-40ng/ml;和/或
[0160] ITS，浓度为大约 0.01-lx，例如 0.25-0.75xS0.5x。
[0161] 在一特定的实施方案中，所述扩增培养基包括DMEM/F-12培养基，Neurobasal培养 基，FBS-ESCq，L-谷酰胺，青霉素-链霉素，B27，N2，β-巯基乙醇，EGF，bFGF，IGFII和ITS中的 全部。
[0162] 上述限定的培养基用于心脏干细胞的分离和激增可导致产生少数具有本发明所 述成体心脏干细胞属性的细胞。然而，如Lauden等人所鉴定(Circulation Research(2012) DOI: 10.1161/CIRCRESAHA. 112.276501)，在缺少本发明所描述的筛选步骤时所述心脏干细 胞可能为0ct4和Nanog阳性，不像本发明所述细胞。因此，本发明所述筛选步骤有益于生产 一大群根据本发明所述成体心脏干细胞。
[0163] 本发明所述方法可在任何适合的有助于细胞生长的条件下实施。典型的培养条件 包括温度大约30-40°C，优选地大约35-38°(3,36-37.5°(3或大约37°(3。氧气从读可以从大约 1-5%，例如从大约2-4%或2.5-3.5%，或大约3%。
[0164] 处理方法，治疗用途及药学上可接受的组合物
[0165] 本发明所述成体心脏干细胞，包括通过本发明所描述的任何方法获得的或能够获 得的细胞，适用于治疗用途及治疗缺血性损伤和心血管疾病的方法，特别是细胞治疗法，包 括体内诱组织修复/再生的诱导。本发明所述成体心脏干细胞通常将以本发明所述一大体 上纯的成体心脏干细胞群的形式或以本发明所述一混合细胞群的形式被用于治疗方法和 治疗用途。
[0166] 因此本发明提供了治疗方法，包括将本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大 体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群对接受个体进行施用，并提供了本发 明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群在 治疗中的用途。
[0167] 特别地，本发明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发 明所述混合细胞群有益于治疗缺血性损伤和心血管疾病，如心肌梗塞，慢性缺血性心肌病， 心肌病和慢性心力衰竭。鉴于本发明所述细胞的免疫调控能力它们一般可用于治疗自身免 疫疾病，炎症过程，慢性溃疡和伤口愈