由人多能干细胞衍生内皮细胞的制作方法
【专利摘要】本发明部分地基于由人多能干细胞(hPSC)产生内中胚层前体细胞(EMPC)的化学上定义的方法。本发明进一步提供用于由EMPC或hPSC产生内皮细胞(EC)的方法。本发明还提供适用于由人多能干细胞衍生EMPC和EC的试剂和试剂盒。
【专利说明】由人多能干细胞衍生内皮细胞发明领域
[0001]本发明总体上涉及干细胞，并且更具体地说涉及由人多能干细胞衍生内中胚层前体细胞和内皮细胞的方法。
[0002]背景信息
[0003]人胚胎干细胞(ES)细胞为可分化成一大系列细胞类型的多能细胞。干细胞因两项重要特性而与其它细胞类型不同。首先，它们是能够通过细胞分裂、有时是在长期失活之后更新本身的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可被诱导变成具有特殊功能的组织-或器官-特异性细胞。在如肠和骨髓的一些器官中，干细胞有规律地分裂以修复并更换磨损或损坏的组织。然而，在如胰腺和心脏的其它器官中，干细胞仅在特殊条件下分裂。
[0004]在胚胎发育期间，干细胞由三种主要细胞群体:外胚层、中胚层和定形内胚层形成身体组织。中胚层产生血细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌及脂肪细胞。定形内胚层产生肝、胰腺和肺。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。
[0005]干细胞的潜在应用是制造用于医学疗法的细胞和组织。现今，捐赠的器官和组织经常用于更换患病或破坏的那些器官和组织。遗憾的是，需要移植物的人数远远超过可用于移植的器官数。干细胞提供用以治疗包括帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌萎缩性侧索硬化、脊髓损伤、烧伤、心脏病、糖尿病和关节炎的多种疾病、病状和障碍的更换细胞和组织的可再生来源的可能性。
[0006]内皮为内衬血管和淋巴管的内表面、从而在内腔中的循环血液或淋巴液与管壁的剩余部分之间形成界面的细胞薄层。血管疾病是大型和中型肌动脉的病理状态且因内皮细胞功能障碍而触发。由于如病原体的因子，氧化的LDL粒子及其它炎性刺激内皮细胞被激活且开始分泌细胞因子和趋化因子并在它们的表面上表达粘附分子。所述过程最终导致管壁增厚，从而形成由增殖平滑肌细胞、巨噬细胞和各种类型的淋巴细胞组成的斑块。所述斑块导致血流受阻，从而导致到达靶器官的氧和营养素的量减少。在最终阶段，斑块还可能破裂，从而导致形成凝块，且结果导致中风。需要用于血管疾病的新型治疗。本文提供一种用于产生可适用于治疗血管疾病的内中胚层前体细胞和内皮细胞的高纯度群体的方法。
[0007]发明概述
[0008]本发明部分地基于一种由人多能干细胞(hPSC)产生内中胚层前体细胞(EMPC)和内皮细胞(EC)的化学上定义的方法。本发明还提供适用于由人多能干细胞衍生内中胚层前体细胞和内皮细胞的试剂和试剂盒。
[0009]本发明提供通过用至少一种内中胚层诱导化合物处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物测定所述细胞来产生内中胚层前体细胞(EMPC)。本发明还提供使用新近发展的化学定向分化方法经由可将细胞扩增并冷冻保存的内中胚层阶段以稳健且可再现的方式由hPSC衍生内皮细胞(EC)的高纯度群体、同质群体。
[0010]在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内中胚层细胞(EMPC)的方法。所述方法包括用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。其它拮抗剂包括3F8、A1070722、AR-AO14418> B1、FRATide、10Z-Hymenialdsine、親红-3’ -月亏、坎帕罗酮(Kenpaullone)、L803、NSC693868、SB216763、SB415286、TC-G24、TCS202、TCS 21311 和 TWS119，全部经 GlaxoSmith Kline 购得。
[0011]一方面，所述hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。
[0012]一方面，所述内中胚层前体细胞标记物包括例如MIXL1、NODAL和BRACHYURY或其任意组合。
[0013]在一个实施方案中，本发明提供内中胚层前体细胞(EMPC)。所述受试EMPC通过用糖原合成酶激酶3 (GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞来产生。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时或12-36小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021且内中胚层标记物为Brachyury。
[0014]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内皮细胞(EC)的方法。所述方法包括用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC);通过针对内中胚层细胞标记物测定所处理的hPSC来鉴别内中胚层前体细胞(EMPC);用至少一种生长因子处理所述EMPC并针对内皮细胞标记物分析所述细胞。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时。在某些方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。另一方面，将EMPC用生长因子处理约72小时或约48-96小时。另一方面，生长因子可为bFGF、VEGF或BMP4或其任意组合。在一个优选方面，生长因子为bFGF和VEGF。
[0015]一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。
[0016]在所述方法的一方面，内中胚层细胞标记物可例如为MIXLl、NODAL、BRACHYURY或其任意组合。
[0017]在所述方法的另一方面，内皮细胞标记物可为VE Cadhedrin、PECAMl、ACE/CD143、MCAM/CD146、Clq R1/CD93、粘连蛋白-2/CD112、VE-钙粘蛋白(Cadherin)、PD-ECGF/ 胸苷磷酸化酶、CC趋化因子受体D6、足糖萼蛋白(Podocalyxin)、CD31/PECAM-1、平足蛋白(Podoplanin)、CD34、S1P1/EDG-1、CD36/SR-B3、S1P2/EDG-5、CD 151、S1P3/EDG-3、CD160、S1P4/EDG-6、CD300LG/N印mucin、S1P5/EDG-8、CL-KI/COLECIK E-选择素 /CD62E、CL-Pl/C0LEC12、E-选择素(CD62E)/P-选择素(CD62P)、凝血因子III/组织因子、P-选择素/CD62P、DC-SIGNR/CD299、SLAM/CD150、DCBLD2/ESDN、稳定素(Stabilin)_1、EMMPRIN/CD147、稳定素-2、内皮糖蛋白(Endoglin)/CD105、TEM7/PLXDC1、内皮粘蛋白(Endomucin)、TEM8/ANTX R1、内皮唾液酸蛋白(Endosialin)/CD248、血栓调节蛋白(Thrombomodulin)/BDCA-3、EPCR、THSD1、促红细胞生成素 R、Tie-2, ESAM、TNF RI/TNFRSF1A、FABP5/E-FABP、TNF RH/TNFRSF1B、FABP6、TRA-1-85/CD147、ICAM-1/CD54、TRAIL R1/TNFRSF10A、ICAM-2/CD102、TRAIL R2/TNFRSF10B、IL-1 R1、VCAM-1/CD106、IL-13 Ra 1、VE-他汀(Statin)、整联蛋白 a 4/CD49d、VEGF Rl/Flt-1、整联蛋白 a4Pl、VEGF R2/KDR/Flk_l、整联蛋白 a 4 β 7/LPAM-UVEGF R3/Flt_4、整联蛋白 β 2/CD18、VG5Q、KLF4、vWF_A2 和 LYVE-1 或其任意组合。在一个具体方面，内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl。
[0018]在另一实施方案中，本发明提供内皮细胞(EC)。受试EC通过用糖原合成酶激酶3 (GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC);通过针对内中胚层细胞标记物测定所处理的hPSC来鉴别内中胚层前体细胞(EMPC);用至少一种生长因子处理所述EMPC并且针对内皮细胞标记物分析所述细胞来产生。在某些方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理24小时并且将EMPC用生长因子处理72小时。在具体方面，GSK-3抑制剂为Chir99021并且生长因子为bFGF和VEGF。另一方面，内中胚层标记物为Brachyury并且内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl。
[0019]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于衍生EMPC的试剂盒。所述试剂盒可包括糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂、用于鉴别内中胚层前体细胞标记物的试剂和用于由hPSC产生EMPC的指导。一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。所述试剂盒可包括用于鉴别MIXLl、NODAL、BRACHYURY细胞标记物或其任意组合的试剂。
[0020]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内皮细胞(EC)的试剂盒。所述试剂盒包括糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂、用于鉴别内中胚层前体细胞标记物的试剂、生长因子、用于鉴别内皮细胞标记物的试剂和由hPSC产生内皮细胞的指导。一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。另一方面，生长因子为bFGF和VEGF。所述试剂盒可包括用于鉴别以下各项的试剂:END016、FoxA, GATAE, SMIP、Hex、P19和fcachyury内中胚层前体细胞标记物或其任意组合及 VE Cadhedrin, PECAMl、ACE/CD143、MCAM/CD146、Clq Rl/⑶93、粘连蛋白-2/⑶112、VE-钙粘蛋白、I3D-ECGF/胸苷磷酸化酶、CC趋化因子受体D6、足糖萼蛋白、CD31/PECAM-1、平足蛋白、CD34、S1P1/EDG-1、CD36/SR-B3、S1P2/EDG-5、CD151、S1P3/EDG-3、CD160、S1P4/EDG-6、CD300LG/N印mucin、S1P5/EDG-8、CL-KI/COLECIK E-选择素 /CD62E、CL-P1/C0LEC12、E-选择素(CD62E)/P_ 选择素(CD62P)、凝血因子 III/ 组织因子、P-选择素 /CD62P、DC-SIGNR/CD299、SLAM/CD150、DCBLD2/ESDN、稳定素-1、EMMPRIN/⑶147、稳定素-2、内皮糖蛋白/⑶105、TEM7/PLXDC1、内皮粘蛋白、TEM8/ANTXR1、内皮唾酸蛋白/CD248、血栓调节蛋白/^^六-34卩0?、1'肥01、促红细胞生成素1?、116-245六厘、丁, RI/TNFRSF1A、FABP5/E-FABP、TNF RII/TNFRSF1B、FABP6、TRA-1_85/CD147、ICAM_1/CD54、TRAILRl/TNFRSF10A、ICAM-2/CD102、TRAIL R2/TNFRSF10B、IL-1 R1、VCAM-1/CD106、IL-13 Ra 1、VE-他汀、整联蛋白 a 4/CD49d、VEGF Rl/Flt-1、整联蛋白 a 4β 1、VEGF R2/KDR/Flk_l、整联蛋白 a 4β 7/LPAM-l、VEGF R3/Flt_4、整联蛋白 β 2/CD18、VG5Q、KLF4、vWF_A2 和 LYVE-1内皮标记物或其任意组合。在优选方面，内中胚层标记物为Brachyury并且内皮标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl。
[0021]在另一实施方案中，本发明提供一种治疗血管疾病和病症的方法。所述方法包括将EMPC施用至患有血管疾病或病症的受试者。
[0022]在另一实施方案中，本发明提供一种治疗血管疾病和病症的方法。所述方法包括将EC施用至患有血管疾病或病症的受试者。
[0023]附图简述
[0024]图1描绘由hPSC衍生内皮细胞的方案。在阶段I期间，将未分化的无饲养物(feeder)的 hPSC 用 l)bFGF+BMP4 处理，2) bFGF+BMP4+VEGF 处理两天，3)Chir99021+bFGF+BMP4+VEGF 处理两天，4) Chir99021 处理一天，5) Chir99021 处理两天，或6) StemProhESC培养基处理两天。在阶段2期间，将所有细胞用bFGF+VEGF处理三天。在阶段I之后，针对Brachyury表达对细胞进行测定。在阶段2之后，针对VE-CAM和PECAMl表达对细胞进行测定。
[0025]图2为示出在用bFGF和VEGF处理3天之后通过RT-PCR针对CFH5、KDR、MIXL、0ct4、PECAMl、S0X2、T和VWF在阶段2之后细胞筛选的图。
[0026]发明详述
[0027]本发明部分地基于由人多能干细胞(hPSC)产生内中胚层前体细胞(EMPC)和内皮细胞(EC)的化学上定义的方法。本发明还提供适用于由人多能干细胞衍生内中胚层前体细胞和内皮细胞的试剂和试剂盒。
[0028]在描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为所述组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。
[0029]如在本说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the) ”包括复数对象。因此，例如“所述方法”的引用包括一种或多种方法、和/或本文所描述的类型的步骤，在阅读完本公开等之后，这对本领域技术人员而言将变得显而易见。
[0030]除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
[0031]本发明提供通过用至少一种内中胚层前体细胞诱导化合物处理hPSC并且针对内中胚层前体细胞标记物测定所述细胞来衍生内中胚层前体细胞(EMPC)。本发明还提供使用新近发展的化学定向分化方法通过可将细胞扩增并冷冻保存的稳定EMPC阶段以稳健且可再现的方式由hPSC衍生内皮细胞(EC)的高纯度同质群体。
[0032]由包括但不限于人类胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hPSC)、诱导的多能干细胞(iPSC)的人多能干细胞(hPSC)产生内中胚层前体细胞(EMPC)是用于治疗血管疾病的基于细胞的策略的重要组成部分。然而，在hPSC衍生的EMPC可以治疗形态施用之前，必须发展可再现地且稳健地诱导EMPC产生的化学上定义的培养条件。在此，将小分子Chir99021(即糖原合成酶激酶3(GSK-3)的报道抑制剂)鉴别为内中胚层前体细胞诱导化合物且用于发展化学上定义的分化方法以使hPSC分化成EMPC。鉴别了两种生长因子:bFGF和VEGF，其诱导EMPC分化成EC。在本文中报道的化学方法提供用于由hPSC产生可用于血管疾病细胞疗法或药物发现的内皮细胞的说明书。
[0033]在本文中报道的化学方法提供由hPSC产生EMPC的同质群体，所述EMPC可进一步分化成成熟的内皮细胞(EC)以用于细胞疗法或药物发现。
[0034]由包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)、诱导的多能干细胞(iPSC)的人多能干细胞(hPSC)产生EMPC和EC是用于治疗血管疾病的基于细胞的策略的重要组成部分。然而，在hPSC衍生的EMPC和EC可以治疗形态施用之前，必须发展可再现地且稳健地诱导内皮细胞分化的化学上定义的培养条件。
[0035]本文所描述的衍生内中胚层前体细胞(EMPC)、内皮细胞(EC)和所产生的细胞的方法由如胚胎干细胞的人多能干细胞(hPSC)产生。如本文所用，“胚胎”是指生物体以单个受精卵开始并且以不再包含除发育的配子细胞外的多能或全能细胞的多细胞结构结束的发育阶段范围。除了通过配子融合衍生的胚胎外，术语“胚胎”还指通过体细胞核移植衍生的胚胎。可使用本领域已知的方法在无实质性分化的情况下将人干细胞在培养物中维持处于多能态。所述方法描述于例如美国专利号5，453，357,5, 670，372,5, 690，926,5, 843，780、6，200，806和6，251，671中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0036]如本文所用，“多潜能(multipotent) ”或“多潜能细胞”是指可产生有限数量的其它特定细胞类型的细胞类型。多能细胞的实例包括外胚层细胞、内胚层细胞、中胚层细胞和神经干细胞，它们可产生有限数量的其它细胞。
[0037]如本文所用，“多能细胞”是指可在体外以未分化状态维持延长的、理论上无限时间的细胞，其可产生不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层。人多能干细胞(hPSC)包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。获得所述hPSC的方法是在本领域中熟知的。
[0038]一种获得hPSC的方法是通过孤雌生殖。“孤雌生殖”(“以孤雌生殖方式激活(parthenogenically activated) ” 和“以孤雌生殖方式激活(parthenogeneticallyactivated)”在本文可互换使用)是指通过其在不存在精子穿入下发生卵母细胞激活的过程，并且是指包含滋养外胚层和通过激活包含所有雌性来源的DNA的卵母细胞或胚胎细胞(例如卵裂球)而获得的内细胞团的早期胚胎的发育。在一个相关的方面，“孤雌生殖体”是指通过所述激活而获得的所产生的细胞。在另一个相关方面，“囊胚”是指受精的或激活的卵母细胞的卵裂期，所述卵母细胞包含由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)构成的细胞空心球。在另一相关方面，“囊胚形成”是指在卵母细胞受精或激活之后的过程，在这个过程中卵母细胞随后在培养基中培养一段时间(例如，5-6天)，以使得它能够发育成为由外滋养层细胞和ICM构成的细胞空心球。
[0039]获得hPSC的另一种方法是通过核移植。如本文所用，“核移植”是指将供体细胞或来自供体细胞的DNA融合或移植至通常是相同或不同物种的卵母细胞的合适受体细胞中，将所述受体细胞在移植或融合之前、同时或之后进行处理以除去其内源核DNA或使其内源核DNA失活。用于核移植的供体细胞包括胚胎细胞和分化的细胞，例如体细胞和生殖细胞。所述供体细胞可处于增殖细胞周期(G1、G2、S或M)中或为非增殖(G0或静止)的。优选地，供体细胞或来自供体细胞的DNA来源于增殖哺乳动物细胞培养物，例如成纤维细胞培养物。所述供体细胞任选地可为转基因的，即，其可包含一处或多处基因添加、替换或缺失修饰。
[0040]获得hPSC的另一种方法是通过细胞重编程以获得诱导的多能干细胞。Takahashi等人(Cell 131,861-872(2007))已经公开了用于在不使用任何胚胎或ES (胚胎干)细胞的情况下重编程分化细胞并且形成具有与ES细胞类似的多能性和生长能力的可诱导的多能干细胞的方法。Takahashi等人描述用于分化的成纤维细胞的各种不同的核重编程因子，其包括以下四种基因的产物:Oct家族基因；Sox家族基因；Klf家族基因JPMyc家族基因。
[0041]细胞的多能状态优选通过在适当条件下培养细胞，例如通过在成纤维细胞饲养层或另一饲养层或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)上培养来维持。所述培养细胞的多能状态可通过以下各种方法来确认，例如，(i)确认多能细胞的标记物特征的表达；(ii)将细胞注入动物(例如SCID小鼠)中，其中在体内产生不同分化细胞类型；以及(iii)观察细胞(例如，在不存在饲养层或LIF的情况下培养时)体外分化成类胚体和其它分化的细胞类型。
[0042]本发明中所使用的细胞的多能状态可通过不同方法来确认。例如，可测试所述细胞存在或不存在特征性ES细胞标记物。在人ES细胞的情况下，所述标记物的实例是上文所确定的，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT 4，并且在本领域中是已知的。
[0043]多能性还可通过将所述细胞注入合适动物(例如SCID小鼠)中并且观察分化的细胞和组织的产生来确认。确认多能性的又一种方法是使用受试多能细胞来产生嵌合体动物并且观察所引入的细胞对不同细胞类型的作用。
[0044]确认多能性的又一种方法是观察ES细胞当在有利于分化的条件(例如，除去成纤维细胞饲养层)下培养时分化成类胚体和其它分化的细胞类型。这种方法已被利用并且已经确认受试多能细胞在组织培养中产生类胚体和不同的分化的细胞类型。
[0045]所得多能细胞和细胞系、优选人多能细胞和细胞系具有众多治疗和诊断应用。所述多能细胞可在众多疾病情况的治疗中用于细胞移植疗法或基因疗法(如果是基因修饰的)。
[0046]人多能干细胞(hPSC)包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)、诱导的多能干细胞(iPSC)和由所述细胞产生的细胞系。hPSC通过常规传代在培养物中维持多能状态，直至需要衍生内中胚层前体细胞。
[0047]“EMPC”(还被称为“多能内中胚层细胞”)表现出一种或多种以下性质:1)表达MIXLUN0DAL和/或BRACHYURY ；2)能够分化成中胚层和内胚层细胞谱系；和3)对于EMPC来说典型的形态特征。
[0048]EMPC为产生包括中胚层和内胚层的主要细胞表型的细胞的多潜能细胞。
[0049]内中胚层为尚未分化成中胚层和内胚层、但注定产生所述两者的胚胎卵裂球或细胞层。细胞层的最里面由囊胚的内细胞团的胚盘发育。内胚层产生气管、支气管、肺、胃肠道、肝、胰腺、膀胱、肛管、咽、甲状腺、鼓室、扁桃体和甲状旁腺的上皮。内胚层因此包括空腔的内衬和身体的通道及大多数内脏器官的覆盖层。中胚层为位于外胚层与内胚层之间、胚胎的三个原始胚层的中间；由其衍生结缔组织、骨、软骨、肌肉、血液和血管、淋巴腺、淋巴器官、脊索、胸膜、心包膜、腹膜、肾和生殖腺。中胚层产生血细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌及脂肪细胞。
[0050]内中胚层前体细胞可通过检测内中胚层前体细胞标记物的表达增加来鉴别，内中胚层前体细胞标记物包括但不限于:MIXL1、NODAL和Brachyury或其任意组合。
[0051]T-盒基因家族由共用独特DNA结合结构域的成员组成。最佳表征的T-盒(Tbx)基因、Brachyury或T编码在早期脊椎动物发育中起重要作用的转录因子。Tbx基因为具有近来在无脊椎动物和脊椎动物中鉴别的多于20种成员的发育调控因子家族。已发现Tbx基因中的突变导致几种人疾病。Tbx产物的功能机制的了解主要来自原型T/Brachyury蛋白，所述蛋白质为转录激活因子。T-结构域为最初限定在Brachyury中的高度保守的DNA-结合基序并且为转录因子的Tbx家族的特征。在中胚层的早期确定和分化中需要Brachyury。Brachyury对于所有脊椎动物中的后躯体的形成来说是必不可少的。已显示brachyury中的突变导致脊椎畸形。另外，brachyury的失调可涉及在脊索瘤(脊柱中的恶性肿瘤)的形成中。
[0052]本发明提供用于通过用至少一种内中胚层前体细胞诱导化合物处理hPSC并且针对内中胚层前体细胞标记物对所述细胞进行测定来衍生内中胚层前体细胞(EMPC)的方法。
[0053]如本文所用，“内中胚层细胞诱导化合物”为诱导hPSC变成EMPC的化合物。所述化合物包括但不限于糖原合成酶激酶3抑制剂。
[0054]糖原合成酶激酶3 (GSK-3)为介导磷酸盐分子加成到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。最初在1980年作为其同名物糖原合酶的调控激酶发现，GSK-3此后被鉴别为超过40种不同蛋白质以多种不同途径的激酶。在哺乳动物中，GSK-3由两种已知基因GSK-3a (GSK3A)和GSK-3 β (GSK3B)编码。GSK-3近来成为许多研究的主题，因为其牵涉在包括II型糖尿病(2型糖尿病)、阿尔茨海默氏病、炎症、癌症和双极性病症的许多疾病中。GSK-3在包括细胞增殖、迁移、炎症和免疫应答、葡萄糖调控和细胞凋亡的许多中心细胞内信号传导途径中具有活性。
[0055]可抑制GSK-3的化合物种类包括但不限马来酰亚胺衍生物、星形孢菌素(staurosporine)和有机金属抑制剂、卩引哚衍生物、paillone衍生物、卩比唑酰胺衍生物、喃唳和呋喃并喃唳衍生物、噻唑衍生物、卩比咯并B丫庚因(pyrroloazepine)、黄酮、苯并氮呼酮、双吲哚、吡咯并吡嗪、噻二唑烷酮、吡啶基噁二唑、氨基嘧啶、吡唑并喹喏啉、羟吲哚(吲哚酮)、噻唑、双吲哚基马来酰亚胺、氮杂吲哚基马来酰亚胺、芳基吲哚马来酰亚胺、苯胺基马来酰亚胺、苯基氨基嘧啶、三唑、吡咯并嘧啶、吡唑并嘧啶和氯甲基二噻吩基甲酮。
[0056]具体的GSK-3抑制剂包括但限于氯化锂、Hymenialdisine、夫拉平度(Flavopiridol)、坎帕罗酮、阿司特帕罗酮(Alsterpaullone)、氮杂坎帕罗酮(Azakenpaullone)、靛红-30-厢、6-溴靛红-30-厢(B1)、6_溴靛红-30-丙酮厢、AloisineA,Aloisine B、TDZD8、化合物12、吡唑并吡啶18、吡唑并吡啶9、吡唑并吡啶34、CHIR98014、CHIR99021(CT99021), CT20026、化合物 1、SU9516、ARA014418、星形孢菌素、化合物 5a、化合物29、化合物46、GF109203x(双吲哚基马来酰亚胺I)、Ro318220 (双吲哚基马来酰亚胺IX)、SB216763、SB415286、15、CGP60474、化合物 8b、TWSl 19、化合物 1A、化合物 17、锂原子(与Mg2C竞争)、铍原子(与Mg2C和ATP竞争)和锌原子(非竞争性)。
[0057]Chir99021 (6- [ [2- [ [4- (2，4- 二氯苯基)~5~ (5~ 甲基-1H-咪唑-2-基)~2~ 嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-卩比唳甲腈)(Tocris, Bristol, United Kingdom)为糖原合成酶激酶3(GSK-3)的有效且高选择性抑制剂(对于GSK-3 0和GSK-3 α来说，IC50值分别为6.7ηΜ和10 ηΜ)。相对于密切相关的激酶，所述化合物对GSK-3表现出>500倍的选择性；并且，还针对45种其它酶和受体表现出>800倍的选择性。与反苯环丙胺(tranylcypromine)组合，Chir99021能够将仅通过0ct4和Klf4转导的小鼠胚胎成纤维细胞重编程成iPSC。所述化合物在与H) 0325901组合使用时还增强小鼠和人ESC自更新。
[0058]本发明包括呈盐形式(包括酸加成盐)的Chir99021。合适的盐包括与有机酸和无机酸两者形成的那些盐。所述酸加成盐通常将是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的盐可用于所讨论化合物的制备和纯化。也可形成碱加成盐且其是药学上可接受的。有关盐的制备和选择的更全面论述，参考Pharmaceutical Salts !Properties, Select1n, andUse (药物盐:性质、选择和用途)(Stahl, P.Heinrich.ffiley-VCHA, Zurich, Switzerland, 2
002)。
[0059]本发明还包括Chir99021的类似物。在本文中使用的术语“类似物”为在结构上与另一化合物类似、但在组成上稍微不同的化合物(如由不同元素的原子置换一个原子或在特定官能团存在下)。
[0060]在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内中胚层细胞(EMPC)的方法。所述方法包括用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时或12-36小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。
[0061]一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。
[0062]一方面，内中胚层前体细胞标记物包括MIXLl、N0DAL和Brachyury或其任意组合。
[0063]自hPSC衍生的EMPC可使用本领域的技术人员熟知的方法容易地鉴别。这些方法包括使用免疫组织化学、FACS分析和RNA表达水平的测量来鉴别内中胚层前体细胞标记物。
[0064]在一个实施方案中，本发明提供内中胚层前体细胞(EMPC)。受试EMPC通过用糖原合成酶激酶3 (GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞来产生。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021并且内中胚层标记物为Brachyury。
[0065]一旦衍生了 EMPC，就应该将细胞使用或冷冻保存，从而保留分化成其它中胚层和内胚层细胞类型的能力。如在实施例中所示，GSK-3抑制剂Chir99021被鉴别为诱导hPSC分化成EMPC。hPSC衍生的EMPC群体对Brachyury、MIXLl和NODAL细胞标记物呈阳性。这些EMPC适合于进一步扩增、冷冻保存和分化，从而使它们成为EC的实用来源。如此，本发明证明了由hPSC产生EMPC的所公开的方法。
[0066]本发明还提供在限定的化学条件下由hPSC产生内皮细胞(EC)。
[0067]如本文所用，“分化”是指细胞中发生的改变从而致使那些细胞呈现某些特定功能并且失去改变为某些其它特定功能单元的能力。能够分化的细胞可为全能细胞、多能细胞或多潜能细胞中的任一种。相对于成熟的成人细胞而言，分化可以是部分的或完全的。
[0068]“分化的细胞”是指拥有特定的分化的(即非胚胎的)状态的非胚胎细胞。三种最早分化的细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。
[0069]自hPSC衍生的EMPC为多潜能的并且可分化成包括内皮细胞的几种细胞类型。
[0070]内皮细胞包含内皮。内皮为内衬血管和淋巴管的内表面、从而在内腔中的循环血液或淋巴液与管壁的剩余部分之间形成界面的细胞薄层。形成内皮的细胞被称为内皮细胞。与血液直接接触的内皮细胞被称为血管内皮细胞，而与淋巴液直接接触的那些内皮细胞被称为淋巴内皮细胞。
[0071]内皮细胞内衬所有血管的内部，从而构成内皮。所有内皮细胞均衍生自常见的成血管细胞前体并且随后发展器官特异性性质。胚胎内皮细胞在器官内和器官之间表现出很多异质性。内皮细胞的分化受包括直接微环境、与周围细胞的相互作用以及细胞因子和生长因子的局部释放的许多因素影响。成人内皮细胞保留显著的可塑性并且已知响应于IL-U TNF、VEGF和FGF而重编程。因为内皮细胞提供许多必要的功能，所以内皮功能障碍导致血管疾病并且可促进如动脉粥样硬化的慢性炎性病状的发展。
[0072]血管内皮细胞内衬从心脏至最小毛细管的整个循环系统。这些细胞具有对血管生物学来说极其重要的非常不同且独特的功能。这些功能包括如肾的肾小球中的流体过滤、血管张力(blood vessel tone)、止血、中性粒细胞补充和激素运输。心室的内表面的内皮被称作心内膜。
[0073]本发明提供用于由EMPC分化EC的方法。
[0074]在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生内皮细胞(EC)的方法。所述方法包括用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC);通过针对内中胚层细胞标记物测定所处理的hPSC来鉴别内中胚层前体细胞(EMPC);用至少一种生长因子处理所述EMPC并且针对内皮细胞标记物分析所述细胞。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理24小时。在某些方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。另一方面，将EMPC用生长因子处理约48-96小时，优选约72小时。另一方面，生长因子可为bFGF、VEGF或BMP4或其任意组合。在一个优选方面，生长因子为bFGF和VEGF。
[0075]一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。
[0076]在所述方法的一方面，内中胚层细胞标记物可为END016、FoxA、GATAE、SMIP、Hex、P19和Brachyury或其任意组合。
[0077]在所述方法的另一方面，内皮细胞标记物可为VE Cadhedrin、PECAMl、ACE/CD143、MCAM/CD146、Clq R1/CD93、粘连蛋白-2/CD112、VE-钙粘蛋白、PD-ECGF/ 胸苷磷酸化酶、CC趋化因子受体D6、足糖萼蛋白、CD31/PECAM-1、平足蛋白、CD34、S1P1/EDG-1、CD36/SR-B3、S1P2/EDG-5、CD151、S1P3/EDG-3、CD160、S1P4/EDG-6、CD300LG/N印mucin、S1P5/EDG-8、CL-K1/C0LEC11、E-选择素 /CD62E、CL_P1/C0LEC12、E-选择素(CD62E)/P-选择素(CD62P)、凝血因子 III/ 组织因子、P-选择素 /CD62P、DC-SIGNR/CD299、SLAM/CD150、DCBLD2/ESDN、稳定素-1、EMMPRIN/CD147、稳定素_2、内皮糖蛋白/CD105、TEM7/PLXDC1、内皮粘蛋白、TEM8/ANTXR1、内皮唾液酸蛋白/CD248、血栓调节蛋白/BDCA-3、EPCR、THSDl、促红细胞生成素 R、Tie-2、ESAM、TNF RI/TNFRSF1A、FABP5/E-FABP、TNF RII/TNFRSFIB,FABP6,TRA-1-85/CD147、 ICAM-1/CD54、 TRAIL R1/TNFRSF10A、 ICAM-2/CD102、 TRAIL R2/TNFRSF10B、 IL-1R1、VCAM-1/CD106、IL-13 Ra 1、VE-他汀、整联蛋白 a 4/CD49d、VEGF Rl/Flt-1、整联蛋白 a 4β 1、VEGF R2/KDR/Flk_l、整联蛋白 a 4β 7/LPAM-l、VEGF R3/Flt_4、整联蛋白 β 2/rai8、VG5Q、KLF4、vWF-A2和LYVE-1或其任意组合。在一个具体方面，内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl或其任意组合。
[0078]生长因子为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的天然存在的物质。通常，其为蛋白质和类固醇激素。生长因子对于调控多种细胞过程来说是重要的。生长因子通常充当细胞之间的信号传导分子。实例为与其靶细胞表面上的特异性受体结合的细胞因子和激素。它们经常促进细胞分化和成熟，其在生长因子之间不同。例如，骨形态发生蛋白质刺激骨细胞分化，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。生长因子和生长因子家族的实例包括但不限于:肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系源性神经营养性因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行因子、肌生长抑制素(⑶F-8)、神经生长因子(NGF)及其它神经营养蛋白、血小板源性生长因子(TOGF)、促血小板生成素(TPO)、α转化生长因子(TGF-α)、β转化生长因子(TGF-β)、α肿瘤坏死因子(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号传导途径、胎盘生长因子(PlGF)、胎牛生长激素(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL_7、bFGF 和VEGF0
[0079]在另一实施方案中，本发明提供内皮细胞(EC)。受试EC通过用糖原合成酶激酶3 (GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC);通过针对内中胚层细胞标记物测定所处理过的hPSC来鉴别内中胚层前体细胞(EMPC);用至少一种生长因子处理所述EMPC并且针对内皮细胞标记物分析所述细胞来产生。在某些方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理24小时并且将EMPC用生长因子处理72小时。在具体方面，GSK-3抑制剂为Chir99021并且生长因子为bFGF和VEGF。另一方面，内中胚层标记物为Brachyury并且内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl。
[0080]如在实施例中所示，所公开的方法促成完全功能内皮细胞的产生。EC通过用Chir99021处理hPSC、通过测定Brachyury表达来鉴别EMPC、用bFGF和VEGF处理EMPC并且测定VE钙粘蛋白和PECAMl表达来产生。如通过RT-PCR和免疫荧光所测量，所产生的EC细胞表达VE钙粘蛋白和PE CAMl0另外，在matrigel涂布板上生长彡6代的hPSC衍生的EC继续表达VE-钙粘蛋白和PECAM1。这证明使用所公开的方法由hPSC产生内皮细胞。
[0081]EMPC和EC可在血管疾病和病症的治疗中起重要作用。内皮功能障碍或适当内皮功能的损失为血管疾病的标志，并且经常被视为动脉粥样硬化发展中的关键早期事件。导致高血压和血栓形成的内皮功能受损常常在患有冠状动脉疾病、糖尿病、高血压、高胆固醇血症的患者中以及在吸烟者中见到。还显示内皮功能障碍预示着未来不利的心血管事件，并且其还存在于如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的炎性疾病中。内皮功能障碍的主要机制之一为氧化氮减少，这常归因于高水平的不对称二甲基精氨酸，其干扰正常的L-精氨酸-刺激的氧化氮合成且因此导致高血压。内皮功能障碍的最主要的机制为反应性氧种类增加，其可通过几种机制损害氧化氮产生和活性。信号传导蛋白ERK5对于维持正常内皮细胞功能来说是必不可少的。损害内皮的另一结果是释放病理量的血管性血友病(vonffillebrand)因子，这促进血小板聚集和粘附至内皮下膜，并且因此形成潜在致命血栓。
[0082]血管疾病为大型和中型肌动脉的病理状态且因内皮细胞功能障碍而触发。由于如病原体的因子，氧化的LDL粒子及其它炎性刺激内皮细胞被激活。这导致它们的特性改变:内皮细胞开始分泌细胞因子和趋化因子并且在其表面上表达粘附分子。这进而引起白细胞(单核细胞和淋巴细胞)募集，所述白细胞可穿透血管壁。用由内皮细胞和募集的白细胞产生的细胞因子剌激平滑肌细胞层导致平滑肌细胞增殖并向血管内腔迁移。所述过程导致管壁增厚，从而形成由增殖平滑肌细胞、巨噬细胞和不同类型的淋巴细胞组成的斑块。所述斑块导致血流受阻，从而导致到达靶器官的氧和营养素的量减少。在最后阶段，所述斑块还可能破裂，从而导致形成凝块，且结果引起中风。
[0083]在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗血管疾病和病症的方法。所述方法包括将EMPC施用至患有血管疾病或病症的受试者。
[0084]在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗血管疾病和病症的方法。所述方法包括将EC施用至患有血管疾病或病症的受试者。
[0085]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于衍生EMPC的试剂盒。所述试剂盒可包括糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂、用于鉴别内中胚层前体细胞标记物的试剂和用于由hPSC产生EMPC的指导。一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。所述试剂盒可包括用于鉴别以下各项的试剂:END016、FoxA, GATAE, SMIP、Hex、P19和fcachyury内中胚层前体细胞标记物或其任意组合。
[0086]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内皮细胞(EC)的试剂盒。所述试剂盒包括糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂、用于鉴别内中胚层前体细胞标记物的试剂、生长因子、用于鉴别内皮细胞标记物的试剂和用于由hPSC产生内皮细胞的指导。一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。另一方面，生长因子为bFGF和VEGF。所述试剂盒可包括用于鉴别以下各项的试剂:END016、FoxA、GATAE、SMIP、Hex、P19和fcachyury内中胚层前体细胞标示物或其任意组合以及VE钙粘蛋白、PECAMUACE/⑶143、MCAM/⑶146、ClqRl/⑶93、粘连蛋白-2/⑶112、VE-钙粘蛋白、PD-ECGF/胸苷磷酸化酶、CC趋化因子受体D6、足糖萼蛋白、CD31 /PECAM-1、平足蛋白、CD34、S1P1 /EDG-1、CD36/SR-B3、S1P2/EDG-5、CD 151、S1P3/EDG-3、CD160、S1P4/EDG-6、CD300LG/N印mucin、S1P5/EDG-8、CL-KI/COLECIK E-选择素 /CD62E、CL-P1/C0LEC12、E-选择素(CD62E)/P_ 选择素(CD62P)、凝血因子 III/ 组织因子、P-选择素 /CD62P、DC-SIGNR/CD299、SLAM/CD150、DCBLD2/ESDN、稳定素-1、EMMPRIN/CD147、稳定素-2、内皮糖蛋白/CD105、TEM7/PLXDC1、内皮粘蛋白、TEM8/ANTXRl、内皮唾液酸蛋白/CD248、血栓调节蛋白/BDCA-3、EPCR、THSD1、促红细胞生成素R、Tie-2, ESAM、TNF RI/TNFRSF1A、FABP5/E-FABP、TNF RII/TNFRSF1B、FABP6、TRA-1-85/CD147、ICAM-1/CD54、TRAIL R1/TNFRSF10A、ICAM-2/CD102、TRAIL R2/TNFRSF10B、IL-1 R1、VCAM-1/CD106、IL-13 Ra 1、VE-他汀、整联蛋白 a 4/CD49d、VEGFRl/Flt_l、整联蛋白 α 4β UVEGF R2/KDR/Flk-1、整联蛋白 α 4β 7/LPAM-U VEGF R3/Flt_4、整联蛋白 β 2/CD18、VG5Q、KLF4、vWF_A2和LYVE-1内皮细胞标记物或其任意组合。
[0087]以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
[0088]实施例1
[0089]hPSC的饲养物牛长
[0090]将hPSC维持在以下胚胎干细胞培养基中的丝裂霉素-C失活的小鼠胚胎成纤维细胞(Millipore)饲养层上:敲除 DMEM/F12 (Life Technologies)、2 mML-谷氨酰胺(GlutaMax-1, Invitrogen)、0.ImMMEM 非必需氨基酸(Life Technology)、0.ImM β -疏基乙醇(Life Technologies)、青霉素 / 链霉素 / 两性霉素 B(100 U/ΙΟΟμ g/250ng) (MPB1medicals)和5ng/ml bFGF(Peprotech)。每5至7天用分散酶或胶原酶IV(两者均来自Life Technologies)是细胞传代,其中分流比为1:4或1:6。
[0091]实施例2
[0092]hPSC的无饲养物牛长
[0093]然后将hPSC转移至Matrigel(BD B1sciences)涂布板并且用以下 StemPro hESCSFM 培养基(Invitrogen)生长:具有 GlutaMAX、1XSTEMPR0 hESC SFM 生长补充物、1.8%牛血清白蛋白、8 ng/mL bFGF和0.1 mM 2-巯基乙醇的DMEM/F12。
[0094]实施例3
[0095]由hPSC衍牛内皮细朐
[0096]将在无饲养物培养条件下生长4代的hPSC细胞用Accutase(Sigma)解离并且接种至Matrigel涂布板中且用N2/B27培养基[具有GlutaMAX、IX N2/B27补充物的DMEM/F12 (Invitrogen)]生长，其中进行 6 种不同(阶段 I)的处理:(I)bFGF+BMP4 ; (2)bFGF+BMP4+VEGF,两天；(3) Chir99021+bFGF+BMP4+VEGF,两天；(4) Chir99021, 一天；(5)Chir99021，两天；和(6) Stempro hESC 培养基，两天，接着用 bFGF (50ng/mL)+VEGF (50ng/mL)(阶段2)处理3天[图1]。用Chir99021 (10 μ Μ)处理hPSCS细胞I天，诱导它们以便使其分化成表达Brachyury的内中胚层前体。如通过RT_PCR[图2]和免疫荧光所测量，将已经用Chir99021 (10 μ Μ)处理I天的hPSC(hPSC衍生的内中胚层前体)用N2B27+bFGF (50ng/ml) +VEGF (50ng/ml)进一步处理3天，使它们分化成表达VE-CAM和PECAMl的内皮细胞。
[0097]实施例4
[0098]自hPSC衍生的内皮细胞的扩增
[0099]自hPSC衍生的内皮细胞可用Accutase(Sigma)解离并使其在Matrigel涂布板上在N2B27培养基50ng/ml bFGF和50ng/ml VEGF中生长>6代。如通过免疫荧光所测量，第6代的hPSC-EC表达VE-钙粘蛋白和PECAM。
[0100]RT-PCR分析。来自各自具有约I百万个细胞的至少三份样品的总RNA使用QIAsymphony自动纯化系统或RNeasy Plus微型试剂盒根据制造商的说明书(Qiagen)分离。将总RNA用于使用iScript cDNA合成试剂盒(B1rad)和Px2热循环仪(ThermoScientific)逆转录。为了分析基因表达，使用l/25-th的cDNA/反应和QuantiTect引物测定及Quantitest SYBR Green主混合物(Qiagen) —式两份地进行PCR反应。使用Rotor-Gene Q(Qiagen)在95°C下进行qPCR 5分钟，在92°C下进行qPCR 5秒且在60°C下进行qPCR 20秒，循环37次，接着熔融以检查扩增子在每步骤升高IV从50°C升至99°C情况下的特异性。针对标准曲线进行相对量化，并且将量化值针对通过PPIG测定的输入值标准化。用于所述分析的引物在补充表SI中列出。结果呈现为平均值土s.e.m.，并且使用95%的置信水平(α = 0.05)用双尾学生t-检验进行统计分析以用于比较两组或使用单因子ANOVA用邓尼特(Dunnett)检验进行统计分析以针对对照比较多组，且P〈0.05被视为显著的。
[0101]免疫细胞化学。将每个样品约100，000个细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤，并且透化并在室温下在PBS中的0.3% Triton X_100、5%正常驴血清和1% BSA中封闭I小时。将细胞在4°C下在PBS中的0.3% Triton X_100、2% BSA中用第一抗体孵育过夜。将细胞用PBS洗涤三次并且在室温下在PBS中的0.3% TritonX-1OO,5%正常驴血清和1% BSA中用第二抗体孵育I小时。将细胞核用DAPI染色。
[0102]虽然已经参考以上实施例描述了本发明，但是应理解，修改和变化将涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求书限制。
【权利要求】
1.一种产生内中胚层前体细胞的方法，其包括: (a)用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC);以及 (b)针对内中胚层细胞标记物对所述细胞进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述hPSC用所述GSK-3抑制剂处理24小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述内中胚层前体细胞标记物选自由以下各项组成的组:MIXL1、NODAL和Brachyury或其任意组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述内中胚层前体细胞标记物为Brachyury。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述hPSC选自由以下各项组成的组:人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。
7.—种内中胚层前体细胞，其通过根据权利要求1所述的方法衍生。
8.根据权利要求7所述的内中胚层前体细胞，其中所述GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。
9.根据权利要求7所述的内中胚层前体细胞，其中所述内中胚层前体细胞标记物为Brachyury0
10.一种产生内皮细胞的方法，其包括: (a)用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)； (b)通过鉴别内中胚层细胞标记物来鉴别内中胚层前体细胞(EMPC)； (c)用至少一种生长因子处理所述EMPC;以及 (d)针对内皮细胞标记物对所述细胞进行分析。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述hPSC用所述GSK-3抑制剂处理24小时。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述内中胚层前体细胞标记物选自由以下各项组成的组:MIXL1、NODAL和Brachyury或其任意组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述内中胚层前体细胞标记物为Brachyury。
15.根据权利要求10所述的方法，其中将所述EMPC用所述生长因子处理72小时。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述生长因子选自由以下各项组成的组:bFGF、VEGF和BMP4或其任意组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生长因子为bFGF和VEGF。
18.根据权利要求10所述的方法,其中所述内胚层细胞标记物选自:VECadhedrin、PECAMl、ACE/CD143、MCAM/CD146、Clq R1/CD93、粘连蛋白 _2/CD112、VE_钙粘蛋白、PD-ECGF/胸苷磷酸化酶、CC趋化因子受体D6、足糖萼蛋白、⑶31/PECAM-1、平足蛋白、⑶34、SlPl/EDG-U CD36/SR-B3、S1P2/EDG-5、CD151、S1P3/EDG-3、CD160、S1P4/EDG-6、CD300LG/Nepmucin, S1P5/EDG-8、CL-KI/COLECIK E-选择素 /CD62E、CL-P1/C0LEC12、E-选择素(CD62E)/P-选择素(CD62P)、凝血因子 III/ 组织因子、P-选择素 /CD62P、DC_SIGNR/CD299、SLAM/CD150、DCBLD2/ESDN、稳定素-1、EM MPRIN/CD147、稳定素 _2、内皮糖蛋白 /CD105、TEM7/PLXDC1、内皮粘蛋白、TEM8/ANTXR1、内皮液唾酸蛋白/CD248、血栓调节蛋白/BDCA-3、EPCR、THSDl、促红细胞生成素 R、Tie-2、ESAM、TN F RI/TNFRSF1A、FABP5/E-FABP、TNF RH/TNFRSF1B、FABP6、TRA-1-85/CD147、ICAM-1/CD54、TRAIL R1/TNFRSF10A、ICAM-2/CD102、TRAIL R2/TNFRSF10B、IL-1R1、VCAM-1/CD106、IL_13Ra 1、VE-他汀、整联蛋白 a 4/CD49d、VEGF Rl/Flt-1、整联蛋白 a 4β UVEGF R2/KDR/Flk_l、整联蛋白 a 4 β 7/LPAM_l、VEGF R3/Flt-4、整联蛋白 β 2/CD18、VG5Q、KLF4、vWF_A2 和 LYVE-1 或其任意组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAM1。
20.一种内皮细胞，其通过根据权利要求10所述的方法产生。
21.根据权利要求20所述的内皮细胞，其中所述GSK-3抑制剂为Chir99021并且所述生长因子为bFGF和VEGF。
22.根据权利要求20所述的内皮细胞，其中所述内中胚层前体细胞标记物为Brachyury并且所述内皮细胞标记物为VE钙粘蛋白和PECAMl。
23.一种用于产生内中胚层前体的试剂盒，其包括: (a)糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂； (b)用于测定内中胚层前体细胞标记物的试剂；以及 (c)用于由hPSC衍生内中胚层前体细胞的指导。
24.一种用于产生内皮细胞的试剂盒，其包括: (a)糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂； (b)用于测定内中胚层前体细胞标记物的试剂； (c)至少一种生长因子； (d)用于测定内皮细胞标记物的试剂；以及 (e)用于由hPSC产生内皮细胞的指导。
【文档编号】C12N5/0789GK104302764SQ201380024629
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年5月1日 优先权日:2012年5月2日
【发明者】R·冈萨雷斯, I·加里陶南迪亚, R·斯莫切肯 申请人:国际干细胞公司