专利名称：一种分离细胞的方法及专用细胞分离液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。
背景技术：
干细胞(全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞)的出现与发展，极大地推动了细胞工程技术的进步。细胞治疗、疾病的细胞学诊断、细胞疫苗、细胞芯片、RNAi等现代生物技术已经逐步在细胞、机体及群体水平得到广泛应用，成为现代生物技术领域的重要组成部分。因而干细胞无论在基础理论研究和生产推广等方面都具有重要的作用和巨大的商业价值。
密度梯度离心分离不同体积大小、不同质量的细胞，使得不同类型的细胞得以分离和纯化，通过体外扩增、工程操作后应用于细胞转基因、疾病诊断、功能基因组学研究和细胞治疗等领域。目前比较流行的细胞分离液成分为蔗糖、聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll)和Percoll等分离液，主要用于分离XY精子、淋巴细胞、粒细胞等，同时也有人利用其分离不同分子质量的蛋白质，另外利用细胞分离液还可以大量获得有核细胞用于提取基因组和进行基因工程操作。细胞分离液的应用领域不断扩大，分离效果也不断提高，并为细胞工程和功能基因组学研究提供了行之有效的手段。
但现行的细胞分离液均存在着操作过程复杂、加样速度缓慢、不利于规模化细胞分离、特别是对初学者很难掌握等缺点，极大地影响了后续研究与推广应用工作。最为突出的表现是在分离细胞时，需缓慢加入分离样品，以防止细胞分离液液面的破坏。如果分离液液面被破坏，将不能进行细胞分离(因细胞悬液已经同分离液混合)。为了保证液面的完好，加样者需经过一定时间的训练，且需耐心操作，才能获得良好的效果，严重制约了大规模细胞分离的进行。
发明内容
本发明的目的是一种分离效率较高，可用于大规模细胞分离的细胞分离液。
本发明所提供的细胞分离液，是向常规细胞分离液中添加表面活性剂后得到的试剂。
所述常规细胞分离液可为任意一种市售或按常规方法配制的细胞分离液，如蔗糖溶液、淋巴细胞分离液、Ficoll、Percoll或Metrizamide等。
所添加的表面活性剂的选择是多种多样的，只要是具有下述物理化学性质的相关试剂即可密度小于1，不溶于水且对细胞没有任何不良影响。通过其与细胞分离液的动态固化作用，保证两者间分离液液面的稳定性，使细胞能够有效被分离。具体来讲，可用的表面活性剂为石蜡油、甘油三酯、磷脂、鞘酯中的一种或几种或性能和性质与它们相近或相似的其它成分。
所述表面活性剂同常规细胞分离液混合的体积比为0.1-10∶1。
此外，所述表面活性剂及相关成分还可用于动、植物分散细胞的分离、密度梯度离心液的配制等多个方面。
上述专用细胞分离液还可用于配制梯度分离液，方法为向上述专用分离液中加入密度相对较小的常规细胞分离液，短暂离心或静止停放大于1分钟后，便可进行细胞分离；还可以在此基础上再加入密度更小的常规细胞分离液，直至达到要求为止，以用于不同目的细胞、DNA或蛋白的分离。
上述细胞分离液需保存在4℃条件下，保存半年后，仍可获得较好的分离效果，细胞回收率可达75-85％，细胞活率＞95％，分离纯度＞95％。在长期运输或保存过程中可形成动态平衡界面，因此在使用前需要对分离液混合均匀，以便离心后重新构建稳定界面。
本发明的第二个目的是提供一种分离细胞的方法。
本发明所提供的分离细胞的方法，包括以下步骤1)取体积比为待分离细胞样品0.1-10∶1的专用细胞分离液，离心；2)将待分离细胞样品直接加入步骤1)经离心处理的专用细胞分离液中，离心3)收集云雾层中的单个细胞，洗涤，得到纯净细胞。
在上述细胞分离方法中，步骤1)中的离心条件为100-4000g，10秒-10分钟，优选为1000g，3分钟；步骤2)中的离心条件为200-10000g，10-30分钟，优选为1000g，20分钟。
本发明提供了一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。用本发明的细胞分离液在3天时间内完成了对近400个个体单核细胞的分离操作，获得了满意的实验效果，证明该细胞分离液可以大大缩短加样与细胞分离时间，简便了操作规程，适合于大规模的细胞分离，特别适用于没有相关操作经验的科技工作者使用，效果稳定、可靠，可以得到高纯度的目的细胞；此外，对于多个样品可以利用多道移液器进行加样，且分离细胞的活力不受任何影响。经分离的细胞可直接用于基因组提取、核型分析、细胞培养、传代培养、细胞转基因、细胞诱导分化、细胞治疗及抗病育种等研究，同时也可用于密度梯度分离液制备、不同质量分子或化合物的分离等用途。该细胞分离方法简单，可操作性强。本发明在细胞生物学、功能基因组学以及细胞工程领域具有较高的实际应用价值，市场前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为用本发明的细胞分离液对单个核细胞进行分离的示意2为对所分离的鸡单个核细胞进行吉姆萨(Giemsa)染色和CD14荧光标记抗体检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、细胞分离液的制备向Ficoll中添加体积百分比浓度为50％的石蜡油，得到细胞分离液。
实施例2、细胞分离液的制备先用常规方法使Percoll达到生理性渗透压，然后向其中添加体积百分比浓度为80％的甘油三酯，得到细胞分离液。如有需要，离心后，其它浓度的Percoll工作液可逐层按常速加入。
实施例3、细胞分离液的制备向Metrizamide中添加体积百分比浓度为500％磷脂，得到细胞分离液。
实施例4、鸡单核细胞的分离及分离细胞的体外培养与观察一、鸡单核细胞的分离取2倍于待分离样品(鸡外周血)体积、混合均匀的实施例1制备的细胞分离液于离心管中，1000g离心3分钟后，直接将样品加入，无须考虑液面的破坏(因稳定层位于两相之间)，然后1000g离心20分钟，分离过程如图1所示，在云雾层中分离单个核细胞，经过洗涤后既可得到纯净细胞。分离过程中，界面清晰，回收速度快，且单个核细胞的回收率可达75-85％，证明用本发明的细胞分离液可获得较好的细胞分离效果。
二、分离细胞的体外培养与观察对步骤一分离的鸡单个核细胞用常规的差速贴壁方法进行培养，在培养的第7天进行吉姆萨(Giemsa)染色和CD14荧光标记抗体(美国NeoMarkers公司)检测，检测结果如图2所示((a)为培养7天后单核细胞吉姆萨染色的结果，其中a-2是图片a-1方框部分的放大；(b)为培养7天后单核细胞的CD14间接免疫染色结果；(c)为CD14阳性对照间接免疫染色。b-1、c-1是显微镜明视场下所见的细胞，b-2、c-2为相应细胞在荧光显微镜下观察的结果。标尺为30μm)，检测结果表明所获得的单核细胞的纯度可达100％。
实施例5、人单核细胞的分离取0.1倍于待分离样品(人外周血)体积、混合均匀的实施例2制备的专用细胞分离液于离心管中，200g离心6分钟后，缓慢将样品加入，无须考虑液面的破坏(因稳定层位于两相之间)，然后2000g离心20分钟，分离过程如图1所示，在云雾层中分离单个核细胞，经过洗涤后既可得到纯净细胞。分离过程中，界面清晰，回收速度快，且单个核细胞的回收率可达80-90％，证明用本发明的专用细胞分离液可获得较好的细胞分离效果。
实施例6、牛单核细胞的分离取10倍于待分离样品(牛外周血)体积、混合均匀的实施例3制备的专用细胞分离液于离心管中，1000g离心3分钟后，快速将样品加入，无须考虑液面的破坏(因稳定层位于两相之间)，然后5000g离心10分钟，分离过程如图1所示，在云雾层中分离单个核细胞，经过洗涤后既可得到纯净细胞。分离过程中，界面清晰，回收速度快，且单个核细胞的回收率可达75-85％，证明用本发明的专用细胞分离液可获得较好的细胞分离效果。
权利要求
1.一种专用细胞分离液，是向常规细胞分离液中添加表面活性剂后得到的试剂。
2.根据权利要求1所述的专用细胞分离液，其特征在于所述常规细胞分离液为任意一种市售细胞分离液。
3.根据权利要求2所述的专用细胞分离液，其特征在于所述常规细胞分离液为蔗糖溶液、淋巴细胞分离液、Ficoll、Percoll或Metrizamide。
4.根据权利要求1所述专用细胞分离液，其特征在于所述表面活性剂的密度小于1，不溶于水。
5.根据权利要求4所述的专用细胞分离液，其特征在于所述表面活性剂为石蜡油、甘油三酯、磷脂或鞘酯中的一种或几种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的专用细胞分离液，其特征在于所述表面活性剂同常规细胞分离液混合的体积比为0.1-10∶1。
7.一种分离细胞的方法，包括以下步骤1)取体积是待分离细胞样品0.1-10倍的权利要求1所述的专用细胞分离液，离心；2)将待分离细胞样品直接加入步骤1)经离心处理的专用细胞分离液中，离心；3)收集云雾层中的单个细胞，洗涤，得到纯净细胞。
8.根据权利要求7所述的分离细胞的方法，其特征在于所述步骤1)中离心的条件为100-4000g，10秒-10分钟；步骤2)中的离心条件为200-10000g，10-30分钟。
9.根据权利要求8所述的分离细胞的方法，其特征在于所述步骤1)中离心的条件为1000g，3分钟；步骤2)中的离心条件为1000g，20分钟。
全文摘要
本发明公开了一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。该专用细胞分离液，是向常规细胞分离液中添加表面活性剂后得到的试剂。分离细胞的方法，包括以下步骤1)按照一定体积比将表面活性剂与现行细胞分离液混合，离心，得到专用细胞分离液；2)将待分离细胞样品直接加入步骤1)经离心后的专用细胞分离液中，离心3)收集云雾层中的细胞，洗涤，得到纯净细胞。本发明大大缩短加样与细胞分离时间，简便了操作规程，适合于大规模的细胞分离，效果稳定、可靠，可以得到高纯度的目的细胞。该细胞分离方法简单，可操作性强。本发明在细胞生物学、功能基因组学以及细胞工程等领域，具有较高的实际应用价值，市场前景广阔。
文档编号C12N5/08GK1793340SQ20051013032
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者连正兴, 李海, 李宁 申请人:中国农业大学