分离淋巴细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于分离淋巴细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，以达到最佳分离效果。在这段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涤从分离得至IJ的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。
[0003]而且目前的梯度离心分离方法步骤繁琐，技巧性较强，对操作者的经验要求比较高:梯度离心分离需要三步，尤其是第二步，要在高密度的分离液上小心翼翼的铺上低密度的细胞悬液而不能弄混界面，这极大的考验操作者的经验和耐心，费时费力，容易疲劳，而一旦弄混液面，分离效果将大受影响，甚至分离不出淋巴细胞层。而且目前的分离液多有一定的毒性，影响分离效果和分离后的细胞质量，导致分离效率较低。
[0004]因此，有必要提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的分离方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高分离效率、保证分离细胞的纯度和活性的分离淋巴细胞的分离方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下:
[0007]—方面，提供一种分离淋巴细胞的分离方法，包括如下步骤:
[0008]步骤1:将符合药用标准的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3?0.8重量份，泛影葡胺I?3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1?0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液；
[0009]步骤2:将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2;
[0010]步骤3:将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8_25°C，200g-800g，10?30111；[11条件下离心。
[0011]所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。
[0012]本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低;本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性;本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层;本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀;本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
[0013]进一步地，所述步骤I为:将符合药用标准的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份，聚二稀丙基二甲基氯化铵0.12?0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
[0014]优选地，所述步骤I为:将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。
[0015]进一步地，所述分离液的密度为1.070?1.09(^/0113，渗透压为275?300811101/1^，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp。
[0016]优选地，所述步骤I中的灭菌水为灭菌注射用水。
[00?7] 进一步地，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran7 O。
[0018]优选地，所述步骤I中的滤膜为灭菌的0.22μπι滤膜。
[0019]进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。
[0020]优选地，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
[0021]综上所述，本发明的有益效果表现为:
[0022]本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低;本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性;本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层;本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀。
【具体实施方式】
[0023]为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0024]实施例一
[0025]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.Sg，泛影葡胺Ig，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0026]实施例二
[0027]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐5g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0028]实施例三
[0029]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
3.5g，海藻糖3.5g，超低粘度海藻酸钠0.4g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0030]实施例四
[0031]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
4.5g，海藻糖2.5g，超低粘度海藻酸钠0.Sg，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0032]实施例五
[0033]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
3.6g，海藻糖3.3g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺2.2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.14g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0034]实施例六
[0035]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
4.2g，海藻糖2.Sg，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺1.Sg，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0036]实施例七
[0037]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
4.5g，海藻糖3.4g，超