低粘度海藻酸钠0.Sg，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0038]实施例八
[0039]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖3g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液lOOmL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0040]对比例一
[0041]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0042]对比例二
[0043]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酐
3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液I OOmL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0044]对比例三
[0045]在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的葡聚糖T500 20g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液lOOmL，再经过0.22μπι滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
[0046]对比例四
[0047]常规FicolI400分离液。
[0048]在上述实施例中，混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内:密度为1.070?1.090g/cm3，渗透压为275?300smol/kg，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp。对比例一至四的混合水溶液的主要特征参数均在以下范围内:密度为1.065?1.090g/cm3，渗透压为275?320smol/kg，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp。可以将本发明配制的分离液IC藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
[0049]为了验证本发明实施例一至八制备的分离液对淋巴细胞的分离效果，按照如下步骤对血液样品进行分离:
[0050]步骤1:将本发明制备的分离液加入离心管，所述分离液的体积不大于离心管体积的 1/2;
[0051]步骤2:将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8_25°C，200g-800g，10?30111；[11条件下离心。
[0052]上述样品的来源可以为外周血、脐带血或骨髓。
[0053]同时按照上述分离方法对对比例一至四的分离液对血液淋巴细胞的分离效果进行验证。结果表明实施例一至八的淋巴细胞分离率均在95%以上，纯度在93%以上，细胞存活率达到98%以上，而对比例一至四的淋巴细胞分离率均在89%以下，纯度低于90%，细胞存活率低于90%，而对比例2比对比例I的淋巴细胞分离率低40%。
[0054]将分离收获的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八分离而得的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明分离、培养获得的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了 15%，实施例八的效果尤其显著，提高了 18%。说明本发明用于分离淋巴细胞的分离液在分离淋巴细胞方面产生了意料不到的效果，是一种安全、有效的产品。
[0055]上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，I%的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
[0056]本发明使用右旋糖酐、海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵配制的分离液时，操作者可以直接将细胞悬浮液铺设在分离液上，铺设过程无须过多考虑液面的破坏，对操作者的操作经验要求较低;本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高并具有较好的杀肿瘤活性;本发明的组合物可配成生理溶液状态的分离介质，对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层;本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀;本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
[0057]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种分离淋巴细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:将符合药用标准的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3?0.8重量份，泛影葡胺I?3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1?0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液； 步骤2:将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2; 步骤3:将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在 8-25°(:，20(^-80(^，10?30111丨11条件下离心； 所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤I为:将符合药用标准的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12?0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述步骤I为:将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过超滤膜过滤除菌得到分离液。4.根据权利要求1至3任一所述的分离方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070?1.090g/cm3，渗透压为275?300smol/kg，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp05.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述步骤I中的灭菌水为灭菌注射用水。6.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述步骤I中的滤膜为灭菌的0.22ym滤膜。8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
【专利摘要】本发明公开了一种分离淋巴细胞的分离方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌水配制成100重量份的生理溶液，再经过滤膜过滤除菌得到分离液；将所述分离液加入离心管中，所述分离液的体积不大于离心管体积的1/2；将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心；所述样品的来源为外周血、脐带血或骨髓。本发明分离得到的淋巴细胞具有较好的杀肿瘤活性。
【IPC分类】C12N5/0783, C12N5/0781
【公开号】CN105567632
【申请号】CN201511031167
【发明人】宫喜魁, 李若鲲, 马艳, 马艳玲, 郝丽敏
【申请人】北京弘润天源生物技术股份有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月31日