一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用

一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及细胞培养领域，公开了一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用。其中该方法中采用添加细胞因子组合物的方法来实现更好的保存肿瘤浸润淋巴细胞和促进其T细胞低分化的表型的目的。与传统体外培养的抗肿瘤T细胞的方法相比，本发明的方法可以开创性地延缓体外肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的过程，并且低浓度的抗肿瘤T淋巴细胞在体外的临床前实验模型中显示了高效的抑瘤活性。本发明公开的方法，简单易行，成本低，效果更好，具有广阔的临床应用前景。
【专利说明】
一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润到肿瘤组织中的具有强大抗肿瘤活性的T细胞，其作用的原理是TIL表面表达有针对肿瘤多靶点抗原的抗肿瘤T细胞受体(TCR)，是一种非常强大的具有持久抗肿瘤效果的抗肿瘤制剂，已经广泛地应用于肿瘤的治疗上，并取得显著的治疗效果。但是，体外分离培养的TIL在体外的扩增过程中，存在着进行性分化、衰竭的不可逆转的老化进程，导致体外扩增的TIL回输到荷瘤体内不能长期存活，因此大大影响了抗肿瘤的效果。为了增强TIL在荷瘤体内的长期存活及实现持久高效的抗肿瘤效果，本发明利用细胞因子IL-7、IL-12及IL-21的组合，在TIL的体外培养扩增过程中，实现了逆转抗肿瘤TIL的体外衰竭进程，较传统的IL-2培养条件，表现为低分化即年轻的TIL表型:高表达CD62L、CD27、CD28、CD127膜表面分子，低表达T细胞活化衰竭的分子CD57及CD70。进一步研究发现，体外细胞因子组合逆转的TIL除了高度表达低分化的膜表面分子外，通过Real-Time PCR分析发现，干细胞因子S0X2、0CT4及NANOG的表达水平亦显著升高，同时，该逆转的TIL具有强大的抗肿瘤活性，表现为显著延缓荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长，是一种具有广泛临床应用前景的高效抗肿瘤制剂。
[0003]抗原特异性⑶8+T细胞可以用于治疗癌症和预防人类感染(Dudley ,Wunderlichet al.2005 ； Dudley ,Yang et al.2008； Rosenberg, Yang et al.2011)。过继性细胞治疗(ACT)采用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是目前治疗晚期转移性黑色素瘤患者最有效的免疫疗法，其抗肿瘤有效率高达 72 % (Dudley ,Wunderl ich et al.2005； Robbins ,Morgan etal.2011)。尽管通过抗肿瘤TCR的基因修饰可以使肿瘤患者来源的T细胞直接获得抗肿瘤的特性，但该种修饰方案获得的抗肿瘤T细胞局限于肿瘤表面地单一靶点，由于肿瘤存在抗原逃逸的机制，该疗法的有效性受到大大地限制。迄今，通过体外扩增的多靶点TIL因其具有抗肿瘤的多靶点的特性，其中不但包含了多种肿瘤抗原的谱系，还包含了未知的肿瘤特异性基因突变的肿瘤新抗原谱系，该类新抗原通常是导致肿瘤发生发展的致病基因，因此，针对该类肿瘤新抗原谱系的TIL是一种具有广阔临床应用前景的具有高效抗肿瘤效应的抗肿瘤细胞，且可以在产业化层面实现肿瘤治愈。
[0004]为了获得一定量的可以供临床应用的TIL细胞，通常需要数周乃至数月的培养时间，期间TIL细胞进行了一系列的体外过度分化及衰老的进程。在我们以前报道的方法中，通过⑶3抗体的激活及IL-2的体外培养，数周内可以生产大量(>1 X 112)抗肿瘤TILs细胞，但是在IL-2的培养条件下，该基因修饰的抗肿瘤T细胞仍进行了过度分化及衰老的进程。根据我们的经验及文献报道，体外培养的T细胞的分化及衰老表型可以通过培养时间、细胞因子的不同组合进行调控。细胞因子对体内T细胞记忆库的维持，包括长期记忆形成，在免疫反应中扮演着各种重要的角色，其中包括广泛应用于临床试验的体外抗肿瘤T细胞扩增的细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12，IL-15和IL-21。据报道，与IL-2体外培养的抗肿瘤T细胞相比，IL-12、IL-15、IL-7和IL-21可以保存和促进T细胞低分化的表型并延缓体外培养的抗肿瘤T细胞的衰老进程(Alves ,Arosa et al.2005 ；Melch1nda ,Fry et al.2005 ；Lee,Lee et al.2007；Markley and Sadelain 2010)。
[0005]IL-12由抗原激活的树突状细胞、巨噬细胞和人B淋巴母细胞合成及分泌。它是一种T细胞刺激因子，可增强IFN- γ和TNF-α的合成，并降低IL-4介导的抑制IFN- γ分泌效应，同时可以激活特异性抗肿瘤免疫反应及激活非特异性免疫反应，包括但不限于NK细胞的活化。据报道，IL-12可以选择性提高⑶8+/CD62L+high细胞的体外扩增，该类表型抗肿瘤T细胞在荷瘤小鼠模型上显示了高效的抗肿瘤活性(Diaz-Montero，E1 Naggar et al.2008) 0
[0006]综上所述，在前期的研究基础之上，本发明系统地分析了细胞因子及其组合对体外扩增的抗肿瘤TIL的增殖和分化及抗衰老的影响。本发明提出了一种细胞因子组合的配方以及细胞因子的添加顺序，实现了获得TIL体外的培养的的低分化及抗衰老的细胞因子配伍方案。同时，该逆转的TIL具有强大的抗肿瘤活性，表现为显著延缓荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长，是一种具有广泛临床应用前景的高效抗肿瘤制剂。

【发明内容】

[0007]本发明基于抗肿瘤T细胞在(包括TILs)体外培养扩增过程中所表现的快速终末分化及衰老的问题，发明了一种替代IL-2培养的细胞因子组合物培养方法。该发明旨在应用细胞因子组合物建立一种可以大量扩增抗肿瘤T细胞的一种临床应用方案，其特征包括保持抗肿瘤T细胞的低分化状态、达到可以临床应用的扩增倍数以及赋予抗肿瘤T细胞的体内的高效抗肿瘤活性。
[0008]附图1展示了不同细胞因子及其组合对体外培养的TIL促增殖分化示意图。如图所示，体外培养的抗肿瘤TIL在培养过程中，在IL-2存在的培养条件下，几周时间内，细胞从低分化(年轻状态)快速分化为具有体外强大杀伤肿瘤活性的终末效应细胞，该类细胞丧失了淋巴细胞归巢因子CD62L等膜分子的表达，尽管该类细胞体外具有强大的抗肿瘤活性，但在荷瘤临床前实验模型及患者体内缺表现为较低的抗瘤活性，即丧失了长期存活的特性及不能够迀移到淋巴结及肿瘤周围。另一方面，大量的体内外实验证实，其它细胞因子及其组合如IL-7，IL-12及IL-21却可以保持体外培养的T细胞处于低分化状态，表现为T细胞表面表达大量的淋巴细胞归巢因子CD62L，尽管体外的肿瘤杀伤活性下降，但在体内却具有超强的抗肿瘤活性。本示意图阐述了一种可能的抗肿瘤TIL的全新的培养方式，提出了替代IL-2的细胞因子培养条件，具有广泛的临床应用价值。
[0009]本发明的第一个方面提供一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法，包括如下步骤:
[0010]步骤1:肿瘤浸润淋巴细胞在无血清培养基的培养条件下，从接种开始计时，培养的前3天，添加细胞因子组合物进行培养；
[0011]步骤2:培养第3天后，细胞因子组合物中的细胞因子去除IL-12，继续培养至第6天，收集肿瘤浸润淋巴细胞；
[0012]所述的细胞因子组合物选自组合物1、组合物2或组合物3中的任意一种;所述组合物I为IL-2和IL-12;组合物2为IL-7和IL-12;组合物3为IL-12和IL-21。
[0013]优选地，上述的细胞因子组合物中IL-2浓度为45-150IU/ml。
[0014]更优选地，上述的细胞因子组合物中IL-2浓度为100IU/ml。
[0015]优选地，上述的细胞因子组合物中IL-12的浓度范围为0.01-1000ng/ml。
[0016]优选地，上述的细胞因子组合物中IL-7的浓度范围为0.01-1000ng/ml。
[0017]优选地，上述的细胞因子组合物中IL-21的浓度范围为0.01-1000ng/ml。
[0018]优选地，上述的步骤I中无血清培养基为ABl-V无血清培养基。
[0019]本发明的第二个方面公开了一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法在制备抗肿瘤治疗剂中的应用。
[0020]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
[0021]I)与传统体外培养的抗肿瘤T细胞的方法相比，本发明的方法可以更好的保存和促进T细胞低分化的表型。
[0022]2)与传统体外培养的抗肿瘤T细胞的方法相比，本发明的方法开创性的逆转体外肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的过程。
[0023]3)本发明公开的方法，简单易行，成本低，效果更好，具有广阔的临床应用前景。
【附图说明】
[0024]图1为不同细胞因子及其组合对体外培养的TIL促增殖分化示意图。
[0025]图2为细胞因子组合物对体外培养的TILs表面表达⑶62L的影响。
[0026]图3为细胞因子组合物对体外培养的TILs表面表达细胞分化分子的影响。
[0027]图4为细胞因子组合物对体外培养的TILs细胞表达相关分化标志物基因的影响。
[0028]图5为无细胞因子添加对体外培养TILs细胞表面分化标志物的影响。
[0029 ]图6为细胞因子组合物对体外培养TILs的第二次扩增的影响。
[0030]图7为细胞因子逆转的低分化TIL展示出显著的体内抗瘤活性。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。
[0032]实施例1
[0033]本实施例具体研究本发明的细胞因子组合物对体外培养TILs表达膜CD62L的水平的影响，细胞培养具体步骤如下:
[0034]步骤1:肿瘤浸润淋巴细胞在无血清培养基的培养条件下，从接种开始计时，培养的前3天，添加细胞因子组合物进行培养；
[0035]步骤2:培养第3天后，细胞因子组合物中的细胞因子去除IL-12，继续培养至第6天，收集肿瘤浸润淋巴细胞；
[0036]所述的细胞因子组合物选自组合物1、组合物2或组合物3中的任意一种;所述组合物I为IL-2和IL-12;组合物2为IL-7和IL-12;组合物I为IL-12和IL-21;细胞因子除IL-2为100IU/ml外，其它细胞因子的浓度范围均为0.01-1000ng/ml。
[0037]对照组只添加IL-2因子，其他步骤与上述相同。培养第6天收集的肿瘤浸润淋巴细胞通过流式细胞仪系统地分析CD62L的变化。我们通过流式细胞仪系统地分析了CD62L的变化，发现较IL-2的培养条件，其它细胞因子组合物的培养条件可以显著上调CD62L的膜表达，综合6例的⑶62L膜表达统计分析，该⑶62L的上调表达具有显著差异。其中，⑶45R0的表达未见显著区别，但是CD62L的表达却出现显著的差别，6例的统计数据如图2所示:对照组培养的TILs所表达的⑶62L较其它各组呈现显著的差别，*:表示P〈0.01。
[0038]实施例2
[0039]本实施例进一步分析了其它膜分子标志物的变化。实验步骤如实施例1所示，同样对照组只添加IL-2因子。如图3所示，6例来源于不同肿瘤患者的TILs通过细胞因子及其组合培养6天后，细胞表型通过流式细胞仪检查其表面的分化分子的表型。其中，TILs表达CD8分子未见显著区别，但是⑶27、CD28及⑶127分子的表达却出现显著的差别，该类分子都是用来评价体外培养的低分化抗肿瘤T细胞的细胞表面标志物。
[0040]6例的统计数据如图3所示:IL-2组培养的TILs表达较低水平的⑶27、⑶28及⑶127膜分子。*:表示与其它各组比较，P〈0.01。另外，⑶57及⑶70分子呈现相反的趋势，S卩IL-2组及添加了 IL-2的IL-12+IL-2组与没有添加IL-2的组比较，该两种分子标志物显著增加，表示 P〈0.01。
[0041 ] 实施例3
[0042]本实施例进一步分析了⑶62LXD27等分子的基因表达情况，实验步骤与实施例1相同。所示如图4所示，本发明分析了细胞因子及组合对体外培养的TILs细胞表达相关分化标志物基因的影响。如图所示，6例来源于不同肿瘤患者的TILs通过细胞因子及其组合培养6天后，分离纯化细胞总RNA，相关分化基因的表达通过荧光定量PCR检测。A图为四种干细胞因子S0X2、NAN0G、0CT4及Lin8的mRNA表达的拷贝数。表示所在的组别与IL-2组比较，P〈
0.0I。B图为IFNg的拷贝数变化。C图为⑶27、CD28等相关基因表达的拷贝数，*:表示与其它各组比较，P〈0.01。综上，该实施例发现，细胞因子组合的配方同IL-2培养的条件相比，可以显著上调干细胞因子及⑶28、CD127等基因的mRNA的表达水平，其中，除了IL-12+IL-2组显著上调了IFNg及GrazB(GranZyme B)以外，其它各组中该两种细胞因子未见显著改变。
[0043]实施例4
[0044]本实施中为了验证本发明所提供细胞因子组合对维持体外培养扩增中TILs低分化的功效，我们进一步比较了不添加细胞因子的培养条件。如图5所示，我们分析了无细胞因子添加对体外培养TILs细胞表面分化标志物的影响。本图比较了无细胞因子添加与IL-2组及IL-12+IL-21组在体外培养6天时间内细胞表面分子标志物表达的差异。None表不没有细胞因子添加。通过荧光定量PCR检测该3组不同培养条件下，统计了细胞分化分子的mRNA的拷贝数。其中，表示IL-12+IL-21组与IL-2组及不添加细胞因子组比较，P〈0.01。综上，本发明提供的细胞因子组合(IL-12+IL-21)可以显著上调⑶62L、⑶28及⑶127细胞膜分子标志物的表达，明确了该细胞因子组合对维持体外培养TILs的低分化状态的独特生物学效应。
[0045]实施例5
[0046]在实施例5中，我们比较了细胞因子组合所诱导的低分化的TILs可能产生的体内外再次扩增的效率问题。3例来源于不同肿瘤患者的TILs通过细胞因子及其组合培养6天，6天后，各组细胞再次通过滋养层细胞(来源于经过20Gy辐射处理的外周血的PBMC)快速扩增:TILs与滋养层的比例为1:100，细胞培养基为AM-V，通过50ng/ml的⑶3抗体活化，同时添加11^-2100011]/1111;培养过程中，根据细胞生长情况添加培养液并保持细胞浓度为1-2\106/ml，12天后计数细胞浓度。如图6所示，各组细胞的生长情况通过Graph Pad进行制图及统计学处理，数据表示平均值土标准差。各组之间的扩增倍数未见显著差异。
[0047]实施例6
[0048]大量的体内外实验数据证实，体外培养的高度分化的抗肿瘤T细胞尽管具有较强的体外杀瘤活性，但在荷瘤实验模型及体内的临床试验中却显示出较低的抑瘤活性，同体外的杀瘤活性呈现副相关。为了验证本发明细胞因子组合配方所诱导的低分化TILs具有体内抑瘤活性，本实施例对耐受人源T细胞的裸鼠进行荷瘤实验。如图7所示，细胞因子组合维持的低分化TI Ls展示出显著的体内抗瘤活性。实验简述如下，NOD/ SC ID/gamma (c) (nu 11)小鼠皮下接种I X 16个黑色素瘤细胞(528，可以被JKF6TIL细胞系识别)，每组5只小鼠，5天后，肿瘤大小可以触摸到时通过尾部静脉回输5 X 16/只经细胞因子处理过的JKF6细胞。各种细胞因子的浓度除IL-2为100IU/ml外，其它细胞因子的浓度范围为0.01-1000ng/ml。细胞回输后每5天测量一次小鼠皮下肿瘤的体积，应用公式为(L XffXDX 2，其中L表示肿瘤的长度，W表示肿瘤的宽度，表示为mm3。*，表示NT组与其它各组比较，p〈0.05;**;表示为IL-2与 IL-2+IL-12组比较，口〈0.05;*#，表示为11^-7+几-12组及11^-12+11^-21组与11^-2+几-12及IL-2组比较，p〈0.05。综上，同传统的IL-2培养抗肿瘤T细胞的方案相比，本发明提供的细胞因子组合配方体外诱导的低分化TILs具有超强的体内抑瘤效果。
[0049]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种逆转抗肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤I:肿瘤浸润淋巴细胞在无血清培养基的培养条件下，从接种开始计时，培养的前3天，添加细胞因子组合物进行培养； 步骤2:培养第3天后，细胞因子组合物中的细胞因子去除IL-12，继续培养至第6天，收集肿瘤浸润淋巴细胞； 所述的细胞因子组合物选自组合物1、组合物2或组合物3中的任意一种；所述组合物I为IL-2和IL-12;组合物2为IL-7和IL-12;组合物3为IL-12和IL-21。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞因子组合物中IL-2浓度为45-150IU/mlo3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的细胞因子组合物中IL-2浓度为100IU/mlo4.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的细胞因子组合物中IL-12的浓度范围为0.01-1000ng/ml。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞因子组合物中IL-7的浓度范围为0.01-1000ng/ml。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞因子组合物中IL-21的浓度范围为0.01-1000ng/ml。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤I中无血清培养基为Am-V无血清培养基。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法在制备抗肿瘤治疗剂中的应用。
【文档编号】C12N5/0783GK106085956SQ201610408893
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】杨世成, 郑北平
【申请人】杨世成, 深圳联合博海生物技术有限公司