一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基。
【背景技术】
[0002] 随着细胞遗传学的发展，外周血淋巴细胞染色体核型分析已成为产前诊断的常规 检测项目。而要获得数目多的可供核型分析的分裂相细胞，淋巴细胞的体外培养增殖是基 础。
[0003] 细胞体外培养系统是在体外模拟细胞在体内环境生长而建立的，而来源于动物或 者是人类的血清被广泛用于细胞的维持和增殖。血清中含有细胞存活和生长所必须的成 分：生长因子，细胞因子，粘附因子，蛋白，维生素，微量元素和激素等，血清还可以作为缓冲 剂、螯合剂。另外，血清中的白蛋白，胎球蛋白和其他蛋白能够影响细胞培养系统的物理特 性，如pH，剪切力，粘度，渗透压和气体传递率等。
[0004] 然而，使用血清也存在许多问题。价格昂贵，血清价格不断上涨，费用约占到培 养基成本一半；血清质量参差不齐，存在质量不稳定性，会导致生产及产品质量的差异；另 外，血清中存在支原体和其它病毒异源污染，造成生物产品的安全性问题，虽然可以经灭活 处理，但是，这样的处理会影响血清的促细胞生长能力。
[0005] 为了解决血清在广泛运用上的问题，企业逐渐转向了无血清、无动物衍生成分甚 至化学成分确定培养基的开发。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基 本发明所采取的技术方案是： 一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其主要组成包括：基础培养基、L型植 物血球凝集素、复合氨基酸、亚硒酸钠、柠檬酸铁、重组人胰岛素、缓冲体系。
[0007] 作为优选的，所述基础培养基为RPMI1640培养基。
[0008] 作为优选的，所述复合氨基酸包括：L-谷氨酸300mg/L、L-甘氨酸100mg/L、L-天 冬氨酸400mg/L、L-丝氨酸360 mg/L、L-苏氨酸80 mg/L、L-亮氨酸80 mg/L、L-脯氨酸 200 mg/L〇
[0009] 作为优选的，所述缓冲体系为NaHC03。
[0010] 作为优选的，所述培养基中各组分的含量为：基础培养基10-10. 5 g/L，L型植物 血球凝集素18-22 mg/L，复合氨基酸18-22 ml/L、亚硒酸钠50-70 n mol /L、柠檬酸铁 0.5-1.5 mg/L、重组人胰岛素 8-12 mg/L，缓冲体系 1.8-2.2 g/L。
[0011] 本发明的有益效果是： 本发明的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基不含有动物或人的血清，避免了使 用动物血清可能导致的安全问题，同时可以降低产品生产成本，增强产品不同批次间的质 量稳定性，提升细胞培养效果，为临床检验提供安全可靠的试剂。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0013] 实施例1 UlL氨基酸母液的配制：在500 mL注射用水中分别加入L-谷氨酸300 mg、L-甘氨酸 100 mg、L-天冬氨酸400 mg、L-丝氨酸360 mg、L-苏氨酸80 mg、L-亮氨酸80 mg、L-脯 氨酸200 mg，搅拌溶解后定容至LOL。分装后4°C贮存备用。实施例1-3的培养基均使用 本氨基酸母液。
[0014] 2、IL无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基的配制方法为：在800mL注射用 水中加入RPMI 1640培养基干粉10.4 g，溶解后加入碳酸氢钠 2.0 g、氨基酸母液20 mL、 PHA-L 20 mg/L、亚硒酸钠 60 nmol/L、梓檬酸铁I mg和重组人胰岛素 10 mg，搅拌使充分溶 解，用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠调节pH值至7. 0-7. 4之间，0.22 um滤膜过滤 除菌，分装，-20 °C贮存备用。
[0015] 实施例2 IL无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基的配制方法为：在SOOmL注射用水中加 入RPMI 1640培养基干粉10 g，溶解后加入碳酸氢钠 2. 2 g、氨基酸母液18 mL、PHA-L 22 mg/L、亚硒酸钠 50 nmol/L、朽1檬酸铁0. 5 mg和重组人胰岛素 12 mg，搅拌使充分溶解，用 0· lmol/L盐酸和0· lmol/L氢氧化钠调节pH值至7. 0-7. 4之间，0· 22um滤膜过滤除菌，分 装，-20 °C贮存备用。
[0016] 实施例3 IL无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基的配制方法为：在SOOmL注射用水中加 入RPMI 1640培养基干粉10.5 g，溶解后加入碳酸氢钠 1.8 g、氨基酸母液22 mL、PHA-L 18 mg/L、亚硒酸钠 70 nmol/L、朽1檬酸铁1.5 mg和重组人胰岛素 8 mg，搅拌使充分溶解，用 0· lmol/L盐酸和0· lmol/L氢氧化钠调节pH值至7. 0-7. 4之间，0· 22um滤膜过滤除菌，分 装，-20 °C贮存备用。
[0017] 实施例4淋巴细胞转化率测定 采用实施例1-3制备的培养基及含小牛血清的对比培养基进行淋巴细胞培养。
[0018] 对比培养基配方为：RPMI 1640基础培养基9. 36g/L，小牛血清10%(W/V)，PHA-L 20mg/L，肝素 0· 1%(W/V)。
[0019] 实验步骤： 取无血清细胞培养基和对比培养基各一瓶，在无菌条件下用2ml注射器滴加20滴抗凝 血，轻轻摇匀，放入37°培养箱中放置72小时，每隔12小时轻摇1次。收获前2小时用Iml 注射器滴加入秋水仙碱，终浓度为0. 02 ug/ml，摇匀后置培养箱中继续培养。用移液器将无 血清细胞培养基移入IOml离心管，1000转/分，离心5分钟，弃上清液，经固定后滴一滴细 胞悬液于玻片上，推片。待片干后用瑞氏染色液染色，细胞呈天蓝色。油镜下计数1000个 单核细胞，包括转化与未转化的细胞。
[0020] 淋巴细胞转化率计算公式：淋转率=1000个细胞中转化淋巴细胞数/1000*100%。
[0021] 测定结果见表1: 表1
以上实验结果表明，本发明培养基在不添加动物或人的血清的情况下，同样能够提升 细胞的培养效果，为临床检验提供安全可靠的试剂。
[0022] 以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本 发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【主权项】
1. 一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其主要组成包括：基础培养基、L型 植物血球凝集素、复合氨基酸、亚硒酸钠、柠檬酸铁、重组人胰岛素、缓冲体系。2. 根据权利要求1所述的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所 述基础培养基为RPMI1640培养基。3. 根据权利要求1所述的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所 述复合氨基酸包括：L-谷氨酸300mg/L、L-甘氨酸100mg/L、L-天冬氨酸400mg/L、L-丝氨 酸 360 mg/L、L-苏氨酸 80 mg/L、L-亮氨酸 80 mg/L、L-脯氨酸 200 mg/L。4. 根据权利要求1所述的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，所 述缓冲体系为NaHCO3。5. 根据权利要求1-4任一项所述的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其特征 在于，所述培养基中各组分的含量为：基础培养基10-10. 5 g/L，L型植物血球凝集素18-22 11^凡，复合氨基酸18-22 1111凡、亚硒酸钠5〇-7〇111]1〇1凡、朽1檬酸铁0.5-1.5 11^凡、重组人 胰岛素8-12 mg/L，缓冲体系L8-2.2 g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基，其主要组成包括：基础培养基、L型植物血球凝集素、复合氨基酸、亚硒酸钠、柠檬酸铁、重组人胰岛素及缓冲体系。本发明的无动物来源成分的外周血淋巴细胞培养基不含有动物或人的血清，避免了使用动物血清可能导致的安全问题，同时可以降低产品生产成本，增强产品不同批次间的质量稳定性，提升细胞培养效果，为临床检验提供安全可靠的试剂。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105018425
【申请号】CN201510399372
【发明人】邱壮伟, 丘力功, 倪世明
【申请人】广州白云山拜迪生物医药有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月9日