血液保存液的制作方法

血液保存液的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3.31?3.32g柠檬酸三钠、0.01?0.05g柠檬酸、2.45?3.37g葡萄糖、0.2?0.4g ATP、和50?600U SOD，余量为水。本发明还提供了使用本发明的血液保存液对血液样品进行保存的方法。
【专利说明】
血液保存液
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞治疗领域，具体涉及一种长效的保持外周血淋巴细胞扩增效力的 血液保存液和其使用方法。
[0002] 发明背景
[0003] 恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，其发病率逐年增高。20世纪80 年代，Rosenberg等观察到患非免疫系统肿瘤的动物给予重组IL-2治疗后，动物的淋巴细 胞可以调节肿瘤的消退和转移。此后，免疫细胞治疗在临床上的应用就迅速扩展开来，目前 已成为手术、化疗和放疗之外的肿瘤综合治疗第四种模式。外周静脉血是所有免疫细胞治 疗用细胞的培养原材料，一般采用肝素或复方柠檬酸钠保存液（ACD)作为抗凝剂加入静脉 血中。这样的抗凝血必须在4-6小时内使用，才能保证淋巴细胞的活力及后续培养扩增效 力，如果抗凝血保存超过10小时，其中的淋巴细胞就会部分或全部死亡，而无法进行后续 正常的体外培养扩增，进而无法获得合格的免疫细胞治疗产品。目前市面常见的血液抗凝 剂（如肝素和ACD)，均主要针对保护红细胞。专利申请CN 1411818A公开了一种针对外周 血中淋巴细胞的抗凝剂，然而该申请没有对使用其公开的抗凝剂所保存的淋巴细胞后续增 殖能力进行验证。本领域仍然需要新的细胞保存液，其能够增强对外周静脉血中淋巴细胞 活力的保护，增加血液保存时间，避免如血样运送时间等对用于免疫治疗的淋巴细胞扩增 的影响。

【发明内容】

[0004] 本发明提供了一种新的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含 3. 31-3. 32g 柠檬酸三钠、0? 01-0. 05g 柠檬酸、2. 45-3. 37g 葡萄糖、0? 2-0. 4g ATP、和 50-600U S0D，余量为水。本发明还提供了使用本发明的血液保存液对血液样品进行保存的 方法。通过本发明的血液保存液和保存方法可以在多达36h内使血液中淋巴细胞保持良好 的扩增效力，足以满足目前免疫细胞治疗的要求。
[0005] 附图简述
[0006] 图1示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，分离所得PBMC数量变化情况。
[0007] 图2示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后细胞数量 情况。
[0008] 图3示出三种保存液/抗凝剂保存血样48h，其中的淋巴细胞活化培养6天后的扩 增倍数。
[0009] 图4示出采血后立即分离与分别使用保存液N和S保存24h，培养6天后淋巴细胞 表型情况。
[0010] 图5示出三种S0D浓度的保存液保存血样48h内分离所得PBMC数量变化。
[0011] 图6示出三种S0D浓度的保存液保存血样48h，活化培养6天后细胞数量情况。
[0012] 图7示出三种S0D浓度的保存液保存血样48h，活化培养6天后细胞扩增倍数。
[0013] 图8示出采血后立即分离与分别使用三种S0D浓度的保存液保存24h，培养6天后 淋巴细胞表型情况。
[0014] 图9示出采用三种保存液使用比例保存血样48h内分离所得PBMC数量变化。
[0015] 图10示出采用三种保存液使用比例保存血样48h，活化培养6天后细胞数量情况。
[0016] 图11示出采用三种保存液使用比例保存血样48h，活化培养6天后细胞扩增倍数。
[0017] 图12示出采血后立即分离与分别采用三种使用比例的保存液保存24h，培养6天 后淋巴细胞表型情况。
[0018] 图13示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离所得PBMC数量变化情况。
[0019] 图14示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的细胞数 量情况。
[0020] 图15示出保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC活化培养6天后的细胞扩 增倍数。
[0021] 图16示出采血后立即分离以及使用保存液在两种温度下保存血样24h，培养6天 后淋巴细胞表型情况。
[0022] 图17示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量变化 情况。
[0023] 图18示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离PBMC活化培养6天 后的数量情况。
[0024] 图19示出用配制后保存不同时间的保存液保存血样48h，分离PBMC活化培养6天 后的细胞扩增倍数。
[0025] 图20示出采血后立即处理与使用配制后保存不同时间的保存液保存血样24h，分 离PBMC活化培养6天后的淋巴细胞表型比较。
【具体实施方式】
[0026] 在一方面，本发明提供了一种适于保存用于体外淋巴细胞扩增的血液样品的血液 保存液。
[0027] 本发明的血液保存液的主要活性成分包括柠檬酸三钠、柠檬酸、葡萄糖、ATP、S0D。 不受任何理论限制，据认为柠檬酸三钠可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液 凝固；柠檬酸可以调节PH值，以适合细胞存活；葡萄糖为细胞提供营养;ATP为细胞提供能 量；而S0D主要对抗及阻断因氧自由基对细胞的损害，并及时修复受损细胞。
[0028] 在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含3. 31-3. 32g，例如 3. 31g、3. 315g、3. 32g柠檬酸三钠。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包 含0. 01-0. 05g，例如0. 01g、0. 02g、0. 03g、0. 04g、0. 05g柠檬酸。在一些实施方案中，本发明 的血液保存液每 100 毫升包含 2. 45-3. 37g，例如 2. 45g、2. 60g、2. 75g、3. 00g、3. 15g、3. 30g、 3. 37g葡萄糖。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含0. 2-0. 4g，例如 0. 25g、0. 3g、0. 35g、0. 4g ATP。在一些实施方案中，本发明的血液保存液每100毫升包含 50-600U、优选200-600U，最优选200-400U例如350U的S0D。在一些实施方案中，本发明的 血液保存液以水如注射用水作为溶剂。
[0029] 本发明的细胞保存液易于保存并具有较长的货架期。例如，本发明的细胞保存液 可以在配制后立即使用或在配制后保存多达8个星期再使用。
[0030] 在另一方面，本发明提供了一种保存血液样品，特别是保存用于体外淋巴细胞扩 增的血液样品的方法，所述方法包括使所述血液样品与本发明的血液保存液混合。使用本 发明的方法进行保存的血液样品可以是各种血液样品，优选包含淋巴细胞的血液样品，例 如外周静脉血。
[0031] 在一些实施方案中，血液保存液与血液样品以1:5-1:20的比例混合。在一些优 选实施方案中，血液保存液与血液样品以1:5-1:10的比例混合。在一些优选实施方案中， 血液保存液与血液样品以1:10的比例混合。在一些实施方案中，血液保存液与血液样品 的混合物保存于2°C -24°C。在一些实施方案中，血液保存液与血液样品的混合物保存于 2°C -8°C。在一些优选实施方案中，血液保存液与血液样品的混合物保存于20°C -24°C。本 发明的血液保存液使得可以在室温下对血液样品进行保存，这是特别有利的，因为可以避 免血液样品的低温保存和低温运输，节约成本。
[0032] 使用本发明的血液保存液和方法，血液样品可以长时间保存（至少24小时）而不 影响使用所述血液样品进行淋巴细胞扩增的效果。通过本发明的方法，血液样品可以保存 多达8小时、16小时、24小时、36小时或48小时。
[0033] 下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述 的实施例范围中。
[0034] 实施例
[0035] 实施例1、三种抗凝剂/保存液性能比较
[0036] 1、保存液配制
[0037] 肝素抗凝剂（本文简称H)为肝素锂真空抗凝管（Greiner，9ml)。
[0038] CN 1411818A中公开的抗凝剂（本文简称S)配方如下表1 :
[0039] 表 1 配方 S :每 100ml
[0041] 具体配制方法如下（20ml):先用12ml注射用溶解柠檬酸三钠664mg、柠檬酸5mg 和葡萄糖550mg。再用注射用水定容于20ml。使用NaOH和HC1调整pH值至6. 8-7. 3。用 0. 22um针式滤器过滤，然后分装5ml/支，保存于4°C。
[0042] 本发明的保存液（本文简称N)配方如下表2 :
[0043] 表 2 配方 N :每 100ml
[0045] 具体配制方法如下（20ml):先用12ml注射用水溶解柠檬酸三钠664mg、柠檬酸 5mg和葡萄糖550mg。加入S0D -支（0? 5ml，70U/支）和ATP两支（共4ml，40mg)。再用注 射用水定容于20ml。使用NaOH和HC1调整pH值至6. 8-7. 3。用0. 22um针式滤器过滤，然 后分装5ml/支，保存于4°C。
[0046] 2、实验设计
[0047] 采集三个健康供者外周血（63ml/人），分别使用三种保存液保存于2_8°C， 其中肝素抗凝使用肝素锂真空抗凝管（Gr einer，9ml)，N和S使用比例均为1:10(保 存液：外周血）。分别于〇h、8h、16h、24h、36h、48h六个时间点取出3ml外周血，采用 Fic 〇ll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC)，取样检测，然后将分 离所得PBMC用细胞培养基aMSFlOO, Immunotech UK. Ltd)重悬后接种到包被活化抗体 (Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培 养6天后收集细胞进行相应检测。实验分组见下表：
[0048] 表3三种保存液性能比较实验分组
[0050] 检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增 后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型（〇h、24h、48h) ;iv.扩增倍数。
[0051] 3、实验结果
[0052] 三种保存液保存血样48h，各检测点分离所得PBMC数量、活率、培养后细胞数量、 活率及扩增倍数见下表4 :
[0053] 表 4
[0054]
[0055] "nd"表示无法检测。
[0056] 由图1可以看出：0_16h保存液H保存血样分离所得PBMC数量急剧减少，16h后即 无法获得PBMC ;0-8h内保存液N和S保存血样分离所得PBMC数量基本无差别，8h开始保 存液N组和S组分离PBMC数量均逐渐减少，但N组较S组减少缓慢，截止48hN组始终较S 组多（p〈〇. 05)。
[0057] 由图2和图3可以看出：保存液H保存的淋巴细胞8h内扩增能力急剧减少，8h后 无法增殖；保存液N和S组细胞在8h-36h内培养后细胞数量均逐渐减少，但N组较S组减 少幅度小，48h开始两组细胞均无法增殖；保存液N组和S组在24h内扩增倍数变化不明显 (p>0. 05)，36h开始急剧减少，同时可见N组始终较S组高（p〈0. 05)。
[0058] 三种保存液保存血样48h，分离所得PBMC培养6天后淋巴细胞表型情况见下表5 :
[0059] 表 5
[0060]
[0061] "nd"表示无法检测。
[0062] 从表3和图4可以看出，使用保存液N和S保存血样24h，活化培养细胞较采血后 立即分离培养细胞中⑶3+T淋巴细胞百分比基本无差别（p>0. 05)，⑶3+⑶8+T淋巴细胞百 分比有所降低，但N组无统计学差异（p>0. 05)，S组有统计学差异（p〈0. 05)。
[0063] 4、结论
[0064] 综上所述，可以得出以下结论：
[0065] i.分别使用三种保存液保存外周静脉血样0_48h，肝素组在8h后分离所得PBMC 及淋巴细胞扩增能力均无法测得，提示了肝素仅能用于在8h内保存血样中淋巴细胞。
[0066] ii. 48h内，N组和S组分离所得PBMC及活化培养后细胞数量均逐渐减少，但36h 内，相同保存时间下N组分离所得PBMC数量及培养后细胞数量较S组更多，且具有统计学 意义（P〈〇. 05)。
[0067] iii.保存液N组在24h内活化培养后细胞扩增倍数基本无变化（p>0. 05)。
[0068] iv.保存液N组在24h内活化培养后淋巴细胞表型基本无变化（p>0. 05)。
[0069] 由此可见，本发明的血液保存液对外周静脉血中淋巴细胞扩增效力的保护性能更 佳。在使用比例为1:10 (保存液：外周血），血样保存温度为2_8°C条件下，可有效保持外周 血中淋巴细胞增殖活性达24h。
[0070] 实施例2、保存液配方优化
[0071] 在实施例1的基础上，本发明人对配方N中S0D用量进行了研究，以使保存液对淋 巴细胞保护性能达到最佳。
[0072] 采集三个健康供者外周血（54ml/人），分别使用含三种浓度S0D的保存液 (70U/100ml、280U/100ml、560U/100ml)保存血样于2-8°C，使用比例均为1:10(保存液：外 周血）。分别于Oh、12h、24h、36h、48h五个时间点取出3ml外周血，采用Fico 11 -Hypaque (GE) 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培 养基（IMSF100，Immunotech UK. Ltd)重悬后接种到包被活化抗体（Ebioscience)的培养瓶 中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相 应检测。试验分组见下表6:
[0073] 表 6
[0075] 检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增 后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型（〇h、24h、48h) ;iv.扩增倍数。
[0076] 实验结果
[0077] 三种S0D浓度保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数 量及活率、扩增倍数情况示于下表7 :
[0078] 表 7
[0079]
[0080] "nd"表示无法检测。
[0081 ] 由图5可见，12h内三种SOD浓度的保存液保存的血样分离所得PBMC数量基本无 变化；12h开始三组均开始减少，低浓度组减少最快，中、高浓度组减少减慢，有统计学差异 (p〈0. 05)，但中和高浓度组无显著差异（p>0. 05)。
[0082] 由图6和图7可以看出，S0D低浓度组培养后细胞数量和扩增倍数在0_48h内逐 渐降低，至48h无扩增；中、高浓度组培养后细胞数量和扩增倍数在24h内降低不明显，24h 后开始降低，两组间无显著差异（P>〇. 05)。
[0083] 三种SOD浓度保存液保存血样48h，分离PBMC培养6天后细胞表型情况见于表8 :
[0084] 表 8
[0085]

[0086] "nd"表示无法检测。
[0087] 从表6和图8可以看出，采血后立即分离与保存24h后分离PBMC进行活化培养， S0D低浓度组培养后⑶3+和⑶3+⑶8+T淋巴细胞百分比均有所降低，但中、高浓度组变化不 明显（P>〇. 05)。
[0088] 结论
[0089] 综上所述，可以得出如下结论：
[0090] i. S0D低浓度组（70U/100ml) 12h内分离所得PBMC数量无变化，之后逐渐减少，至 48h无法分离有效细胞；培养后细胞数量和扩增倍数自Oh开始即开始逐渐减少，至48h未 见增殖；培养后淋巴细胞表型在24h即可见显著改变。
[0091] ii. S0D中浓度组（280/100ml)和高浓度组（560/100ml) 12h内分离所得PBMC数量 无变化，12-48h逐渐减少；培养后细胞数量、扩增倍数及淋巴细胞表型在24h内均无显著改 变。
[0092] 由此可见，S0D浓度过低不利于保护淋巴细胞活力，而血液保存液配方中S0D浓度 在200-600U/100ml均无显著差别，考虑到成本因素，本发明保存液配方中优选的S0D浓度 为 200-400/100ml。
[0093] 实施例3、保存液使用比例的优化
[0094] 在前述实施例的基础上，本发明人对配方N的使用比例进行了研究，以使保存液 对淋巴细胞保护性能达到最佳。
[0095] 采集三个健康供者外周血（54ml/人），分别采用三种比例与本发明保存液混合 (保存液 ：血样=1:20、1:10、1:5)，保存血样于2-8°(：。分别于011、1211、2411、3611、4811五个 时间点取出3ml外周血，采用Fic 〇ll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 (PBMC)，取样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基aMSFlOO, Immunotech UK. Ltd)重 悬后接种到包被活化抗体（Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h 补充一次细胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表9:
[0096] 表 9
[0099] 检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增 后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型（〇h、24h、48h) ;iv.扩增倍数。
[0100] 实验结果
[0101 ] 三种使用比例保存液保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数 量及活率、扩增倍数情况见下表10 :
[0102]表 10
[0104] "nd"表示无法检测。
[0105] 由图9可见，采用三种使用比例（保存液：血样=1:20、1:10、1:5)的保存液保存 血样48h，从开始保存液低用量组（1:20)分离所得PBMC数量即开始逐渐减少，与其它两组 有统计学差异（P〈〇. 05) ;0-12h内，保存液中和高用量组（1:10和1:5)分离所得PBMC数量 变化不显著，12h后逐渐开始减少，而两组间差别不大（p>0. 05)。
[0106] 由图10和图11可以看出，采用三种使用比例（保存液：血样=1:20、1:10、1:5) 的保存液保存血样48h，从开始保存液低用量组（1:20)培养所得细胞数量和扩增倍数即开 始逐渐减少，与其它两组有统计学差异（P〈〇.〇〇l和P〈〇.〇5) ;0-24h内，保存液中和高用量 组（1:10和1:5)培养后数量和扩增倍数变化不明显，24h后逐渐开始减少，而两组间差别无 统计学意义（P>〇. 05)。
[0107] 采用三种保存液使用比例保存血样48h，分离PBMC培养6天后的淋巴细胞表型见 下表11 :
[0108] 表 11
[0109]

[0110] "nd"表示无法检测。
[0111] 从表9和图12可以看出，采血后立即分离与采用三种使用比例（保存液：血样= 1:20、1:10、1:5)的保存液保存24h后分离PBMC进行活化培养，保存液低用量组（1:20)培 养后⑶3+和⑶3+⑶8+T淋巴细胞百分比均有所降低（(p〈0. 05)，但中、高用量组变化不明显 (p>0. 05)。
[0112] 结论
[0113] 综上所述，可以得出如下结论：
[0114] i.保存液低用量组（保存液：血样=1:20)从血样保存开始，分离所得PBMC数量、 培养后细胞数量和扩增倍数即随保存时间增加逐渐减少，至48h培养后细胞基本不可见； 此外，24h内⑶3+和⑶3+⑶8+T淋巴细胞百分比亦有所降低。
[0115] ii?保存液中用量组（保存液：血样=1:10)和保存液高用量组（保存液：血样= 1:5)分离所得PBMC在12h内变化不明显，12后逐渐减少；而培养后细胞数量及扩增倍数在 24h内无显著变化，24h后逐渐减少，且两组间无差异；此外，两组样品在24h内培养后淋巴 细胞表型维持不变。
[0116] 由此可见，本发明保存液用量过低不利于保护淋巴细胞活力，至少应保证使用比 例不低于1:10 ;而使用比例1:10与1:5之间无显著差别，考虑到应尽量降低保存液对血样 成分的影响及成本因素，本发明的保存液的优选使用比例为1:10。
[0117] 实施例4、保存液使用温度优化
[0118] 前述实施例已优化了本发明保存液成分（S0D浓度为200-400U/100ml)及使用比 例（1:10)，但所有试验均在2-8°C条件下进行，实施例对保存液保存血样的最佳温度条件 进行研究。
[0119] 采集三个健康供者外周血（36ml/人），均与本发明的保存液以1:10混合（保存 液：血样），每个供者的血样均分为两份，分别保存于2-8°C (冰箱冷藏）和22±2°C (恒温 箱设置22°C )。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点从保存于两种温度的血样中取出 3ml，采用Fic〇ll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC)，取样检测， 然后将分离所得PBMC用细胞培养基aMSFlOO, Immunotech UK.Ltd)重悬后接种到包被活 化抗体（Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细胞培养 基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表12:
[0120] 表 12
[0121]
[0122] 检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增 后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型（〇h、24h、48h) ;iv.扩增倍数。
[0123] 实验结果
[0124] 保存液在两种温度下保存血样48h，分离所得PBMC数量及活率、培养6天后细胞数 量及活率、扩增倍数情况见下表13 :
[0125] 表 13
[0128] "nd"表示无法检测。
[0129] 由图13可见，保存液分别在两种温度条件下（2-8°C和20-24°C )保存血样，分离 所得PBMC数量12h内两组变化均不明显，12h后低温组开始逐渐减少，高温组在36h内基本 保持不变，36h后开始减少，两组间差异具有统计学意义（p〈0. 05)。
[0130] 由图14和图15可以看出，本发明的保存液在两种温度条件下（2-8°C和20-24°C ) 保存血样，分离PBMC接种培养6天：低温组24h内培养后细胞数量和扩增倍数无明显变 化，24h后逐渐减少，至48h无法增殖；高温组36h内培养后细胞数量和扩增倍数维持不变， 36h后开始减少。由此可见，相同使用条件下，本发明保存液在20-24°C保存血样效果更佳 (p〈0. 05)。
[0131] 本发明的保存液在两种温度下保存血样48h，分离PBMC培养6天后的淋巴细胞表 型见于下表14 :
[0132] 表 14
[0133]
[0134] "nd"表示无法检测。
[0135] 从表12和图16可以看出，采血后立即分离与使用本发明保存液在两种温度下 (2-8和20-24°C )保存血样24h，然后分离PBMC进行活化培养，低温组（2-8°C )和高温组 (20-24°C )培养后CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比无明显差别（p>0. 05)。
[0136] 结论
[0137] 综上所述，可以得出如下结论：
[0138] i.保存液低温组（2-8°C )，血样保存12h内分离所得PBMC数量变化不大，12-48h 逐渐减少；血样保存24h内培养后细胞数量和扩增倍数基本保存不变，24-48h细胞逐渐减 少至不可见；24h内淋巴细胞表型变化不明显。
[0139] ii.保存液高温组（20-24°C )，血样保存36h内分离所得PBMC数量、培养后细胞数 量和扩增倍数基本没有变化，36h后开始减少；24h内淋巴细胞表型亦变化不显著。
[0140] 由此可见，本发明的保存液在接近室温的温度条件下（20_24°C )使用，对淋巴细 胞的保护性能更佳。
[0141] 实施例5、保存液有效期的研究
[0142] 分别在不同时间点配制本发明的血液保存液，保存于2_8°C，保存时间分别为0、 2、4、8周。采集三个健康供者外周血（63ml/人），分别与保存不同时间的保存液以1:10混 合（保存液：血样），保存于22±2°C。分别于0h、12h、24h、36h、48h五个时间点从每份血样 中取出3ml，采用Fic 〇ll-Hypaque(GE)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC)，取 样检测，然后将分离所得PBMC用细胞培养基aMSF100，Immun 〇teCh UK.Ltd)重悬后接种到 包被活化抗体（Ebioscience)的培养瓶中进行扩增培养。依次各在72h和96h补充一次细 胞培养基。培养6天后收集细胞进行相应检测。试验分组见下表15:
[0143] 表 15
[0144]
[0145] 检测以下指标以评价保存液的性能：i.分离所得PBMC数量、活率；ii.活化扩增 后淋巴细胞数量、活率；iii.培养后淋巴细胞表型（〇h、24h、48h) ;iv.扩增倍数。
[0146] 实验结果
[0147] 本发明保存液配制后保存不同时间，保存血样48h分离所得PBMC数量及活率、培 养6天后细胞数量及活率、扩增倍数情况见下表16 :
[0148] 表 16
[0150] 由图17可见，本发明保存液配制后分别保存不同时间（0、2、4、8周），用以在 20-24°C保存血样48h，四组分离所得PBMC数量均表现为36h内变化不大，36h后逐渐减少， 且四组间差别不显著（P>〇. 05)。
[0151] 由图18和图19可以看出，本发明保存液配制后分别保存不同时间（0、2、4、8周）， 用以在20-24°C保存血样48h，分离PBMC活化培养6天，四组所得培养后细胞数量和扩增 倍数在血样保存36h内均变化不明显，36h后开始减少，四组表现一致，并无统计学差异 (p>0. 05)。
[0152] 本发明保存液配制后保存不同时间，保存血样48h分离PBMC培养6天后的淋巴细 胞表型见下表17 :
[0153] 表 17
[0154]
【主权项】
1. 一种血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3. 31-3. 32g柠檬酸三钠、 0· 01-0. 05g 柠檬酸、2. 45-3. 37g 葡萄糖、(λ 2-0. 4g ATP、和 50-600U SOD，余量为水。2. 权利要求1的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含200-600U SOD。3. 权利要求2的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含200-400U SOD。4. 权利要求1的血液保存液，其中每100毫升所述血液保存液包含3. 32g柠檬酸三钠、 0· 025g柠檬酸、2. 75g葡萄糖、(λ 2gATP、和350U S0D，余量为水。5. 权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液的pH值为6. 8-7. 3。6. 权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液：血液样品 的比例是1:5-1:20。7. 权利要求6的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液：血液样品的比例是 1:5-1:10。8. 权利要求7的血液保存液，其中所述血液保存液使用时保存液：血液样品的比例是 1:10〇9. 权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是2°C -24°C。10. 权利要求9的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是2°C -8°C。11. 权利要求9的血液保存液，其中所述血液保存液的使用温度是20°C -24°C。12. 权利要求1-4任一项的血液保存液，其中所述血液保存液具有多达56天的货架期。13. -种保存血液样品的方法，包括使血液样品与权利要求1-12中任一项的血液保存 液混合。14. 权利要求13的方法，其中保存液和血液样品以1:5-1:20,优选1:5-1:10,最优选 1:10的比例混合。15. 权利要求13的方法，还包括将血液样品和血液保存液形成的混合物保存于 2Γ -24。。。16. 权利要求15的方法，其中将所述混合物保存于2°C -8°C。17. 权利要求15的方法，其中将所述混合物保存于20°C -24°C。18. 权利要求13的方法，还包括将血液样品和血液保存液形成的混合物保存多达8小 时、16小时、24小时、36小时或48小时。19. 权利要求13-18任一项的方法，其中所述血液样品是外周静脉血。
【文档编号】A01N1/02GK105850977SQ201510033381
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】邵谊
【申请人】北京永泰生物制品有限公司