一种猪精液常温保存稀释粉剂、稀释液及其应用
【专利摘要】本发明属于家畜人工授精技术领域，具体地，涉及一种猪精液常温保存稀释粉剂、稀释液及其应用。本发明的猪精液常温保存稀释粉剂的组分按重量份包括：葡萄糖28?34重量份、碳酸氢钠1.5?2.5重量份、柠檬酸钠6.5?8.5重量份、EDTA 1.8?2.4重量份、柠檬酸2.0?3.5重量份、Tris 4.0?6.0重量份；Hepes 3.0?5.0重量份、PVP 1.0?2.5重量份、BSA 2.0?4.0重量份、半胱氨酸0.05?0.10重量份和抗生素。本发明提供了一种全新的猪精液常温保存稀释粉剂及稀释液，可有效地减少精液保存过程中结团的现象，延长精液的保存时间，以扩大优良种公猪的利用效率。猪精液采用本配方制作的全组分稀释液进行稀释和分装，于17℃下保存，3天后精子活力在0.6以上，能够满足养猪生产需要。
【专利说明】
一种猪精液常温保存稀释粉剂、稀释液及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于家畜人工授精技术领域，具体地，涉及一种猪精液常温保存稀释粉剂、 稀释液及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着养猪规模的不断扩大，猪人工授精技术已在养猪业中广泛实行，大量专业社 会化公猪站的新建对常温精液的保存提出了更高的要求。为了提高种公猪的利用率和猪人 工授精的工作效率，许多国家在采用经稀释液稀释的猪精液常温保存后进行输精操作。一 般认为精液稀释粉应满足以下特征：1)对精子无侵害作用；2)能供给精子营养；3)酸碱环 境适合精子生存；4)渗透压适当；5)原料价格合适、配置简便。理想的稀释液是使猪精子 在常温下处于静息状态，并保持授精能力，且具备配制简单、成本低、便于推广等优点。目前 生产上常用的稀释粉多受原料、水质、温度环境等因素影响，在精液有效保存时间上很难达 到72h的基本要求。究其原因我们发现主要是在精液保存过程中精液结团的现象比较多， 许多同类产品配方都无法很好的解决这个问题，而我们的团队通过多次的试验筛选，使用 物理和化学方法相结合的方式提供了更好的解决方案。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有稀释粉成本高、易结团、使用效果不稳定等不足，提供一 种新的猪精液常温保存稀释粉剂及稀释液，可有效实现精液保存时间的延长，从而扩大优 良种公猪的利用效率，减少公猪的饲养量，降低猪场生产成本，显著增加经济效益。
[0004] 本发明提供的猪精液常温保存稀释粉剂，其组分按重量份包括：
[0005] 葡萄糖28-34重量份、碳酸氢钠1. 5-2. 5重量份、柠檬酸钠6. 5-8. 5重量份、EDTA 1. 8-2. 4重量份、柠檬酸2. 0-3. 5重量份、Tris 4. 0-6. 0重量份、Ifepes 3. 0-5. 0重量份、PVP 1. 0-2. 5重量份、BSA 2. 0-4. 0重量份、半胱氨酸0. 05-0. 10重量份和抗生素。
[0006] 根据本发明的稀释粉剂，其中，所述抗生素为青霉素、链霉素、林可霉素和大观霉 素中的一种或几种。作为优选地，所述抗生素为青霉素〇. 48-0. 96重量份和链霉素1. 0-2. 0 重量份的组合，或者为林可霉素〇. 1-0. 3重量份和大观霉素0. 1-0. 3重量份的组合。
[0007] 本发明的葡萄糖、碳酸氢钠、柠檬酸钠、EDTA、柠檬酸、Tris和Ifepes为基础配方组 分，这些基础配方组分优选为过80目筛的分析纯化学药品。在先按钮配方量称量上述各组 分后再与PVP、BSA、半胱氨酸和抗生素这几种添加组分按照比例进行混合，搅匀后进行真空 包装。优选操作条件为：操作温度为20-26°C，相对湿度为45% -65%。
[0008] 其中的抗菌素可以作为其中一个组分独立包装也可与上述组分一起包装。按以上 基础配方添加PVP、BSA、半胱氨酸、抗生素等组分后成为全组分稀释液，方可用于猪精液稀 释液的稀释和常温保存。
[0009] 本发明还提供了基于上述稀释粉剂的猪精液常温保存稀释液，所述稀释液成分配 比如下：
[0010] 葡萄糖 28_34g、碳酸氢钠 1. 5-2. 5g、朽1 檬酸钠 6. 5-8. 5g、EDTA 1. 8-2. 4g、梓檬 酸 2.0-3. 5g、Tris 4.0-6. 0g;Hepes 3.0-5. 0g、PVP 1.0-2. 5g、BSA 2.0-4. 0g、半胱氨酸 0? 05-0. lOg 和抗生素 0? 2-2. 96g，
[0011] 溶解于lOOOmL双蒸水或超纯水中，所述稀释液pH值为6. 8-7. 0。
[0012] 本发明的猪精液常温保存稀释液的具体制备方法，包括以下步骤：
[0013] 1)按重量配比称取各组分混合制成稀释粉剂；
[0014] 2)将稀释粉剂溶解于1000mL双蒸水或超纯水中，调节pH值至6. 8-7. 0,制得稀释 液。
[0015] 根据本发明所述的猪精液常温保存稀释液的制备方法，所述需要在稀释粉剂溶解 后，在35-37°C的恒温水浴锅中平衡30-45分钟，然后调节pH值。
[0016] 本发明的猪精液常温保存稀释液，在应用于猪精液的低倍稀释时（例如 1:1-1:4)，可以按稀释比例直接加入精液中。
[0017] 应用于猪精液的高倍稀释时（例如1 :5及以上），应按以下步骤进行稀释：
[0018] (1)按照1 :1的稀释比例将稀释液缓缓加入精液中；
[0019] (2)将步骤（1)稀释的液体按照高倍稀释比例逐步稀释得到。
[0020] 例如，进行1 :5的高倍稀释需要分两步稀释，即先进行1 :1稀释，然后再逐倍稀释 到1 :5。本基础配方主要为精液提供较好的能量代谢和PH缓冲体系，与其他添加剂共同组 成全配方稀释粉用于常温精液生产。
[0021] 本发明还提供了所述猪精液常温保存稀释粉剂在稀释猪精液中的应用以及猪精 液常温保存稀释液在稀释猪精液中的应用。
[0022] 本发明将稀释粉分为基础配方和添加剂两个部分，基础配方主要起为精子提供能 量、维持稳定PH值和渗透压的作用，添加剂主要对起到保护精子质膜、减少氧化自由基的 产生、有效减少结团等作用。进一步优化各组分的含量并把Hepes用于猪稀释液组分将林 可霉素和大观霉素用于抑制稀释液中细菌生长，取得较好效果。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 本发明提供了一种全新的猪精液常温保存稀释粉剂及稀释液，可有效地减少精液 保存过程中结团的现象，延长精液的保存时间，以扩大优良种公猪的利用效率。猪精液采用 本配方制作的全组分稀释液进行稀释和分装，于17°C下保存，3天后精子活力在0. 6以上， 能够满足养猪生产需要。本发明成分明确，原料易得，成本低，保存时间长，预期能够提高猪 场的经济效益，可进一步促进了动物遗传育种与繁殖学科的发展。
[0025] 本发明的优点如下：
[0026] 1、将稀释粉分为基础配方和添加成分，可根据不同环境特点对配方进行适当的增 减，来取得较好的经济效益。
[0027] 2、特别是针对精液保存过程中易结团的情况，可对原精进行300目筛子过滤后在 稀释粉中添加PVP的方案，来减少结团的产生。
[0028] 3、针对许多对青霉素产生耐药性菌种，添加PVP和林可霉素及大观霉素可达到较 好的使用效果。
【附图说明】
[0029] 图1是使用本发明实施例3的稀释粉稀释72h后精液图，400倍观察。
[0030] 图2是使用BST稀释72h后精液图，400倍观察。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0032] 对比例1制备猪精液常温保存稀释粉剂及稀释液
[0033] 按照表1给出的稀释粉配方，准备原料：
[0034] 表1对比例1的稀释粉配方
[0035]
[0036]
[0037] 采购配方中的各种化学药品（分析纯），大颗粒或已经结块的成分需要经过破碎 和80目筛子过筛形成粉末。
[0038] 准确称量各种成分，按照配方中的比例进行混合，并作充分的搅拌，然后包装入 袋，抽真空并封口得到一包猪精液稀释粉，以上过程一般要求温度控制在18_26°C，相对湿 度控制在45% -65%。
[0039] 通常情况下，在进行精液稀释前的半小时就应该开始配制稀释液，一包猪精液稀 释粉经双蒸水或超纯水溶解至l〇〇〇mL，使用磁力搅拌机对稀释液搅拌至完全溶解，然后将 稀释液置于34-37°C恒温水浴锅中平衡30-45分钟后，将其调PH值为6. 8。根据精子活力 和密度，调整稀释比例，将稀释液缓缓加入精液中，若进行高倍稀释（例如1 :5)需要分两步 稀释：
[0040] (1)按照1 :1的稀释比例将稀释液缓缓加入精液中；
[0041] (2)将步骤（1)稀释的液体按照高倍稀释比例逐倍稀释。
[0042] 经稀释后的精液分装入瓶，拧紧，避光，平放，置于17°C冰箱作常温保存。
[0043] 实施例1制备猪精液常温保存稀释粉剂及稀释液
[0044] 按照表2给出的稀释粉配方，准备原料：
[0045] 表2实施例1的稀释粉配方
[0046]
[0047]
[0048] 其他操作同对比例1。
[0049] 实施例2
[0050] 采用对比例1与实施例1所述稀释粉剂制作稀释液，与现有稀释粉比较保存效果。 取5头公猪精液，每头公猪每周采精2-3次。将一头公猪精液分成4份，用BST、BSTm稀释 粉（配方见表3)以及对比例1和实施例1制作的稀释粉配制稀释液进行稀释，分装后17°C 保存。每隔12h在40倍显微镜下检查精液活力。
[0051] 表3 BST、BSTm优化配方
[0052]
[0053] 取猪精液公猪精液，并用300目的筛子过滤，将过滤后的精液按国家标准GB 23238-2009中所述方法测定精液活力和密度，计算有效精子数多25亿时，原精的稀释比 例。先按照1:1的比例稀释后再逐倍稀释的方法进行稀释，分装后于17°C保存。每隔12h 小时翻动精液，并检查精液品质检查，每一个配方重复8次以上。
[0054] 精液品质检查：采用十级评分法，观察视野中直线前进运动的精子所占比例。有 效存活时间是指精子活力在0.6级以上的保存时间。生存指数为E [(上次活力+下次活 力）A2X时间间隔）]。
[0055] 结果见表4所示：
[0056] 表4稀释精液常温（17°C )保存有效存活时间和生存指数
[0057]
[0058] 从表4可以看出，对同一份精液进行稀释，每隔12个小时检查精液活力。对比例1 和实施例1稀释粉的有效存活时间和生存指数上均显著地高于BST和BSTm。另一方面，实 施例1稀释粉在有效存活时间上显著的高于对比例1稀释粉，在生存指数上没有显著差异。 在有效存活时间上，实施例1能达到72h，表明该配方对猪精液稀释保存有良好的效果。
[0059] 实施例3
[0060] 按照表5给出的稀释粉配方，准备原料：
[0061] 表5实施例3的稀释粉配方
[0062]
[0063] 其他操作同对比例1。在进行精液稀释前的半小时就应该开始配制稀释液，一包猪 精液稀释粉经双蒸水或超纯水溶解至l〇〇〇mL，经磁力搅拌机进行不断的搅拌至完全溶解， 调PH值为6. 9,加热至37°C。根据精子活力和密度，调整稀释比例，将稀释液缓缓加入精液 中。
[0064] 实施例4
[0065] 采用实施例3所述配制稀释液将猪精液稀释后于17°C下保存的活力变化情况试 验实施方案：
[0066] 取四种不同品种的纯种公猪精液（各3头），每头公猪采精3次以上。按实施例2 中所述方法稀释精液，分装后并于17°C保存，每隔24小时观察精子活力，记录活力变化情 况。结果见表6所不：
[0067] 表6不同公猪精液用该配方稀释后常温保存的活力变化 [0068]
[0069] 由表6可以看出，不同品种的公猪精液经该稀释配方稀释后，有效保存时间为72h 左右，其中长白猪和杜洛克猪精液保存效果较好，可达78和72. 8h。从总体来看该稀释粉在 外种猪精液上的保存效果好于地方品种猪精液的保存效果，常温保存3d后的活力能基本 达到0. 6。另外将同一份精液用本发明实施例3所述稀释粉与BST比较时，可以看出本稀释 液在减少精液结团方面效果显著，见图1和2。
[0070] 综上所述，本配方稀释粉对外来品种猪精液稀释保存的效果较好，并能有效减少 猪精子在保存过程中出现的结团现象，可有效地延长精液的保存时间，为猪人工授精推广 应用提供技术保障。
[0071] 实施例5
[0072] 按照表7给出的稀释粉配方，准备原料：
[0073] 表7实施例5的稀释粉配方
[0076] 其他操作同对比例1，制成稀释液。[0077] 使用本实施例制备的稀释液稀释猪精液，稀释效果与实施例1相当，猪精子在有
[0074]
[0075] 效存活时间上，能达到72h，该配方对猪精液稀释保存有良好的效果，可以减少精液结团方 面效果显著。
[0078] 实施例6
[0079] 按照表8给出的稀释粉配方，准备原料：
[0080] 表8实施例6的稀释粉配方
[0081]
[0082] 其他操作同对比例1，制成稀释液。
[0083] 使用本实施例制备的稀释液稀释猪精液，稀释效果与实施例1相当，猪精子在有 效存活时间上，能达到72h，该配方对猪精液稀释保存有良好的效果，可以减少精液结团方 面效果显著。
[0084] 实施例7
[0085] 按照表9给出的稀释粉配方，准备原料：
[0086] 表9实施例7的稀释粉配方
[0087]
[0088] 其他操作同对比例1，制成稀释液。
[0089] 使用本实施例制备的稀释液稀释猪精液，稀释效果与实施例3相当，猪精子在有 效存活时间上，能达到72h，该配方对猪精液稀释保存有良好的效果，可以减少精液结团方 面效果显著。
[0090] 实施例8
[0091] 按照表10给出的稀释粉配方，准备原料：
[0092] 表10实施例8的稀释粉配方
[0093]
[0094]
[0095] 其他操作同对比例1，制成稀释液。
[0096] 使用本实施例制备的稀释液稀释猪精液，稀释效果与实施例3相当，猪精子在有 效存活时间上，能达到72h，该配方对猪精液稀释保存有良好的效果，可以减少精液结团方 面效果显著。
[0097]当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉 本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和 变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种猪精液常温保存稀释粉剂，其特征在于，所述稀释粉剂的组分按重量份包括： 葡萄糖28-34重量份、碳酸氢钠1. 5-2. 5重量份、柠檬酸钠6. 5-8. 5重量份、 EDTA1. 8-2. 4 重量份、柠檬酸 2. 0-3. 5 重量份、Tris 4. 0-6. 0 重量份、！fepes 3. 0-5. 0 重量 份、PVP 1. 0-2. 5重量份、BSA 2. 0-4. 0重量份、半胱氨酸0. 05-0. 10重量份和抗生素。2. 根据权利要求1所述的稀释粉剂，其特征在于，所述抗生素为青霉素、链霉素、林可 霉素和大观霉素中的一种或几种。3. 根据权利要求2所述的稀释粉剂，其特征在于，所述抗生素为青霉素0. 48-0. 96重 量份和链霉素1. 0-2. 0重量份的组合，或者为林可霉素0. 1-0. 3重量份和大观霉素0. 1-0. 3 重量份的组合。4. 一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于，所述稀释液成分配比如下： 葡萄糖28_34g、碳酸氢钠1. 5-2. 5g、梓檬酸钠6. 5-8. 5g、EDTA 1. 8-2. 4g、梓檬酸 2. 0-3. 5g、Tris 4. 0-6. 0g ;!fepes 3. 0-5. 0g、PVP 1. 0-2. 5g、BSA 2. 0-4. 0g、半胱氨酸 0· 05-0. lOg 和抗生素 0· 2-2. 96g， 溶解于l〇〇〇mL双蒸水或超纯水中，所述稀释液pH值为6. 8-7. 0。5. 根据权利要求4所述的稀释液，其特征在于，所述抗生素为青霉素、链霉素、林可霉 素和大观霉素中的一种或几种。6. 根据权利要求4所述的稀释液，其特征在于，所述抗生素为青霉素0. 48-0. 96g和链 霉素1. 0-2. 0g的组合，或者为林可霉素0. 1-0. 3g和大观霉素0. 1-0. 3g的组合。7. -种权利要求4-6任一所述的稀释液的制备方法，包括以下步骤： 1) 按重量配比称取各组分混合制成稀释粉剂； 2) 将稀释粉剂溶解于1000mL双蒸水或超纯水中，调节pH值至6. 8-7. 0,制得稀释液。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)在稀释粉剂溶解后，在 35-37°C的恒温水浴锅中平衡30-45分钟，然后调节pH值。9. 权利要求1-3任一所述的猪精液常温保存稀释粉剂在稀释猪精液中的应用。10. 权利要求4-6任一所述的猪精液常温保存稀释液在稀释猪精液中的应用。
【文档编号】A01N1/02GK105850978SQ201510591105
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年9月16日
【发明人】张亮, 王涛, 邱进杰
【申请人】重庆市畜牧科学院