一种无血清人的外周血淋巴细胞培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物制剂，尤其涉及一种淋巴细胞培养基。
【背景技术】
[0002] 随着细胞遗传学的发展，外周血淋巴细胞染色体核型分析已成为产前诊断的常规 检测项目。淋巴细胞培养基作为此检测项目的主要材料，其产品质量水平直接影响检测的 成功率和准确性。常规的外周血淋巴细胞培养基是在基础培养基（如RPMI1640)的基础 上添加一定量的动物血清（如牛血清），作为提供细胞生长、增殖所必需的物质。但利用动 物血清的缺点也很明显：由于血清成分复杂，不仅有促生长物质，还含有潜在的生长抑制物 质；且不同批次的血清存在的质量波动，造成培养基细胞培养效果的批间差异。
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于现有外周血淋巴细胞培养基大多采用动物或人 的血清作为添加物，不仅成本较高，而且增加了传播疾病的风险，同时不同批次间存在质量 差异的问题。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种优化的无血清组成的外周血淋巴细胞 培养基，用于染色体核型分析，具有成本低廉、质量稳定、培养效果佳的优点。
[0005] 本发明提供一种无血清人的外周血淋巴细胞培养基，包括凝集素、基础培养基以 及血清替代物，所述凝集素为L型植物血球凝集素，所述基础培养基为RPMI1640基础培养 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液。
[0006] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，包括如下组分：RPMI1640 培养基干粉10. 4g/L，碳酸氢钠2.Og/L，牛血清白蛋白4.Og/L，L型植物血球凝集素20mg/L，氨基酸母液20ml/L，柠檬酸铁lmg/L，重组人胰岛素10mg/L。
[0007] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所述氨基酸母液包括L-谷 氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸。
[0008] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，氨基酸母液中L-谷氨酸的 浓度为300mg/L，L-甘氨酸的浓度为100mg/L，L-天冬氨酸的浓度为400mg/L。
[0009] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所述牛血清白蛋白的纯度 不低于98%。
[0010] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)为来自红腰子豆的具有刺激T淋巴细胞有丝分裂的凝集素类糖蛋白组分。
[0011] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所述L型植物血球凝集素 (PHA-L)的纯度不小于95%。
[0012] 本案中所用的植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，PHA)为存在于红腰子豆 (Phaseolusvulgaris)的植物类凝集素。与由同种亚基组成的凝集素如ConA不同，PHA由 两种不同亚基组成的凝集素。其亚基可以分为PHA-E和PHA-L两类，其中PHA-E型亚基具 有较为显著的凝集红细胞功能而无淋巴细胞刺激活性，而PHA-L型亚基则具有较为显著的 刺激淋巴细胞增殖的功能。
[0013] 优选地，本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所述重组人胰岛素是使用 酵母或大肠杆菌为工程菌生产出来的药用级的胰岛素。
[0014] 本发明专利申请中涉及的制剂除特殊说明均可以从市面购买，特此说明。
[0015] 本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基采用血清替代物替代传统使用的动 物或人血清，这样可以不仅可以降低培养基成本，还可以降低传播疾病的风险；本发明的 无血清人的外周血淋巴细胞培养基所用组分确定，避免了传统血清成分复杂，不同批次间 具有质量差异，而导致培养效果波动的问题；本发明提供的细胞培养基淋巴细胞转换率与 淋巴细胞分裂指数高，试剂成本低、质量稳定，培养的细胞可用于染色体核型分析的临床诊 断。
【附图说明】
[0016] 利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限 制。
[0017] 图1是PHA提取物和纯化的PHA-L电泳检测结果，其中1 :PHA粗制品；2 :PHA-L; 3 :蛋白分子Markers。
【具体实施方式】
[0018] 结合以下实施例对本发明作进一步描述。
[0019] 本发明提供一种无血清人的外周血淋巴细胞培养基，包括凝集素、基础培养基以 及血清替代物，所述凝集素为L型植物血球凝集素，所述基础培养基为RPMI1640基础培养 基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液。
[0020] 本发明的无血清人的外周血淋巴细胞培养基，所用牛血清白蛋白的纯度不低于 98%。所用L型植物血球凝集素（PHA-L)为来自红腰子豆的具有刺激T淋巴细胞有丝分裂 的凝集素类糖蛋白组分，纯度不小于95%。所述重组人胰岛素是使用酵母或大肠杆菌为工 程菌生产出来的药用级的胰岛素。
[0021] 实施例一
[0022] (一）50X氨基酸母液的配制
[0023] 所用L型氨基酸皆来自国药集团（BR级），1L氨基酸母液具体配制如下：
[0024] 分别称量L-谷氨酸300mg、L-甘氨酸100mg、L-天冬氨酸400mg，加入500mL超纯 水中，搅拌均匀，加超纯水定容至l〇〇〇mL，混匀后分装，于4°C贮存备用。
[0025](二）PHA-L的制备方法
[0026] (1)PHA粗提物提取：
[0027]1?材料：红腰子豆（新鲜，无发霉，色泽鲜明）。
[0028] 2.将检验合格的红腰子豆粉碎，过100目筛网，制成红腰子豆豆粉。取一定量的红 腰子豆豆粉，用倍量的生理盐水浸泡，置冰箱内浸泡12小时。将样品离心（20°C、lOOOOrpm、 15min)，收集上清。将上清加乙醇至30%，置冰箱内12小时。离心，弃去上清，沉淀用4#漏 斗过滤，取沉淀置4°C冰箱12小时。沉淀中加入乙醇、乙醚，使溶液乙醇浓度达到70%，置 4°C冰箱12小时。弃去上清，沉淀离心，用乙醇洗涤，离心，取沉淀。样品置-20°C冰箱预冷lh，冻干，样品存于4°C冰箱保存，备用。
[0029] (2)PHA_L的纯化：
[0030] 采用阴离子交换层析方法对PHA进行分离，方法如下：以15mmolNa2HP04(pH6. 5) 溶液平衡DEAE-