翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产生物技术中鱼类细胞培养技术，是在体外人工培养条件下，以翘嘴红舶精巢组织为材料的一种精原干细胞分离培养方法。
【背景技术】
[0002]翘嘴红舶作为养殖类鱼种，是长江中下游流域重要的养殖品种，其人工繁育、养殖技术都已经很成熟，但对其生殖发育的研宄较少。目前天然水域的翘嘴红舶产量已很低，野生资源日益减少，因而开展翘嘴红舶的生物学特性、人工繁殖、养殖技术等方面的研宄，对于品种的开发利用，保护天然翘嘴红舶的野生资源等都有重要的意义。弄清楚其生殖发育规律，不但可丰富鱼类发育学基础理论，还可直接与生产实践相结合，如建立新型繁育模式、找出控制性别的有效方法等，提高经济效益。
[0003]生殖细胞来源于生殖干细胞的分化发育。精巢中精原干细胞(spermatogonialstem cells，SSCs)属于成体生殖干细胞，既可自我更新，又可以分化形成各阶段的生殖细胞直至成熟配子，在成体动物一生中都具有增殖分化的能力，因而其来源丰富，获取方便，生产周期短，在生殖细胞研宄方面越来越引起关注。
[0004]Risley (J Exp Zool, 1979, 207 (I)) >Panda (Ther1genology, 2011, 76 (2))等米用胶原酶消化法分别成功从幼年非洲蛙鱼、南亚野鲮精巢组织分离得到了其SSCs。另外也有研宄人员采用组织块培养法从饅鱼(Miura，Development, 2002，129 (11))、斑马鱼(Leal，Belo Horizonte, MG, Brazil.2006, 3:181.)精巢中成功分离得到SSCs，但该方法分离到的SSCs细胞较少，且杂细胞较多，不利于后期的纯化。但未发现翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法的发明专利申请。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是建立一种翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法。特别是通过选取适当发育阶段的精巢组织、采用两步酶消化法、加入适当细胞因子的培养基等，使得翘嘴红舶精原干细胞原代细胞体外生长更容易增殖，为翘嘴红舶生殖发育研宄提供有效的细胞平台。
[0006]本发明解决所述技术问题的方案为:一种翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，包括以下步骤，
[0007](I)精巢组织的收集:无菌条件下收集7月龄翘嘴红舶精巢，用含有双抗的PBS中漂洗，剥离附属组织；然后碾压剩余的精巢组织使精巢组织分散；
[0008](2)精原干细胞的消化、分离:向分散的精巢组织中添加0.1% IV型胶原酶，25°C?30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液离心分离后弃上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目滤网过滤；滤液用含有10%FBS的培养基终止胰蛋白酶消化作用；之后滤液离心分离，弃上清，收集沉淀后的细胞；
[0009](3)精原干细胞的原代培养:用DMEM/F12完全培养基重悬步骤(2)所得的细胞，调整细胞浓度为I X 16个/mL?5X 10 6个/mL，按照ImL/孔的量铺于明胶包被的24孔细胞培养板中，26°C培养，2h后加新鲜培养基lmL，以后每2.5d换液一次，3?4d可见呈葡萄串状的精原干细胞。
[0010]作为改进，所述步骤⑴在碾压剩余的精巢组织前，先将精巢组织剪成体积为Imm3的小块。
[0011]步骤(2)中，存在未能通过200目滤网的剩余组织块，为充分消化组织块，作为改进，所述步骤(2)中经200目滤网过滤后，剩余组织块再次经5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，过200目滤网之后，滤液再用含有10% FBS的培养基终止消化酶作用，之后滤液离心分离后弃上清，收集细胞，两次收集到的细胞合并后进行步骤(3)。
[0012]作为改进，所述步骤(2)中离心分离的条件是在800rpm的速度下离心3min。
[0013]作为改进，所述步骤(3)中的DMEM/F12完全培养基包含:10% FBS, 100 μ g/mL青霉素、链霉素，10 μ g/mL bFGF, LIF，15 μ g/mL HEPESo
[0014]本发明的有益效果是:建立了一种翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，取材方便、无需特定的细胞分离液、两步酶法分离、培养条件有利于保持精原干细胞的特性、且精原干细胞可在本发明的培养条件下进行体外增殖，可用于后续生殖发育研宄。采用本发明所得到的主要是支持细胞和精原干细胞，杂细胞较少，支持细胞和精原干细胞两者比例适当，其中适量生长的支持细胞可为精原干细胞的生长提供必要的生长因子，有利于精原干细胞后期的增殖。本发明可推广应用于其他水产类生殖干细胞原代培养。
【附图说明】
[0015]图1为翘嘴红舶各生长阶段精巢组织切片(X400)，从左往右依次为4月龄、7月龄、10月龄的精巢组织切片。图中可以看到:4月龄精巢太小，取材不方便；7月龄取材较容易，为分化生殖细胞比例相对较后期高；10月龄的精巢组织的生殖细胞分化程度较高，干细胞比例相对较低。
[0016]图2为翘嘴红舶SSCs培养(X 200)。A为培养24h的精原干细胞；B为培养3d的精原干细胞。箭头所指为精原干细胞，梭形细胞为支持细胞。
[0017]图3为翘嘴红舶SSCs培养4d后AKP染色结果(A: X200，B: X400)。箭头所指的为精原干细胞。
[0018]图4为精原干细胞表面分子标记Oct-4的检测结果。M:DL 2000 DNA marker, 1-4:分别为培养2d、4d、6d、8d细胞的Oct-4基因RT-PCR电泳图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020]本发明是一种翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，具体包括以下步骤:
[0021](I)精巢组织的收集:无菌条件下收集8?10条7月龄翘嘴红舶精巢，用含有双抗的PBS中漂洗3遍，剥离脂肪、白膜等附属组织；然后将剩余的精巢组织剪成Imm3的小块，接着用2mL —次性注射器尾部进行碾压，使精巢组织尽量分散。
[0022](2)精原干细胞的消化、分离:向分散的精巢组织中添加0.1% IV型胶原酶，25°C?30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液离心分离后弃上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目滤网过滤；滤液用含有10%FBS的培养基终止胰蛋白酶消化作用；之后滤液离心分离，弃上清，收集沉淀后的细胞。
[0023]未能通过200目滤网的剩余组织块，继续经5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，过200目滤网之后，滤液再用含有10% FBS的培养基终止消化酶作用，之后滤液离心分离后弃上清，收集细胞，两次收集到的细胞合并后进行步骤(3)。
[0024]“沉淀用5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化”是指:0.25%胰蛋白酶的体积是沉淀体积的5?15倍。“剩余组织块继续经5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化”是指:
0.25%胰蛋白酶的体积是剩余组织块体积的5?15倍。
[0025]另外，0.25%胰蛋白酶中0.25%为质量浓度，0.1% IV型胶原酶中0.1 %为质量浓度，10% FBS中10%为体积浓度。
[0026](3)精原干细胞的原代培养:用DMEM/F12完全培养基(含10% FBS, 100 μ g/mL青霉素、链霉素，10 μ g/mL bFGF, LIF, 15 μ g/mL HEPES)重悬步骤⑵所得的细胞，调整细胞浓度为I X 16个/mL?5X 10 6个/mL，按照ImL/孔的量铺于明胶包被的24孔细胞培养板中，26°C培养，2h后加新鲜培养基lmL，以后每2.5d换液一次，3?4d可见呈葡萄串状的精原干细胞。
[0027]细胞观察鉴定:在100X和200X相差显微镜下观察细胞，其中精原干细胞较大、呈圆形、葡萄串状，支持细胞呈纤维状，较小的圆形细胞为处于不同分化阶段的生殖前体细胞。观察后采用生殖干细胞的分子标记进行鉴定，包括碱性磷酸酶(AKP)活性鉴定、干细胞表面标记物Oct-4的检测等。
【主权项】
1.一种翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，其特征在于:包括以下步骤， (1)精巢组织的收集:无菌条件下收集7月龄翘嘴红舶精巢，用含有双抗的PBS中漂洗，剥离附属组织；然后碾压剩余的精巢组织使精巢组织分散； (2)精原干细胞的消化、分离:向分散的精巢组织中添加0.1%IV型胶原酶，25°C?.30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液离心分离后弃上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目滤网过滤；滤液用含有10% FBS的培养基终止胰蛋白酶消化作用；之后滤液离心分离，弃上清，收集沉淀后的细胞； (3)精原干细胞的原代培养:用DMEM/F12完全培养基重悬步骤(2)所得的细胞，调整细胞浓度为I X 16个/mL?5X 10 6个/mL,按照ImL/孔的量铺于明胶包被的24孔细胞培养板中，26°C培养，2h后加新鲜培养基lmL，以后每2.5d换液一次，3?4d可见呈葡萄串状的精原干细胞。
2.如权利要求1所述的翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，其特征在于:所述步骤(I)在碾压剩余的精巢组织前，先将精巢组织剪成体积为Imm3的小块。
3.如权利要求1所述的翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，其特征在于:所述步骤(2)中经200目滤网过滤后，剩余组织块再次经5?15倍体积的0.25%胰蛋白酶消化1min?.20min，过200目滤网之后，滤液再用含有10% FBS的培养基终止消化酶作用，之后滤液离心分离后弃上清，收集细胞，两次收集到的细胞合并后进行步骤(3)。
4.如权利要求1所述的翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，其特征在于:所述步骤(2)中离心分离的条件是在800rpm的速度下离心3min。
5.如权利要求1所述的翘嘴红舶精原干细胞分离培养方法，其特征在于:所述步骤(3)中的DMEM/F12完全培养基包含:10%?85，10(^8/1^青霉素、链霉素，1(^8/1^ bFGF、LIF，.15 μ g/mL HEPESo
【专利摘要】本发明涉及一种翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法，包括以下步骤，(1)精巢组织的收集：无菌条件下收集7月龄翘嘴红鲌精巢，用含有双抗的PBS中漂洗后碾压使精巢组织分散；(2)精原干细胞的消化、分离：向分散的精巢组织中添加0.1％IV型胶原酶，消化液离心得到沉淀；沉淀用0.25％胰蛋白酶消化；用含有10％FBS的培养基终止消化，收集细胞；(3)精原干细胞的原代培养：用含细胞因子的DMEM/F12完全培养基重悬步骤(2)所得的细胞，调整细胞浓度后铺于明胶包被的24孔细胞培养板中，26℃培养。本发明使得翘嘴红鲌精原干细胞原代细胞体外生长更容易增殖，为翘嘴红鲌生殖发育研究提供有效的细胞平台。
【IPC分类】C12N5-076
【公开号】CN104830756
【申请号】CN201510228179
【发明人】刘莉, 曹访, 采克俊
【申请人】湖州师范学院
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月7日