一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞技术领域，涉及一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人羊膜间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用，在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研宄应用中具有重要意义。
[0003]为了验证体外培养的间充质干细胞的成脂分化潜能，必须将间充质干细胞用成脂诱导培养基进行诱导分化。目前的成脂诱导培养基组分一般为DMEM/F12，10%FBS，1%谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素溶液，200剛吲哚美辛，1剛地塞米松，100nM胰岛素，250剛3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)。但现有的成脂诱导分化培养基存在诱导效率不够理想、成脂诱导分化的专一性不强的问题。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术中存在的诱导效率不够理想的问题，发明人通过大量试验筛选，预料不到的发现:通过添加一定浓度的盐酸法舒地尔，得到一种新的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，该培养基的诱导效率大大提高，提高了成脂诱导分化的专一性，通过该培养基的诱导可以获得大量成脂细胞。
[0005]本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
[0006]本发明提供一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度:FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、吲哚美辛50~500 yM、胰岛素50~500 nM、地塞米松5~50 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-5 y M和盐酸法舒地尔0.05-0.5 y M。
[0007]采用上述技术方案的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，可以实现各种间充质干细胞向成脂细胞的诱导分化，提高了成脂诱导分化的专一性，产生更多的成脂细胞，成脂相关基因FABP4的表达水平更高，成脂诱导分化效率大大提高。
[0008]优选地，本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度:FBS 5~20%体积百分比、谷氨酰胺0.5~2%体积百分比、抗生素0.5~2%体积百分比、吲哚美辛100~300 yM、胰岛素50~200 nM、地塞米松5~20 nM、3_异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-3 y M和盐酸法舒地尔0.1-0.3 y M。
[0009]优选地，本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度:FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、吲哚美辛200 yM、胰岛素100 nM、地塞米松10 nM、3_异丁基-1-甲基黄嘌呤1y M和盐酸法舒地尔0.1 y M。
[0010]优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。
[0011]优选地，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
[0012]本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基还可根据实际需要添加其他成分，如1%体积百分比的非必须氨基酸，但添加后并未提高成脂诱导分化效率。
[0013]相应地，本发明还提供了间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，包括如下步骤:向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛母液、胰岛素母液、地塞米松母液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液和盐酸法舒地尔母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
[0014]相应地，本发明还提供间充质干细胞成脂诱导分化培养基在间充质干细胞成脂诱导分化中的用途。
[0015]此外，本发明还提供一种间充质干细胞成脂诱导分化方法，包括如下步骤:a)培养间充质干细胞山)待细胞汇合度符合要求时，弃去所述步骤a)中的培养基，加入权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基培养2~4周。细胞汇合度符合要求通常是指细胞长至70~90%汇合度。
[0016]优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，可以实现包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和羊膜间充质干细胞在内的各种间充质干细胞向成脂细胞的诱导分化，产生更多的成脂细胞，提高了成脂诱导分化的专一性，避免了向成骨细胞等其他组织细胞的分化，成脂相关基因FABP4的表达水平高，成脂诱导分化效率大大提高。此外，本发明提供的制备方法简单，制得的间充质干细胞成脂诱导分化培养基可以实现稳定、高效的成脂诱导分化。
【附图说明】
[0018]图1不同配方的间充质干细胞成脂诱导分化培养基对成脂诱导分化相关基因FABP4的表达影响。
[0019]图2含不同浓度盐酸法舒地尔的间充质干细胞成脂诱导分化培养基对成脂诱导分化相关基因FABP4的表达影响。
[0020]图3 P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
[0021]图4 P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
[0022]图5 P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
[0023]图6 P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
[0024]图7 P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
[0025]图8 P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0027]本发明中的各组分均为常规市售产品。诱导培养基1:本发明实施例二提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基。诱导培养基2:Life Tecnology公司的成脂诱导分化培养基，货号A10070-01。诱导培养基3:与诱导培养基1相比，不包括盐酸法舒地尔。诱导培养基4:与诱导培养基1相比，盐酸法舒地尔的浓度变为0.4 y M。诱导培养基5:与诱导培养基1相比，盐酸法舒地尔的浓度变为0.5 y M。
[0028]实施例一间充质干细胞成脂诱导分化培养基的配方筛选发明人对间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行了试验筛选。取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基3，每3天换液一次。诱导培养3周后，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图1所示。
[0029]从图1可知:向现有技术中的间充质干细胞成脂诱导分化培养基中添加一定浓度的盐酸法舒地尔，可以大幅提高成脂相关基因FABP4的表达水平(与诱导培养基3相比，P〈0.01)，且未检出成骨相关基因0PN的表达。
[0030]进一步地，发明人还对盐酸法舒地尔的添加浓度进行了考察。取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1、诱导培养基4和诱导培养基5，每3天换液一次。诱导培养3周后，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图2所示。从图2可知，当盐酸法舒地尔的浓度高于0.3 y M时，随着盐酸法舒地尔浓度的增加，