L-核酸的酶促合成的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于添加一个或多个L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L-核苷酸与所述第一L-核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。
【专利说明】L-核酸的酶巧合成
[0001] 本发明涉及一种用于添加一个或多个k核巧酸到第一k核酸的3 '端的方法； 一种用于扩增祀k核酸的方法；一种包含酶活性展现部分的蛋白质；包含氨基酸序列的聚 合酶，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸；一种野生型聚合酶的聚合酶变体，其中 所述野生型聚合酶由根据SEQ ID NO: 15的氨基酸序列组成；一种野生型聚合酶的聚合酶变 体，其中所述野生型聚合酶由根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成；包含酶活性展现部分 的蛋白质在用于添加一个或多个k核巧酸的方法中的用途；包含酶活性展现部分的蛋白 质在用于扩增祀心核酸的方法中的用途；一种用于鉴别结合祀分子的k核酸分子的方法； 一种用于分别产生所述蛋白质和聚合酶的方法；W及一种用于将第一D-肤或第一D-蛋白 质与第二D-肤或第二D-蛋白质彼此连接的方法。
[0002] 基因技术的可利用性在广义上对医学和诊断领域W及基础研究在过去数十年间 所取得的进展贡献良多。基因技术所提供的合成力超过了化学合成的合成力。确切地说， 基因技术和基因工程允许使用原核细胞和真核细胞的酶机制来产生事实上无限量的k肤 和k蛋白质。确切地说，酶和聚合酶，或是野生型形式或是该些野生型形式的变体，允许通 过连接D-核酸的构筑块（即，D-核巧酸）到化学合成可实现的长度（至少未获得合理的 产率）来合成所述D-核酸。
[0003]由于手性特异性，基因技术中所使用的酶仅能对应地使用手性与其自身的手性相 符的构筑块和底物。对应地具有相反手性的构筑块和底物可能不受酶活性影响。由于手性 互易原则，对应地具有相反手性的构筑块和底物的处理要求酶也具有相反的手性。
[0004] 举例来说，该种手性互易原则广泛用于产生祀结合k核酸，该些祀结合k核酸也 是已知的并且称为镜像异构体。迄今为止，镜像异构体都是利用W下方法鉴别；在第一步骤 中，使用D-核酸库针对诸如D-肤或D-蛋白质的祀分子或祀结构的对映异构形式进行体外 选择。在第二步骤中，将如此鉴别的能结合祀分子或祀结构的对映异构形式的D-核酸制备 为对应的心核酸。由于手性互易原则，该些k核酸（即镜像异构体）能够结合真实或实 际的祀分子，诸如k肤或k蛋白质，而不结合用于选择过程的其对映异构形式，诸如D-肤 或D-蛋白质。优选地，所述真实的或实际的祀分子或祀结构是诸如人体或动物体的生物学 系统中存在的祀分子或祀结构。用于制备所述镜像异构体的方法描述于例如'TheAptamer Hanclbook'化Iussmann编，2006)中。
[0005] 使鉴别镜像异构体的方法更容易的一种方式可能是重新设计所述方法，W便使用 祀分子或祀结构直接从k核酸库选择k核酸，因为对映异构体形式由真实的或实际的祀 分子或祀结构展现。由于所述方法的一部分是对最初对应地结合祀分子和祀结构的那些 k核酸进行扩增，故将会需要能添加至少一个核巧酸到k引物的聚合酶。迄今为止，已知 还没有聚合酶由能够该样做的k氨基酸组成。因此，需要由D-氨基酸组成的聚合酶和类似 的酶。由于基因技术不能提供该样的由D-氨基酸组成的功能活性聚合酶，故需要进行化学 合成。然而，D-蛋白质或D-多肤的合成仅限于相对较小的分子。迄今合成的最大的D-蛋 白质是由102个D-氨基酸组成的血管生成蛋白血管内皮生长因子（缩写VEGF-A)的D-蛋 白质形式（Mandal等，2012)，然而，聚合酶通常由超过300个氨基酸组成。
[0006] 因此，本发明潜在的问题是提供了一种允许添加至少一个核巧酸到诸如引物的 k核酸的方法。本发明的另一个潜在问题是提供了一种使用k核巧酸扩增祀k核酸的方 法。本发明的另一个潜在问题是提供了允许实施该些方法的手段。
[0007] 所附的独立权利要求的主题解决了本发明的该些及其它潜在问题。可W根据所附 的从属权利要求来进行优选实施方案。
[0008] 在第一方面，也是所述第一方面的第一实施方案中，通过一种用于添加一个或多 个心核巧酸到第一k核酸的3'端的方法也解决了本申请潜在的问题，其中所述方法包括 在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个k核巧酸与所述第一k核酸反 应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个k核巧酸到所述第一k核酸的3'端。
[0009] 在所述第一方面的第二实施方案，也是所述第一方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0010] 在所述第一方面的第H实施方案，也是所述第一方面的第一和第二实施方案的一 个实施方案中，所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部分。
[0011] 在所述第一方面的第四实施方案，也是所述第一方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0012] 在所述第一方面的第五实施方案，也是所述第一方面的第四实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
[0013] 在所述第一方面的第六实施方案，也是所述第一方面的第H、第四和第五实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含至少300个氨基酸。
[0014] 在所述第一方面的第走实施方案，也是所述第一方面的第六实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900个之间的氨基酸，优选 介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨基酸，最优选340至 360个氨基酸。
[0015] 在所述第一方面的第八实施方案，也是所述第一方面的第四、第五、第六和第走实 施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0016] 在所述第一方面的第九实施方案，也是所述第一方面的第八实施方案的一个实施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶活性。
[0017] 在所述第一方面的第十实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分是酶。
[0018] 在所述第一方面的第十一实施方案，也是所述第一方面的第H、第四、第五、第六、 第走、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分是聚合酶。
[0019] 在所述第一方面的第十二实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分选自非洲 猪癌病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列诺片 段Odenow化agment)、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一个和任一个的变体，
[0020] 其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪癌病毒聚合酶X或其变体，其由选自 W下的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQID N0:2的氨基酸序列、根据SEQIDN0:3的氨基酸序列和根据SEQIDN0:4的氨基酸序列。
[0021] 在所述第一方面的第十H实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性 展现部分选自聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球 菌DNA聚合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌（Thermococ州S gorgonarius)DNA聚合酶、KOD聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合 酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、 EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、"Tbr 聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、订i聚合 酶、Ampli^Taq、Stoffel片段、9。NmDNA聚合酶、Therminator、TherminatorII、Pension Hi曲Fidelity聚合酶、PaqSOOO、Pfx-50、Proofstart、Fideli^Taq、Elongase及其变体，
[0022] 其中所述聚合酶活性展现部分优选为化o4聚合酶或其变体，其由选自W下的氨 基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0023]在所述第一方面的第十四实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十H实施方案的一个实施方案中， 所述反应步骤是在允许添加所述至少一个或多个k核巧酸到所述第一k核酸，优选允许 添加5至20, 000个k核巧酸、优选10至2, 000个k核巧酸、更优选50至500个k核巧 酸、最优选50至100个k核巧酸的条件下进行。
[0024]在所述第一方面的第十五实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H和第十四实施方案的一个实施 方案中，所述添加至少一个或多个k核巧酸到所述第一k核酸是所述至少一个或多个 k核巧酸共价结合到所述第一k核酸，优选通过在所述第一k核酸的3'OH与所述至少一 个或多个心核巧酸之一的5'磯酸之间形成3'-5'磯酸二醋键。
[0025]在所述第一方面的第十六实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四和第十五实施方案的一 个实施方案中，所述第一k核酸是由DNA、RNA、经修饰的DNA、经修饰的RNA或其组合组成 的引物。
[0026]在所述第一方面的第十走实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六实施 方案的一个实施方案中，所述第一k核酸由k核巧酸和任选的修饰组成。
[0027]在所述第一方面的第十八实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第^^一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六W及 第十走实施方案的一个实施方案中，所述第一k核酸由k核巧酸组成。
[0028]在所述第一方面的第十九实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六、第 十走和第十八实施方案的一个实施方案中，所述反应还包括第二心核酸，其中优选通过沃 森-克里克碱基配对使一分子的所述第一k核酸与一分子的所述第二k核酸杂交。
[0029] 在所述第一方面的第二十实施方案，也是所述第一方面的第十九实施方案的一个 实施方案中，所述聚合酶活性展现部分合成与所述第二k核酸互补的第Hk核酸，其中所 述第Hk核酸包含所述第一k核酸和添加到所述第一k核酸的3'端的k核巧酸。
[0030] 在第二方面，也是所述第二方面的第一实施方案中，通过一种用于在心核巧酸和 包含酶活性展现部分的蛋白质存在下扩增祀心核酸的方法也解决了本申请潜在的问题， 其中所述酶活性能够扩增所述祀k核酸。
[0031] 在所述第二方面的第二实施方案，也是所述第二方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0032] 在所述第二方面的第H实施方案，也是所述第二方面的第一和第二实施方案的一 个实施方案中，所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部分。
[0033] 在所述第二方面的第四实施方案，也是所述第二方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0034] 在所述第二方面的第五实施方案，也是所述第二方面的第四实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
[0035] 在所述第二方面的第六实施方案，也是所述第二方面的第H、第四和第五实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含至少300个氨基酸。
[0036] 在所述第二方面的第走实施方案，也是所述第二方面的第六实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900个之间的氨基酸，优选 介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨基酸，最优选介于340 和360个之间的氨基酸。
[0037] 在所述第二方面的第八实施方案，也是所述第二方面的第四、第五和第六实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0038] 在所述第二方面的第九实施方案，也是所述第二方面的第八实施方案的一个实施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶活性。
[0039] 在所述第二方面的第十实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分是酶。
[0040] 在所述第二方面的第十一实施方案，也是所述第二方面的第H、第四、第五、第六、 第走、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分是聚合酶。
[0041] 在所述第二方面的第十二实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分选自非洲 猪癌病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列诺片 段、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚 合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一个和任一个的变体，
[0042] 其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪癌病毒聚合酶X或其变体，其由选自 W下的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQID NO:2的氨基酸序列、根据SEQIDNO:3的氨基酸序列和根据SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0043] 在所述第二方面的第十H实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性 展现部分选自聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球 菌DNA聚合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、KOD 聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、 Poc聚合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合 酶、Expand聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚 合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片 段、9。NmDNA聚合酶、TherminatoiNTherminatorII、PensionHi曲Fidelity聚合酶、 F*aq5000、Pfx-50、Proofstart、Fidemaq、Elongase及其变体，
[0044] 其中所述聚合酶活性展现部分优选为化〇4聚合酶或其变体，其由选自W下的氨 基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0045] 在所述第二方面的第十四实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十H实施方案的一个实施方案中， 所述反应步骤是在允许扩增所述祀k核酸的条件下进行。
[0046] 在所述第二方面的第十五实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H和第十四实施方案的一个实施 方案中，所述方法使用至少一个引物，优选使用两个引物，其中所述至少一个引物由心核 巧酸和任选的修饰组成。
[0047] 在所述第二方面的第十六实施方案，也是所述第二方面的第十五实施方案的一个 实施方案中，所述引物由k核巧酸组成。
[0048] 在所述第二方面的第十走实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第^;：、第八、第九、第十、第^-、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六实施 方案的一个实施方案中，所述祀k核酸由k核巧酸组成。
[0049] 在所述第二方面的第十八实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六和第 十走实施方案的一个实施方案中，所述方法是聚合酶链式反应。
[0050] 在所述第二方面的第十九实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六、第 十走和第十八实施方案的一个实施方案中，所述祀k核酸由kDNA组成。
[0051] 在所述第二方面的第十实施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六、第十走、 第十八和第十九实施方案的一个实施方案中，所述祀k核酸由20至20, 000个k核巧酸， 优选30至2, 000个k核巧酸，更优选40至500个k核巧酸，最优选50至100个k核巧 酸组成。
[0052] 在第H方面，也是所述第H方面的第一实施方案中，通过一种包含酶活性展现部 分的蛋白质也解决了本申请潜在的问题，其中所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其 中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸，其中所述酶活性能够添加一个或多个k核巧酸 到所述第一k核酸的3'端。
[0053]在所述第H方面的第二实施方案，也是所述第H方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部分。
[0054]在所述第H方面的第H实施方案，也是所述第H方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0055]在所述第H方面的第四实施方案，也是所述第H方面的第H实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
[0056]在所述第H方面的第五实施方案，也是所述第H方面的第二、第H和第四实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含至少300个氨基酸。
[0057]在所述第H方面的第六实施方案，也是所述第H方面的第五实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900个之间的氨基酸，优选 介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨基酸，最优选介于340 和360个之间的氨基酸。
[0058]在所述第H方面的第走实施方案，也是所述第H方面的第H、第四、第五和第六实 施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0059]在所述第H方面的第八实施方案，也是所述第H方面的第走实施方案的一个实施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶活性。
[0060]在所述第H方面的第九实施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第四、第 五、 第六、第走和第八实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分是酶。
[0061]在所述第H方面的第十实施方案，也是所述第H方面的第二、第H、第四、第五、第 六、 第走和第八实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分是聚合酶。
[0062]在所述第H方面的第十一实施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第走、 第八、第九和第十实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分选自非洲猪癌病 毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列诺片段、克 列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚合酶、 DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一个和任一个的变体，
[0063]其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪癌病毒聚合酶X或其变体，其由选自W下的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQID NO:2的氨基酸序列、根据SEQIDNO:3的氨基酸序列和根据SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0064]在所述第H方面的第十二实施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九和第十实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分 选自聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚 合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、KOD聚合酶、 Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合 酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand 聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚 合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、订i聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9。NmDNA 聚合酶、TherminatoiNTherminatorII、PhusionHi曲Fidelity聚合酶、Paq5000、Pfx_50、 Proofstart、Fidemaq、Elongase及其变体，
[0065] 其中所述聚合酶活性展现部分优选为化o4聚合酶或其变体，其由选自W下的氨 基酸序列的所选氨基酸序列组成；根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0066] 在第四方面，也是所述第四方面的第一实施方案中，通过一种包含根据SEQID NO: 15的氨基酸序列的聚合酶也解决了本申请潜在的问题，其中所述氨基酸序列的氨基酸 是D-氨基酸。
[0067] 在第五方面，也是所述第五方面的第一实施方案中，通过一种包含根据SEQID NO: 1的氨基酸序列的聚合酶也解决了本申请潜在的问题，其中所述氨基酸序列的氨基酸是 D-氨基酸。
[0068] 在第六方面，也是所述第六方面的第一实施方案中，通过一种野生型聚合酶的聚 合酶变体也解决了本申请潜在的问题，其中所述野生型聚合酶由根据SEQIDN0:15的氨基 酸序列组成，且其中所述聚合酶变体具有聚合酶活性，优选具有热稳定的聚合酶活性。
[0069] 在所述第六方面的第二实施方案，也是所述第六方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶变体包含氨基酸序列，其中所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生 型聚合酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸位置上不同。
[0070] 在所述第六方面的第H实施方案，也是所述第六方面的第一和第二实施方案的一 个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一个或 两个氨基酸位置上不同。
[0071] 在所述第六方面的第四实施方案，也是所述第六方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在 根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列的氨基酸位置155和/或203上或在与其对应的氨基酸 位置上不同，其中优选W半脫氨酸取代位置155和/或203上的氨基酸。
[0072] 在所述第六方面的第五实施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H和第四 实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体由选自W下的氨基酸序列组成：根据SEQID NO: 16的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列和根据SEQIDNO: 18的氨基酸序 列。
[0073] 在所述第六方面的第六实施方案，也是所述第六方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶变体由选自W下的氨基酸序列组成：根据SEQIDN0:19 的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 21的氨基酸序列和根据 SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0074] 在所述第六方面的第走实施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0075] 在所述第六方面的第八实施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列的氨基酸是心氨基 酸。
[0076] 在第走方面，也是所述第走方面的第一实施方案中，通过一种野生型聚合酶的聚 合酶变体也解决了本申请潜在的问题，其中所述野生型聚合酶由根据SEQIDN0:1的氨基 酸序列组成，且其中所述聚合酶变体具有聚合酶活性。
[0077] 在所述第走方面的第二实施方案，也是所述第走方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述聚合酶变体包含氨基酸序列，其中所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生 型聚合酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸位置上不同。
[0078] 在所述第走方面的第H实施方案，也是所述第走方面的第一和第二实施方案的一 个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一个氨 基酸位置上不同。
[0079] 在所述第走方面的第四实施方案，也是所述第走方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在 至少一个氨基酸位置上不同，其中所述至少一个氨基酸位置选自氨基酸位置80、氨基酸位 置86和氨基酸位置124,各氨基酸序列根据SEQIDNO: 1或在与其对应的氨基酸位置上。
[0080] 在所述第走方面的第五实施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H和第四 实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体由选自W下的氨基酸序列组成：根据SEQID N0:2的氨基酸序列、根据SEQIDN0:3的氨基酸序列和根据SEQIDN0:4的氨基酸序列。
[0081] 在所述第走方面的第六实施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H、第四和 第五实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0082] 在所述第走方面的第走实施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶变体的氨基酸序列的氨基酸是心氨基 酸。
[0083] 在第八方面，也是所述第八方面的第一实施方案中，通过在用于添加一个或多个 k核巧酸到心核酸的3'端的方法中使用包含酶活性展现部分的蛋白质也解决了本申请潜 在的问题。
[0084] 在第九方面，也是所述第九方面的第一实施方案中，通过在用于在k核巧酸存在 下扩增祀心核酸的方法中使用包含酶活性展现部分的蛋白质也解决了本申请潜在的问 题。
[0085] 在所述第九方面的第二实施方案，也是所述第九方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述用于扩增祀k核酸的方法是聚合酶链式反应。
[0086] 在所述第八方面的第二实施方案，也是所述第八方面的第一实施方案的一个实施 方案中和在所述第九方面的第H实施方案中，所述蛋白质是根据所述第H、第四、第五、第 六和第走方面的任何实施方案的蛋白质，其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨 基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0087] 在第十方面，也是所述第十方面的第一实施方案中，通过一种用于鉴别结合祀分 子的k核酸分子的方法也解决了本申请潜在的问题，所述方法包括W下步骤：
[0088] (a)产生k核酸分子的异源群体；
[0089] 化）使步骤（a)的k核酸分子的异源群体与所述祀分子接触；
[0090] (C)分离未被所述祀分子结合的k核酸分子；和
[0091] (d)扩增被所述祀分子结合的k核酸分子，其中所述扩增步骤使用根据所述第 H、第四、第五、第六和第走方面的任何实施方案的蛋白质，
[0092] 其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0093] 在所述第十方面的第二实施方案，也是所述第十方面的第一实施方案的一个实施 方案中，所述方法还包括W下步骤：
[0094] (e)对被所述祀分子结合的k核酸分子进行测序；和
[0095] (f)合成核巧酸序列与步骤（e)中所测序的k核酸分子的核巧酸序列一致的核酸 分子。
[0096] 在所述第十方面的第H实施方案，也是所述第十方面的第一和第二实施方案的一 个实施方案中，步骤（a)的心核酸分子的异源群体的核酸分子在其5'端及其3'端上包 含引物结合位点和分别与引物结合位点互补的序列，该允许通过聚合酶链式反应来扩增步 骤（d)中所获得的心核酸分子，其中所述聚合酶链式反应中所使用的聚合酶是根据所述第 H、第四、第五、第六和第走方面的任何实施方案的蛋白质，所述聚合酶链式反应中所使用 的引物由k核巧酸组成，且所述聚合酶链式反应中所使用的核巧酸是k核巧酸。
[0097] 在所述第十方面的第四实施方案，也是所述第十方面的第一、第二和第H实施方 案的一个实施方案中，在步骤（d)之后引入W下步骤：
[0098] (da)使扩增的核酸分子与所述祀分子接触，其中
[009引步骤化）和任选的步骤（C)和/或（d)是在步骤（e)之前进行，其中步骤（da)、化）、（C)和任选的（d)是按照该个顺序进行一次或若干次。
[0100] 在所述第十方面的第五实施方案，也是所述第十方面的第一、第二、第H和第四实 施方案的一个实施方案中，所述结合祀分子的k核酸是DNA。
[0101] 在所述第十方面的第六实施方案，也是所述第十方面的第一、第二、第H、第四和 第五实施方案的一个实施方案中，所述结合祀分子的k核酸分子由k核巧酸组成。
[0102] 在第十一方面，也是所述第十一方面的第一实施方案中，通过一种用于产生根据 所述第H、第四、第五、第六和第走方面的任何实施方案的蛋白质的方法也解决了本申请潜 在的问题，其中
[0103] a)化学合成根据所述第H、第四、第五、第六和第走方面的任何实施方案的蛋白质 的两个或更多个片段，其中所述片段W其整体形式形成所述蛋白质的氨基酸序列，优选通 过固相肤合成来合成所述片段，且
[0104] b)通过链段缩合、天然化学连接、酶连接或其组合将步骤a)的片段彼此连接，
[0105] 其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0106] 在所述第^^一方面的第二实施方案，也是所述第^^一方面的第一实施方案的一个 实施方案中，酶连接中所使用的所述酶是梭菌蛋白酶。
[0107] 在第十二方面，也是所述第十二方面的第一实施方案中，通过一种用于通过酶连 接将第一D-肤或第一D-蛋白质与第二D-肤或第二D-蛋白质彼此连接的方法也解决了本 申请潜在的问题，其中
[0108] 所述第一D-肤或所述第一D-蛋白质在其N末端由保护基保护，且在其C末端由 4-脈基苯基醋基团保护，且
[0109] 所述第二D-肤或所述第二D-蛋白质包含游离N末端和处于其C末端的硫代焼基 醋基团基团或硫代芳基醋基团。
[0110] 在所述第十二方面的第二实施方案，也是所述第十二方面的第一实施方案的一个 实施方案中，所述酶连接中所使用的酶是梭菌蛋白酶。
[0111] 本发明的发明人梅讶地发现，有可能化学合成由D-氨基酸组成的具有功能活性 的蛋白质，由此所述蛋白质具有如聚合酶通常呈现的大小。更具体地说，本发明的发明人已 经发觉了一种允许合成所述D-蛋白质和D-聚合酶（即，由D-氨基酸组成的聚合酶，其具 有作为聚合酶的活性）的方法。基于该个令人惊讶的发现核酸和心核酸分子的酶促 合成所需的蛋白质和酶活性现在是可用的。k核酸和k核酸分子的所述酶促合成包括但 不限于用于添加一个或多个k核巧酸到第一k核酸的3'端的方法和用于在k核巧酸存 在下扩增祀k核酸作为心核酸（即，扩增产物是k核酸）的方法。
[0112] 由于该些方法和酶活性是用来鉴别镜像异构体的替代方法的一部分，故现在可W 将所述鉴别镜像异构体的替代方法付诸实践。
[0113]本发明的发明人已经开发出一种用于添加一个或多个k核巧酸到第一k核酸的 3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个 k核巧酸与所述第一k核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个k核巧酸 到所述第一k核酸的3'端。
[0114]在一个优选实施方案中，酶活性能够添加5至20, 000个k核巧酸到所述第一k核酸的3'端，优选10至2, 000个k核巧酸，更优选50至500个k核巧酸，最优选50 至100个心核巧酸。
[0115] 如本文中优选使用的术语添加是分子之间的共价键合，根据本发明为心核酸的 共价键合和所述至少一个或多个k核巧酸与所述k核酸的共价键合，优选通过在所述第 一k核酸的3'OH与所述至少一个或多个k核巧酸之一的5'磯酸之间形成3' -5'磯酸二 醋键。根据本发明，添加到k核酸的k核巧酸形成了被所述k核巧酸延长的k核酸的 3'端。
[0116] 在一个优选实施方案中，所述用于添加一个或多个k核巧酸到第一k核酸的3' 端的方法包括第二k核酸，其中优选通过沃森-克里克碱基配对使一分子的第一k核酸 与一分子的第二k核酸杂交。在一个更优选的实施方案中，所述方法允许合成与所述第二 k核酸互补的第Hk核酸，其中所述第Hk核酸包含所述第一k核酸和添加到所述第一 k核酸的3'端的k核巧酸，即，针对第一k核酸，添加一个或多个k核巧酸到第一心核 酸的3'端，从而产生所述第核酸。
[0117]根据本发明的包含酶活性展现部分的蛋白质包括仅具有酶活性展现部分的蛋白 质和具有酶活性展现部分跟其它残基或部分的蛋白质，其中所述蛋白质的其它残基或部分 不具有酶活性。根据本发明，所述酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900个之间 的氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨基酸， 最优选340至360个氨基酸。
[0118]根据本发明的包含酶活性展现部分的蛋白质优选为聚合酶活性展现部分。根据本 发明的包含聚合酶活性展现部分的蛋白质包括仅具有聚合酶活性展现部分的聚合酶和具 有聚合酶活性展现部分跟其它残基或部分的聚合酶，其中所述聚合酶的其它残基或部分不 具有聚合酶活性。根据本发明，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900 个之间的氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨 基酸，最优选340至360个氨基酸。
[0119] 根据本发明的聚合酶活性展现部分优选为热稳定的聚合酶活性展现部分，更优选 为热稳定的DNA聚合酶活性展现部分，且最优选为热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶活性展 现部分。
[0120] 根据本发明的聚合酶活性展现部分优选为DNA聚合酶活性展现部分，更优选为 DNA依赖性DNA聚合酶活性展现部分或热稳定的DNA聚合酶活性展现部分，最优选为热稳定 的DNA依赖性DNA聚合酶活性展现部分。
[0121] 如本文中所使用的术语酶活性是催化特定反应，优选为添加一个或多个核巧酸到 核酸的3'端、扩增核酸和/或聚合酶活性，更优选为添加一个或多个k核巧酸到k核酸 的3'端和扩增k核酸。
[0122] 根据本发明的术语聚合酶活性是酶使k核巧酸聚合和/或k核巧酸与k核酸 聚合的能力，其中k核巧酸优选为k核巧H磯酸。
[0123] 根据本发明的聚合酶活性优选为热稳定的聚合酶活性，更优选为热稳定的DNA聚 合酶活性，且最优选为热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶活性。
[0124] 根据本发明的聚合酶活性优选为DNA聚合酶活性，更优选为DNA依赖性DNA聚合 酶活性或热稳定的DNA聚合酶活性，最优选为热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶活性。
[01巧]已知的聚合酶来自于天然来源或者是来自于天然来源的聚合酶的经过优化或突 变的变体。聚合酶由手性构筑块，即k氨基酸组成。因此，聚合酶的结构也固有地是手性 的，从而引起立体特异性底物识别。因此，该些酶仅接受呈胜任的，即对应的手性构型的底 物分子。因此，已知的聚合酶使D-核巧酸或H磯酸D-核巧酸聚合，其中它们用作由D-核 巧酸组成的模板链D-核酸W合成由D-核巧酸组成的互补D-核酸链。除模板链W外，聚 合酶任选地使用与所述模板链杂交且由D-核巧酸组成的引物。因为天然存在的核酸是由 D-核巧酸构成，且可W由确切地说由k氨基酸组成的蛋白质和酶加W处理（例如扩增）， 故由k氨基酸组成的所述蛋白质和酶对应地不识别k核酸。因此，结合祀分子或祀结构 (也称为镜像异构体）的k核酸不能通过体外选择方法使用所述祀分子或祀结构的天然存 在的形式直接获得。
[0126] 本发明的发明人梅讶地发现，有可能产生一种可W添加k核酸核巧酸到能与 k核酸模板链杂交的由k核巧酸组成的引物的聚合酶。此外，本发明的发明人梅讶地发 现，有可能产生一种可用于扩增心核酸，优选用于被称为聚合酶链式反应（缩写PCR)的方 法中的聚合酶。
[0127] 聚合酶是一种能使核巧H磯酸聚合的酶。聚合酶使用模板核酸链来合成与所述模 板核酸链互补的核酸链。除模板核酸链W外，聚合酶任选地使用基于碱基互补性与模板核 酸链杂交的引物。模板核酸链、引物和由聚合酶合成的核酸链可W独立地为DNA或RNA。如 本文中优选使用的聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶，优选为DNA依赖性DNA聚合酶、RNA 依赖性DNA聚合酶（诸如逆转录酶）、RNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性DNA聚合酶。更 优选地，聚合酶是热稳定的聚合酶。聚合酶不需要含有对应的天然或野生型酶中所发现的 所有氨基酸，而是仅需要含有足W允许所述聚合酶实现所要的催化活性的氨基酸。在一个 实施方案中，聚合酶活性是催化活性，所述催化活性选自包括例如5'-3'聚合活性、5'-3' 核酸外切酶活性和3'-5'核酸外切酶活性的催化活性。
[0128] 根据本发明的聚合酶由D-氨基酸组成且能使k核巧酸或k核巧H磯酸聚合，其 中根据本发明的聚合酶用作由k核巧酸组成的模板链k核酸W合成由k核巧酸组成的 互补k核酸链。除模板链W外，根据本发明的聚合酶任选地使用能与所述模板链杂交且由 レ核巧酸组成的引物。模板链、引物和所合成的核酸链可W独立地为レDNA或レRNA。根 据本发明的聚合酶包括由D-氨基酸组成的DNA聚合酶和由D-氨基酸组成的RM聚合酶， 优选包括由D-氨基酸组成的DNA依赖性DNA聚合酶、由D-氨基酸组成的RNA依赖性DNA 聚合酶（诸如由D-氨基酸组成的逆转录酶）、由D-氨基酸组成的RNA依赖性RNA聚合酶 和由D-氨基酸组成的RNA依赖性DNA聚合酶。更优选地，根据本发明的聚合酶是由D-氨 基酸组成的热稳定的聚合酶。根据本发明的聚合酶不需要含有天然酶中所发现的所有氨基 酸，而是仅需要含有足W允许根据本发明的聚合酶实现所要的催化活性的氨基酸。催化活 性包括例如5'-3'聚合活性、5'-3'核酸外切酶活性和3'-5'核酸外切酶活性。
[0129] 仅由k氨基酸组成的聚合酶在本文中优选地称为"全L聚合酶"。
[0130] 仅由D-氨基酸组成的聚合酶在本文中优选地称为"全D聚合酶"。
[0131] 在一个优选实施方案中，根据本发明的聚合酶选自非洲猪癌病毒聚合酶X、嗜热细 菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列诺片段、克列诺外切聚合酶、 T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合 酶入、聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DM 聚合酶、P化化rbo?聚合酶、硫賴矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、KOD聚合 酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚 合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-hq?聚合酶、LA-TaqTM聚合酶、 Expand?聚合酶、Platinum?Taq聚合酶、Hi-Fi?聚合酶、Tbr聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚 合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Ampli化q?、Stoffel片 段、9。Nm?DNA聚合酶、TherminatorTMjherminatorII?JhusionHi曲Fidelity? 聚合 酶、PaqSOOO?、Pfx-50?、Proofstart?、Fidemaq?、Eiongase? 及其中每一个和任一个的 变体。
[0132] 在一个更优选的实施方案中，根据本发明的聚合酶是由根据SEQIDNO: 1的氨基 酸序列组成的非洲猪癌病毒聚合酶X。在另一个更优选的实施方案中，根据本发明的聚合酶 是非洲猪癌病毒聚合酶X的变体，最优选为具有选自W下的氨基酸序列的所选氨基酸序列 的非洲猪癌病毒聚合酶X的变体：根据SEQIDNO: 2的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 3的氨 基酸序列和根据SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0133] 在一个更优选的实施方案中，根据本发明的聚合酶是由根据SEQIDN0:15的氨 基酸序列组成的聚合酶化〇4。在另一个更优选的实施方案中，根据本发明的聚合酶是聚合 酶化〇4的变体，最优选为由选自W下的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成的聚合酶化〇4 的变体：根据SEQIDNO: 16的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQID NO: 18的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 20的氨基酸序列、 根据SEQIDNO:21的氨基酸序列和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0134] 聚合酶的变体是在一个或多个氨基酸位置上与所述聚合酶的氨基酸序列不同的 聚合酶。氨基酸序列中的氨基酸位置优选由其相对于聚合酶的N末端和C末端的位置和/ 或其相对于围绕所述氨基酸的氨基酸的位置确定，使得
[0135] a)如果聚合酶在N末端被截短，则氨基酸的位置由其相对于聚合酶的C末端和相 对于围绕所述氨基酸的氨基酸的位置确定，
[0136]b)如果聚合酶在C末端被截短，则氨基酸的位置由其相对于聚合酶的N末端和相 对于围绕所述氨基酸的氨基酸的位置确定，且
[0137]b)如果聚合酶在N末端和C末端被截短，则氨基酸的位置由其相对于围绕所述氨 基酸的氨基酸的位置确定。
[013引根据本发明的热稳定的聚合酶相对不受高温影响。在一个具体的非限制性实施例 中，具有热稳定性的聚合酶不受至少5(TC的温度，例如5(TC、6(TC、75 °C、8(TC、82 °C、85C、 88 °C、9(TC、92 °C、95 °C或甚至更高的温度影响。
[0139] 在心核巧H磯酸的聚合过程内，聚合酶添加一个核巧H磯酸到另一个核巧H磯 酸，优选地产生寡核巧酸，也称为核酸。在一个优选的实施方案中，所述聚合酶仅添加一个 核巧H磯酸到一个核巧H磯酸或到核酸的末端核巧酸，例如，如果核巧酸是诸如双脱氧核 巧酸的链终止核巧酸的话。所述链终止核巧酸用于对核酸进行测序，并且是本领域技术人 员已知的。
[0140]k核巧H磯酸的聚合过程可用于扩增k核酸，优选为祀k核酸。
[0141] 扩增是增加核酸（优选为祀k核酸）的拷贝数的任何过程。
[0142] 在一个优选实施方案中，所述祀k核酸由20至20, 000个k核巧酸，优选30至 2, 000个k核巧酸，更优选40至500个k核巧酸，最优选50至100个k核巧酸组成。
[0143]扩增的一个例子是其中使核酸与一对引物在允许所述引物与核酸模板杂交的条 件下接触。聚合酶通过在合适的条件下添加一个或多个核巧H磯酸到引物来延伸引物，弓I 物与核酸模板分离，然后进行再退火、延伸和分离W扩增核酸分子的拷贝数。可W使用标准 技术通过电泳、限制性内切酶裂解模式、寡核巧酸杂交或连接、和/或核酸测序来表征体外 扩增的产物。
[0144] 替代的体外扩增技术是本领域技术人员已知的，包括无转录等温扩增、链置换扩 增和NASBA?无RNA转录扩增。
[0145] 一些扩增方法依赖于热循环，其由用于使核酸（优选为双链核酸）解链和酶促复 制核酸的反应的重复加热和冷却循环组成。该些热循环步骤首先对于在高温下在称为核酸 解链的过程中物理分离双链核酸中的两条链是必需的。在较低温度下，各链则在核酸合成 中被聚合酶用作模板W便选择性地扩增祀核酸。含有与祀区互补的序列的引物连同聚合酶 (所述方法是据此命名）是使得能够进行选择性和重复扩增的关键组分。由于扩增方法基 于热循环进展，故将所产生的核酸本身用作复制模板，从而开始链反应，其中指数扩增核酸 模板。
[0146] 利用热扩增的最突出的扩增方法是聚合酶链式反应（缩写PCR)。
[0147] 引物是由DNA或RNA或其组合，优选长度为10个核巧酸或更多的DNA寡核巧酸组 成的短核酸分子。更优选地，较长的引物的长度可W是约15、20或25个核巧酸或更多。引 物可W通过核酸杂交与互补的祀核酸链退火，W便在引物与祀核酸链之间形成杂交物，然 后由聚合酶沿祀核酸链延伸引物。弓I物对可W用于扩增核酸，例如通过PCR或本领域中已 知的其它核酸扩增方法。
[0148] 使用由D-氨基酸组成的本发明的聚合酶使得引物和互补祀核酸链由k核巧酸组 成很有必要。优选至少一个引物由k核巧酸和任选的修饰组成。
[0149] 用于制备和使用核酸引物和探针的方法描述于例如Sambrook等（Sambrock 等，1989)中。PCR引物对可W来源于已知序列，例如通过使用意在用于该目的的计算机程 序，诸如Primer。本领域技术人员应了解，特定探针或引物的特异性随其长度而增加。
[0150] 根据本发明的聚合酶由D-氨基酸组成。因此由D-氨基酸组成的根据本发明的聚 合酶无法从天然来源分离且无法使用细菌、酵母、真菌、病毒或动物细胞通过重组表达产生 并且不得不通过化学方法产生，所述化学方法优选诸如固相肤合成（缩写SPP巧与连接法 的组合。
[0151]固相肤合成是用于合成肤或蛋白质片段的现有技术；用可W在上面构筑肤链的功 能单元（'连接子'）处理不溶但多孔的小固体珠粒。肤将保持共价连接于珠粒，直到通过 诸如无水氣化氨或H氣己酸的试剂从它上面裂解。所述肤因而'固定'在所述固相上且在 过滤过程期间可W被保留，而液相试剂和合成副产物则被冲洗掉。SPPS的一般原理是重复 偶合-洗涂-脱保护-洗涂循环的原理。固相连接肤的游离N末端胺偶合（见下文）于单 个经N-保护的氨基酸单元。然后对该个单元进行脱保护，露出可能与另一氨基酸连接的新 的N末端胺。该种技术的优越性部分在于能够在各反应之后进行洗涂循环，从而去除过量 试剂，而所有正在生长的目的肤保持共价连接于不溶性树脂。有两种主要使用的SPPS形 式，即Fmoc和Boc。氨基酸单体的N末端由该两个基团中的任一个加W保护且被添加到脱 保护的氨基酸链上。SPPS受产率限制，且通常在70个氨基酸范围内的肤和蛋白质推进了合 成可及性的极限。合成难度也具有序列依赖性。较大的合成寡肤和蛋白质可W通过使用诸 如片段缩合、天然化学连接或酶促连接的连接法将两个肤偶合在一起来获取。然而，迄今合 成的最大的D-蛋白质是由102个D-氨基酸组成的血管生成蛋白血管内皮生长因子（缩写 VEGF-A)的D-蛋白质形式（Mandal等，2012)，
[0152]片段缩合使用肤，其中所述肤的氨基酸的侧链完全由化学基团保护且所述肤在溶 液中偶合。
[0153] 天然化学连接是在水溶液中进行。挑战是必需的无保护肤-硫醋构筑块的制备。 在天然化学连接中，无保护肤2的N末端半脫氨酸残基的姪硫基在水性缓冲液中在pH7. 0、 2(TC<T<37°C下攻击第二无保护肤1的C末端硫醋。该个可逆的转硫醋化步骤具有化学选 择性和区域选择性，且导致形成硫醋中间物3。该种中间物通过分子内S，N-醜基位移进行 重排，从而在连接位点上形成天然醜胺（'肤'）键4。
[0154] 如实施例中所示，发明人可能令人梅讶地示出了天然化学连接所必需的C末端硫 醋在酶促连接的条件下是稳定的，使得天然化学连接和酶促连接可W组合使用。
[0155]D-肤的酶促连接通过使用蛋白酶实现，包括W下步骤；（a)制备氨基组分，其中所 述氨基组分是唯一的D-肤；化）制备駿基组分，其中所述駿基组分包含离去基团并且是唯 一的D-肤；和（C)在蛋白酶存在下使所述氨基组分与所述駿基组分反应，W便在所述氨基 组分与所述駿基组分之间形成肤键，在离去基团裂解的情况下得到唯一的D-多肤（参见 W02003047743)。优选所述蛋白酶为梭菌蛋白酶。
[0156] 本发明的聚合酶还应包括实质上与本发明的聚合酶且确切地说，与本文中所公 开的特定序列同源的聚合酶。术语基本上同源的应理解为诸如同源性为至少75%，优选 85 %，更优选90 %且最优选高于95 %、96 %、97 %、98 %或99 %。
[0157] 本发明的聚合酶活性展现部分还应包括实质上与本发明的聚合酶活性展现部分 且确切地说，与本文中所公开的特定序列同源的聚合酶活性展现部分。术语基本上同源的 应理解为诸如同源性为至少75 %，优选85 %，更优选90 %且最优选高于95 %、96 %、97 %、 98%或 99%。
[0158] 本发明的聚合酶或本发明的聚合酶活性展现部分中所存在的同源氨基酸的实际 百分比将取决于所述聚合酶或聚合酶活性展现部分中所存在的氨基酸的总数。修饰百分比 可W基于所述聚合酶或聚合酶活性展现部分中所存在的氨基酸的总数。
[0159] 两个聚合酶或两个聚合酶活性展现部分之间的同源性可W如本领域技术人员已 知来确定。更具体地说，可W使用序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列 相对于参考序列的序列同源性百分比。所述测试序列优选为聚合酶或聚合酶活性展现部 分，据称其与不同的聚合酶或聚合酶活性展现部分同源或将测试其是否与不同的聚合酶 或聚合酶活性展现部分同源和如果同源的话达到何种程度，由此所述不同的聚合酶或聚 合酶活性展现部分也称为同源性参考序列。可W对用于比较的聚合酶的氨基酸序列进行 最佳比对，例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法（Smith&Waterman, 1981)、通 过Needleman和Wunsch的同源性比对算法（Needleman&Wunsch, 1970)、通过Pearson和 Lipman的相似性查找法（Pearson&Lipman, 1988)、通过计算机实施该些算法（威斯康星 遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup, 575Science 化.，Madison,Wis.)或通过目视检查。
[0160] 适合于测定序列同一性百分比的算法的一个例子是基本局部比对搜索工具（在 下文中,"BLAST")中所使用的算法，参见例如Altschul等（Altschul等，1990和Altschul 等，1997)。用于执行BLAST分析的软件可W通过美国国家生物技术信息中也（在下文中， "NCBI")公开获得。使用可获自NCBI的软件，例如BLASTN(用于核巧酸序列）和BLASTP(用 于氨基酸序列）测定序列同一性时所使用的缺省参数描述于McGinnis等（McGinnis 等，2004)中。
[0161] 本发明的聚合酶还应包括相对于本发明的聚合酶且确切地说，相对于本文中所公 开的和由它们的氨基酸序列定义的本发明的特定聚合酶具有某种程度的同一性的聚合酶。 更优选地，本发明还包括相对于本发明的聚合酶且确切地说，相对于本文中所公开的和由 它们的氨基酸序列或其部分定义的本发明的特定聚合酶具有至少75%、优选85%、更优选 90%且最优选超过95%、96%、97%、98%或99%的同一性的聚合酶。
[0162] 本发明的聚合酶活性展现部分还应包括相对于本发明的聚合酶活性展现部分且 确切地说，相对于本文中所公开的和由它们的氨基酸序列定义的本发明的特定聚合酶活性 展现部分具有某种程度的同一性的聚合酶活性展现部分。更优选地，本发明还包括相对于 本发明的聚合酶活性展现部分且确切地说，相对于本文中所公开的和由它们的氨基酸序列 或其部分定义的本发明的特定聚合酶活性展现部分具有至少75%、优选85%、更优选90% 且最优选超过95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性的那些聚合酶活性展现部分。
[0163] 结合本申请，如果不存在明确相反的指示，则术语核酸分子和核酸是W可互换的 方式使用。
[0164] 如本文中优选使用，"核酸"是指多核巧酸或寡核巧酸，诸如脱氧核糖核酸（缩写 DNA)和核糖核酸（缩写RNA)。此外，术语"核酸唯括多种核酸。术语"核酸（nucleicacid) 和核酸（nucleicacids)"还应理解为包括由核巧酸类似物制备的RNA或DNA的变体和类 似物、单链（有义或反义）和双链多核巧酸或寡核巧酸作为等效物。脱氧核糖核巧酸包括 脱氧腺巧、脱氧胞巧、脱氧鸟巧和脱氧胸巧。核糖核巧酸包括腺巧、胞巧、鸟巧和尿巧。称为 "多核巧酸"的核酸分子W其最广泛的意义用于意指由共价键连接的两个或更多个核巧酸 或核巧酸类似物，包括单链或双链分子。术语"寡核巧酸"在本文中还用于意指由共价键连 接的两个或更多个核巧酸或核巧酸类似物，但是如本文中所定义，寡核巧酸包含少于一百 个核巧酸。
[0165] 核酸的特征在于，形成核酸的所有连续核巧酸都是通过一个或多于一个共价键彼 此连接。更具体地说，所述核巧酸各自优选通过磯酸二醋键或其它键与两个其它核巧酸连 接或连接至两个其它核巧酸，从而形成连续核巧酸的延伸段。然而，在所述排列中，两个末 端核巧酸，即，优选在5'端和3'端的核巧酸，各自仅连接到单个核巧酸，条件是所述排列是 线性的而不是环形的排列，且因而是线性的而不是环形的分子。
[0166] 在本申请的另一个实施方案中，所述核酸包含至少两组连续核巧酸，由此在连续 核巧酸的各组内，各核巧酸优选通过磯酸二醋键或其它键与两个其它核巧酸连接或连接至 两个其它核巧酸，从而形成连续核巧酸的延伸段。然而，在所述排列中，两个末端核巧酸， 目P，优选在5'端和3'端的核巧酸，各自仅连接到单个核巧酸。然而，在所述实施方案中，两 组连续核巧酸不是通过共价键彼此连接或连接至彼此，所述共价键通过共价键，优选通过 所述两个核巧酸之一的糖部分与所述两个核巧酸或核巧中另一者的磯部分之间形成的共 价键来连接一组中的一个核巧酸与另一组或其它组中的一个核巧酸。然而，在替代实施方 案中，两组连续核巧酸是通过共价键彼此连接或连接至彼此，所述共价键通过共价键，优选 通过所述两个核巧酸之一的糖部分与所述两个核巧酸或核巧中另一者的磯部分之间形成 的共价键来连接一组中的一个核巧酸与另一组或其它组中的一个核巧酸。优选地，所述至 少两组连续核巧酸不通过任何共价键连接。在另一个优选实施方案中，所述至少两个组是 通过不同于磯酸二醋键的共价键连接。
[0167] 术语核酸优选地还涵盖D-核酸或k核酸。优选地，核酸是心核酸1。另外，可能 的是核酸的一部分或若干部分作为D-核酸存在，且核酸的至少一部分或若干部分是k核 酸。术语核酸的"部分"应意指仅仅一个核巧酸。所述核酸在本文中一般对应地称为D-核 酸和k核酸。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的核酸由k核巧酸组成且包含 至少一个D-核巧酸。优选地，所述D-核巧酸连接在任何延伸段和任何核酸的末端。
[0168] 如本文中所使用的k核酸是由k核巧酸组成，优选完全由心核巧酸组成的核 酸。
[0169] 如本文中所使用的D-核酸是由D-核巧酸组成，优选完全由D-核巧酸组成的核 酸。
[0170] 此外，如果无相反指示，则本文中W5'一3'方向阐述任何核巧酸序列。
[0171] 不管核酸是由D-核巧酸a-核巧酸或是两者的组合组成，其中所述组合是例如随 机组合或限定顺序的由至少一个k核巧酸和至少一个D-核酸组成的延伸段，所述核酸分 子都可W由脱氧核糖核巧酸、核糖核巧酸或其组合组成。
[0172] 不考虑核酸是D-核酸、k核酸、其混合物、DNA或RNA或其中每一者和任何组合， 如本文中优选使用的术语核酸还将涵盖单链核酸和双链核酸，由此经历根据本发明的方法 的核酸分子优选为单链核酸。
[0173] 如本文中优选使用的术语核酸还将涵盖经修饰的核酸。经修饰的核酸可W是核巧 酸经修饰的RNA或核巧酸经修饰的DNA分子，由此所述RNA或DNA分子在个别核巧酸上经广 泛修饰W便通过具有抗核酸酶基团的修饰增强稳定性，例如2' -氨基、2' -C-帰丙基、2' -氣 基、2'-〇-甲基、2'-H(关于综述，参见Usman&Cedergren, 1992)。
[0174] 如本文中优选使用的术语核酸还将涵盖完全闭合的核酸。如果核巧酸序列根据本 发明加W确定的核酸优选通过共价键闭合，则实现了核酸的完全闭合，即环形结构，由此更 优选所述共价键在如本文中所公开的核酸分子序列的5'端与3'端之间制得。
[0175] 如优选使用的术语核酸还将涵盖包含非核酸分子部分的任何核酸分子。所述非核 酸分子部分可W选自如下文将更详细概述的包括肤、寡肤、多肤、蛋白质、碳水化合物、各种 基团的基团。术语核酸因而还将涵盖包含至少一个核酸部分和至少一个可用于促进核酸分 子递送到生物系统（诸如细胞）中的其它部分的缀合物和/或复合物。所提供的缀合物和 复合物可W通过越过细胞膜转移治疗性化合物、改变药物动力学和/或调节本发明的核酸 的定位来赋予治疗活性。该些种类的缀合物和复合物优选地适合于越过细胞膜递送的分 子，包括但不限于小分子、脂质、磯脂、核巧、核巧酸、核酸、抗体、毒素、带负电的聚合物及其 它聚合物，例如蛋白质、肤、激素、碳水化合物、聚己二醇或聚胺。一般来说，所描述的转运蛋 白被设计成能在存在或不存在可降解的连接子的情况下单独地或作为多组分系统的一部 分加W使用。期望该些化合物能改善核酸分子在存在或不存在血清的情况下在来源于不同 组织的许多细胞类型中的递送和/或定位（参见美国专利US5, 854, 038)。本文中所描述 的分子的缀合物可W经由可生物降解的连接子，诸如可生物降解的核酸连接子分子而连接 到生物活性分子。
[0176] 如下文结合将测定序列的核酸所详述，非核酸部分可W是PEG部分，即聚（己二 醇）部分，或肥S部分，即轻己基淀粉部分。
[0177] 非核酸部分和优选地PEG和/或肥S部分可W直接或通过连接子连接到核酸分 子。核酸分子包含一个或多个修饰，优选地包含一个或多个PEG和/或肥S部分也在本发 明内。在一个实施方案中，个别连接子分子将多于一个PEG部分或肥S部分连接到核酸分 子。结合本发明使用的连接子本身可W是线性的或分支的。该些种类的连接子对于本领域 技术人员是已知的且进一步描述于专利申请WO2005/074993和WO2003/035665中。
[0178] 在一个优选的实施方案中，所述连接子是可生物降解的连接子。由于修饰从核酸 分子中释放，故可生物降解的连接子允许尤其在动物体（优选为人体）内停留时间方面 对核酸分子的特征进行修饰。可生物降解的连接子的使用可W允许更好地控制核酸分子 的停留时间。所述可生物降解的连接子的一个优选实施方案是可生物降解的连接子，诸 如在但不局限于国际专利申请WO2006/052790、WO2008/034122、WO2004/092191 和WO 2005/099768中所描述的可生物降解的连接子，由此在国际专利申请WO2004/092191和WO 2005/099768中，所述连接子是由一个或两个如本文中所描述的修饰、核酸分子和介于其之 间的可生物降解的连接子组成的聚合寡核巧酸前药的一部分。
[0179] 如本文中优选使用，"核巧酸"包括但不限于天然存在的DNA核巧单磯酸盐、二磯酸 盐和H磯酸盐：脱氧腺巧单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；脱氧鸟巧单磯酸盐、二磯酸盐和 H磯酸盐；脱氧胸巧单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；和脱氧胞巧单磯酸盐、二磯酸盐和H 磯酸盐。（在本文中对应地称为dA、dG、dT和dC或A、G、T和C)。术语核巧酸还包括天然 存在的RNA核巧单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；腺巧单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；鸟 嘿岭单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；尿巧单磯酸盐、二磯酸盐和H磯酸盐；和胞巧单磯酸 盐、二磯酸盐和H磯酸盐（在本文中对应地称为A、G、U和C)是指碱基-糖-磯酸盐组合， 目P，核酸分子（即，DNA分子和RNA分子）的单体单元。然而，换言之，术语"核巧酸"是指含 有环状巧喃糖巧型糖（RNA中的P-D/1-核糖和DNA中的P-D/1-2' -脱氧核糖）的任何化合 物，其在5'位置经磯酸化且具有经由-葡糖基Cr-N键连接在C-1'糖位置的嘿岭或嚼巧 型碱基。核巧酸可W是天然的或合成的，包括经过块修饰的核巧酸，尤其包括具有含经修饰 碱基（例如5-甲基胞嚼巧）和经修饰糖基（例如2' -O-甲基核糖基、2' -O-甲氧基己基核 糖基、2' -氣基核糖基、2' -氨基核糖基等等）的经修饰核巧的核巧酸。
[0180]术语"核碱基"覆盖天然存在的核碱基腺嘿岭（A)、鸟嘿岭（G)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼 巧（T)和尿嚼巧做W及非天然存在的核碱基，诸如黄嘿岭、二氨基嘿岭、8-氧代-N6-甲基 腺嘿岭、7-脱氮黄嘿岭、7-脱氮鸟嘿岭、M，M-桥亚己基胞嚼巧、N6,N6-桥亚己基-2, 6-二 氨基嘿岭、5-甲基胞嚼巧、5?（C3-C6)-快基-胞嚼巧、5-氣尿嚼巧、5-漠尿嚼巧、假异胞嚼 巧、2-轻基-5-甲基-4-H哇并化巧、异胞嚼巧、异鸟嘿岭、肌巧和美国专利US5, 432, 272 中、Rreier和Altmann的出版物（Rreier&Altmann, 1997)中所描述的"非天然存在的"核 碱基。术语"核碱基"因而不仅包括已知的嘿岭和嚼巧杂环，而且包括其杂环类似物和互变 异构体。
[0181]单链核酸可W形成独特而又稳定的H维结构且特异性地结合祀分子（如抗体） 在本发明范围内。由D-核巧酸构成的所述核酸分子称为适体。可W针对若干个例如小分 子、蛋白质、核酸的祀分子和甚至细胞、组织、和生物体鉴别适体，并且适体可W抑制特定祀 分子的体外和/或体内功能。通常由称为体外选择的祀定向选择方法或指数富集的配体 系统进化（缩写SELE)〇 来鉴别适体（Bock等，1992;Ellington&Szostak, 1990;Tuerk& Gold, 1990)。未经修饰的适体主要由于核酸酶降解而快速从血流中清除，半衰期为数分钟 到数小时，且通过肾从体内清除，因为适体的分子量固有地较低。因此，为了在治疗上使用 适体，它们必须在糖（例如核糖）骨架的2'位置上经修饰炬urmester等，2006)。
[0182] 无所不在的核酸酶说明了适体的不稳定性，其由手性构筑块，即k氨基酸组成。 因此，核酸酶的结构也固有地是手性的，从而引起立体特异性底物识别。因此，该些酶仅接 受呈胜任的手性构型的底物分子。因为适体和天然存在的核酸分子由D-核巧酸构成，故 心寡核巧酸将逃脱酶识别和随后的降解。不幸的是，由于相同的原理，在该种情况下，自然 界未产生能扩增所述镜像核酸的酶活性。因此核酸适体不能采用SELEX方法直接获得。 但是，立体化学原理掲示了最终产生所要的功能k核酸适体的迂回途径。
[0183] 如果体外选择的值-)适体结合其天然祀，则该个适体的结构镜像W相同特征结 合所述天然祀的镜像。该里，两种相互作用配偶体具有相同的（非天然的）手性。由于生 命化学物和大部分生物化学化合物的同手性，所述对映RNA配体当然将具有受限制的实际 用途。另一方面，如果针对（非天然的）镜像祀进行SELEX方法，则将获得识别该个（非 天然的）祀的适体。所述适体，即所要的k适体的相应镜像构型又识别天然祀。该种用 于产生生物稳定的核酸分子的镜像选择方法在1996年首先公开化Iussmann等，1996 ; Nolte等，1996)，且产生了不仅对给定的祀分子呈现出高亲和力和特异性，而且同时还呈 现出生物学稳定性的功能镜像核酸分子配体。在本发明内，单链核酸分子是该样的配体结 合心核酸，其称为'镜像异构体'（来自于德语词语'Spiegel'，镜像）（参见'The Aptamer Hanclbook' ;Klussmann编，2006)
[0184] 其中，根据本发明的核酸可W包含修饰，所述修饰优选地允许检测根据本发明的 核酸。所述修饰优选地选自放射性标记、酶标记和英光标记。所述修饰还选自本身可能被 选自放射性标记、酶标记和英光标记的修饰修饰过的D-核巧酸。
[0185] 各种SEQ. ID. No.、本文中所使用的核酸、肤、寡肤和蛋白质的化学性质、其实际序 列和内部参考物编号汇总于下表中。
[0186]
【权利要求】
1. 一种用于添加一个或多个L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法，其中所述方法包 括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L-核苷酸与所述第一L-核酸 反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中所 述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
3. 根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述酶活性展现部分是聚合酶活性 展现部分。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶活性是聚合酶活性。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
6. 根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分的氨基酸 序列包含至少300个氨基酸。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于 300和900个之间的个氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360 个之间的氨基酸，最优选340至360个氨基酸。
8. 根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶活 性。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述酶活性展现部分是酶。
11. 根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分是聚合 酶。
12. 根据权利要求1至4和8至11中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部 分选自非洲猪瘟病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚合酶 3、克列诺片段、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA聚合 酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一个和任一个的变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪瘟病毒聚合酶X或其变体，其由选自以下 的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根据SEQIDN0:3的氨基酸序列和根据SEQIDN0:4的氨基酸序列。
13. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分选自聚 合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合酶、 Pfuturbo聚合酶、硫磺矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq聚 合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、Pab 聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合 酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、 Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA聚 合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5000、Pfx-50、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为Dp〇4聚合酶或其变体，其由选自以下的氨基酸 序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQID NO: 19的氨基酸序列、根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列、根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列 和根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述反应步骤是在允许进行所 述添加所述至少一个或多个L-核苷酸到所述第一 L-核酸，优选允许进行所述添加5至 20, 000个L-核苷酸、优选10至2, 000个L-核苷酸、更优选50至500个L-核苷酸、最优选 50至100个L-核苷酸的条件下进行。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述添加所述至少一个或多个 L-核苷酸到所述第一 L-核酸是所述至少一个或多个L-核苷酸共价结合到所述第一 L-核 酸，优选通过在所述第一 L-核酸的3' 0H与所述至少一个或多个L-核苷酸之一的5'磷酸 之间形成3'-5'磷酸二酯键。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述第一 L-核酸是由DNA、RNA、 经修饰的DNA、经修饰的RNA或其组合组成的引物。
17. 根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一 L-核酸由L-核苷酸和 任选的修饰组成。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第一 L-核酸由L-核苷酸组 成。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述反应还包含第二L-核酸，其 中优选通过沃森-克里克碱基配对使一分子的所述第一 L-核酸与一分子的所述第二L-核 酸杂交。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分合成与所述第二L-核 酸互补的第三L-核酸，其中所述第三L-核酸包含所述第一 L-核酸和添加到所述第一 L-核 酸的3'端的L-核苷酸。
21. -种用于在L-核苷酸和包含酶活性展现部分的蛋白质存在下扩增靶L-核酸的方 法，其中所述酶活性能够扩增所述靶L-核酸。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中 所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
23. 根据权利要求21和22中任一项所述的方法，其中所述酶活性展现部分是聚合酶活 性展现部分。
24. 根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述酶活性是聚合酶活性。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
26. 根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分的氨基 酸序列包含至少300个氨基酸。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介 于300和900个之间的氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和 360个之间的氨基酸，最优选介于340和360个之间的氨基酸。
28. 根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶活 性。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶 活性。
30. 根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述酶活性展现部分是酶。
31. 根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分是聚合 酶。
32. 根据权利要求21至24和28至31中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展 现部分选自非洲猪瘟病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚 合酶0、克列诺片段、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一个和任一个的变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪瘟病毒聚合酶X或其变体，其由选自以下 的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根据SEQIDNO:3的氨基酸序列和根据SEQIDNO:4的氨基酸序列。
33. 根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述聚合酶活性展现部分选自 聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合酶、 Pfuturbo聚合酶、硫磺矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq聚 合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、Pab 聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合 酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、 Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA聚 合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5000、Pfx_50、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为Dp〇4聚合酶或其变体，其由选自以下的氨基酸 序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQID NO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO:20的氨基酸序列、根据SEQIDNO:21的氨基酸序列 和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
34. 根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中所述反应步骤是在允许扩增所述 靶L-核酸的条件下进行。
35. 根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述方法使用至少一种引物，优 选使用两种引物，其中所述至少一种引物由L-核苷酸和任选的修饰组成。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述引物由L-核苷酸组成。
37. 根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中所述靶L-核酸由L-核苷酸组 成。
38. 根据权利要求21至37中任一项所述的方法，其中所述方法是聚合酶链式反应。
39. 根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中所述靶L-核酸由L-DNA组成。
40. 根据权利要求21至39中任一项所述的方法，其中所述靶L-核酸由20至20, 000 个L-核苷酸，优选30至2, 000个L-核苷酸，更优选40至500个L-核苷酸，最优选50至 100个L-核苷酸组成。
41. 一种包含酶活性展现部分的蛋白质，其中所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成， 其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸，其中所述酶活性能够添加一个或多个L-核苷 酸到所述第一L-核酸的3'端。
42. 根据权利要求41所述的蛋白质，其中所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部 分。
43. 根据权利要求41所述的蛋白质，其中所述酶活性是聚合酶活性。
44. 根据权利要求43所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。
45. 根据权利要求42至44中任一项所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性展现部分的氨 基酸序列包含至少300个氨基酸。
46. 根据权利要求45所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含 介于300和900个之间的氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和 360个之间的氨基酸，最优选介于340和360个之间的氨基酸。
47. 根据权利要求43至46中任一项所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶 活性。
48. 根据权利要求47所述的蛋白质，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合 酶活性。
49. 根据权利要求41至48中任一项所述的蛋白质，其中所述酶活性展现部分是酶。
50. 根据权利要求42至48中任一项所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性展现部分是聚 合酶。
51. 根据权利要求41至43和47至50中任一项所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性展 现部分选自非洲猪瘟病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚 合酶0、克列诺片段、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一个和任一个的变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪瘟病毒聚合酶X或其变体，其由选自以下 的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根据SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根据SEQIDN0:3的氨基酸序列和根据SEQIDN0:4的氨基酸序列。
52. 根据权利要求41至50中任一项所述的蛋白质，其中所述聚合酶活性展现部分选 自聚合酶DP04、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合 酶、Pfuturbo聚合酶、硫磺矿硫化叶菌DNA聚合酶、嗜热古细菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq 聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、 Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand 聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚 合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA 聚合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5〇00、Pfx_5〇、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其变体， 其中所述聚合酶活性展现部分优选为Dp〇4聚合酶或其变体，其由选自以下的氨基酸 序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根据SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根据SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根据SEQID NO: 19的氨基酸序列、根据SEQIDNO:20的氨基酸序列、根据SEQIDNO:21的氨基酸序列 和根据SEQIDNO:22的氨基酸序列。
53. -种包含根据SEQIDNO: 15的氨基酸序列的聚合酶，其中所述氨基酸序列的氨基 酸是D-氨基酸。
54. -种包含根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的聚合酶，其中所述氨基酸序列的氨基酸 是D-氨基酸。
55. -种野生型聚合酶的聚合酶变体，其中所述野生型聚合酶由根据SEQ ID NO: 15的 氨基酸序列组成，且其中所述聚合酶变体具有聚合酶活性，优选具有热稳定的聚合酶活性。
56. 根据权利要求55所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体包含氨基酸序列，其中 所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸位置 上不同。
57. 根据权利要求55至56中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一个或两个氨基酸位置上不同。
58. 根据权利要求55至57中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在根据SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的氨基酸位置 155和/或203上或在与其对应的氨基酸位置上不同，其中优选以半胱氨酸取代位置155和 /或203上的氨基酸。
59. 根据权利要求55至58中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体由选自以 下的氨基酸序列组成：根据SEQ ID NO: 16的氨基酸序列、根据SEQ ID NO: 17的氨基酸序列 和根据SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
60. 根据权利要求55至57中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体由选自 以下的氨基酸序列组成：根据SEQ ID NO: 19的氨基酸序列、根据SEQ ID N0:20的氨基酸序 列、根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列和根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
61. 根据权利要求55至60中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列的氨基酸是D-氨基酸。
62. 根据权利要求55至60中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列的氨基酸是L-氨基酸。
63. -种野生型聚合酶的聚合酶变体，其中所述野生型聚合酶由根据SEQ ID NO: 1的氨 基酸序列组成，并且其中所述聚合酶变体具有聚合酶活性。
64. 根据权利要求63所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体包含氨基酸序列，其中 所述聚合酶变体的氨基酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸位置 上不同。
65. 根据权利要求63至64中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一个氨基酸位置上不同。
66. 根据权利要求63至65中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基 酸序列与所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸位置上不同，其中所述至少一 个氨基酸位置选自氨基酸位置80、氨基酸位置86和氨基酸位置124,各氨基酸序列根据SEQ ID NO: 1或在与其对应的氨基酸位置上。
67. 根据权利要求63至66中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体由选自以 下的氨基酸序列组成：根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、根据SEQ ID NO: 3的氨基酸序列和 根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
68. 根据权利要求63至67中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列的氨基酸是D-氨基酸。
69. 根据权利要求63至67中任一项所述的聚合酶变体，其中所述聚合酶变体的氨基酸 序列的氨基酸是L-氨基酸。
70. -种包含酶活性展现部分的蛋白质的用途，其用于添加一个或多个L-核苷酸到 L-核酸的3'端的方法。
71. -种包含酶活性展现部分的蛋白质的用途，其用于在L-核苷酸存在下扩增靶L-核 酸的方法。
72. 根据权利要求71所述的用途，其中所述用于扩增靶L-核酸的方法是聚合酶链式反 应。
73. 根据权利要求70至72中任一项所述的用途，其中所述蛋白质是根据权利要求41 至69中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的 氨基酸是D-氨基酸。
74. -种用于鉴别结合靶分子的L-核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 产生L-核酸分子的异源群体； (b) 使步骤（a)的L-核酸分子的异源群体与所述靶分子接触； (c) 分离未被所述靶分子结合的所述L-核酸分子；和 (d) 扩增被所述靶分子结合的所述L-核酸分子，其中所述扩增步骤使用根据权利要求 41至69中任一项所述的蛋白质， 其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
75. 根据权利要求74所述的方法，还包括以下步骤： (e) 对被所述靶分子结合的L-核酸分子进行测序；和 (f) 合成核苷酸序列与步骤（e)中所测序的所述L-核酸分子的核苷酸序列一致的核酸 分子。
76. 根据权利要求74至75中任一项所述的方法，其中步骤（a)的L-核酸分子的异源 群体的核酸分子在其5'端及其3'端上包含引物结合位点和分别与引物结合位点互补的序 列，这允许通过聚合酶链式反应来扩增步骤（d)中所获得的所述L-核酸分子，其中所述聚 合酶链式反应中所使用的所述聚合酶是根据权利要求40至69中任一项所述的蛋白质，所 述聚合酶链式反应中所使用的所述引物由L-核苷酸组成，且所述聚合酶链式反应中所使 用的所述核苷酸是L-核苷酸。
77. 根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中在步骤（d)之后引入以下步骤： (da)使所述扩增的核酸分子与所述靶分子接触，其中 步骤（b)和任选的步骤（c)和/或⑷是在步骤（e)之前进行，其中步骤（da)、（b)、 (c)和任选的（d)是按照这个顺序进行一次或若干次。
78. 根据权利要求74至77中任一项所述的方法，其中结合所述靶分子的L-核酸是 DNA。
79. 根据权利要求74至78中任一项所述的方法，其中结合所述靶分子的L-核酸分子 由L-核苷酸组成。
80. -种用于产生根据权利要求41至69中任一项所述的蛋白质的方法，其中 a)化学合成根据权利要求41至69中任一项所述的蛋白质的两个或更多个片段，其中 所述片段以其整体形式形成所述蛋白质的氨基酸序列，优选通过固相肽合成来合成所述片 段，且 b)通过链段缩合、天然化学连接、酶连接或其组合将步骤a)的所述片段彼此连接， 其中所述蛋白质由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
81. 根据权利要求80所述的用于产生蛋白质的方法，其中用于酶连接的所述酶是梭菌 蛋白酶。
82. -种用于通过酶连接将第一D-肽或第一D-蛋白质与第二D-肽或第二D-蛋白质 彼此连接的方法，其中 所述第一D-肽或所述第一D-蛋白质在其N末端由保护基保护，且在其C末端由4-胍 基苯基酯基团保护，且 所述第二D-肽或所述第二D-蛋白质包含游离N末端和处于其C末端的硫代烷基酯基 团或硫代芳基酯基团。
83. 根据权利要求82所述的方法，其中用于所述酶连接的酶是梭菌蛋白酶。
【文档编号】C12P21/00GK104379748SQ201380024198
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】A·佩什, R·大卫, F·雅罗什, M·雅恩兹, S·克鲁斯曼 申请人:诺松制药股份公司