离子激流基因组测序的制作方法

离子激流基因组测序的制作方法
【专利摘要】公开了用于通过半导体测序，优选离子激流测序快速且成本节约地分析微生物序列的增强方法。这种方法提供了多个基因组的全长分析和多个区域(例如基因)分析。这些方法鉴定负责对抗生素或其它化学化合物赋予抗性或敏感性的特定基因的遗传突变。将特定生物体的多种不同种、株系和/或血清型连同生物体的完整基因组快速且有效筛选并鉴定突变。通过选择产生具有跨越整个基因组的序列的扩增子的相似大小和GC含量的引物对，通过离子激流方法分析的单一PCR反应可以测定完整基因组的序列。方法可用于测序病毒因子(诸如流感病毒)和细菌因子(诸如结核病细菌)的基因组。
【专利说明】离子激流基因组测序
[0001] 相关申请的引用 本申请要求2012年12月14日提交的题为"Jo/?Thrre/^ 分职卻以取'"的美国 临时申请号61/737,250、2012年8月31日提交的题为"/〇/?71〇打6>/^&?〇?化5^此/?以/^' 的美国临时申请号61/695,960、2012年5月11日提交的题为"价叹5^^印^^7/汴 你(6?/1//7<3以〇/7 47 7〇/7 71〇/7-61/^5'61(7"<^<^取'"的美国临时申请号 61/646,060 和2012年5 於9 U提交饱"Drug Susceptibility Determination by Ion Torrent Sequencing^饱美 国临时申请号61/644, 876的优先权，并且其中每个申请的完整内容通过引用具体并入。
[0002] 序列表 本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交且在此以其整体通过引用并入的序列 表。所述ASCII拷贝，在2013年5月7日生成，名为3022.018.PCT_SL.txt，大小为37,927 字节。
[0003] 背景 1.发明领域 本发明涉及用于通过半导体测序鉴定遗传突变和数兆碱基的核酸信息的工具、组合物 和方法，特别是涉及通过离子激流（iontorrent)测序分析基因和完整基因组。
[0004] 背景描述 结核分枝杆菌为结核病的致病因子，是（特别是 在HIV感染患者中）具有显著发病率和死亡率的高度传染性细菌病原体。从1997年以来， 结核病仍然是南非的首要死亡原因，这是与该国日益严重的HIV流行关联的统计信息。此 夕卜，越来越多例的多药抗性（MDR)和广泛抗药（XDR)的临床分离株已经加重了具有活跃MTB 的患者的有效治疗措施。
[0005]MDR结核病菌株对一线抗生素利福平（RIF)和异烟肼（INH)是耐受的，而XDRMTB 菌株对于是RIF和INH两者以及任何氟喹诺酮和二线可注射抗生素药物（例如，阿米卡星、 卡那霉素或卷曲霉素）是耐受的。约6%的所有TB病例是MDR菌株，且南非持续每年报道 更高百分比的XDR病例。尽管7%感染标准MTB菌株的患者屈服于感染，但MDR结核病的死 亡率上升至几乎50%。抗生素耐受的MTB菌株的出现强调迫切需要快速和高度精确的诊 断，特别是在非洲的发展中国家中。此外，迁移群体使得抗药性菌株的地理监测和追踪更加 迫切。
[0006]MDR菌株的基于培养的药物敏感性试验（DST)被认为是金标准，但费时（数周至 数个月），技术上有挑战性且成本过高，特别是在资源有限的国家中。例如，BACTECMGIT 960(BectonDickinsonMicrobiologySystem,SilverSparksNV,USA)，是一种基于自 动化连续培养的监控系统，其测量细菌的氧消耗，并且可以使用可获得的制备的试剂盒进 行DST，用于分析菌株对多种抗生素的敏感性。用BACTECMGIT960获得的DST结果得到可 靠且可重复的结果，但需要操作活且有潜在感染性的培养物数天至数周或推迟直到获得结 果，专业的实验室设施，和与仪器和耗材相关的高成本。
[0007] 近年中，已经开发了几种用于测定MTB抗药性的基于核酸的测定法。最流行的商 购诊断测定法之一是HainLifeScience的GenoTypeMTBDRp/^s线性探针测定法（LPA)。 该试验采用核酸提取、PCR扩增、杂交探针和侧面条上经由碱性磷酸酶反应的色度可视化。 已经显示LPA是敏感且特异的，但存在几个缺点。LPA对于所有抗性相关突变的灵敏度将 最有可能从未达到100%，因为许多赋予抗性的突变尚待发现。LPA的另一个固有限制是无 法检测含有抗性和敏感菌株的混合物的样品群体。没有检测到具有将氨基酸变为LPA上没 有呈现的以前未表征或未知突变的取代突变的菌株。此外，LPA只允许检测引起抗性的最 频繁的突变。如果菌株含有靶向突变以外的突变，则野生型带型出现将看起来导致假阴性 (易感）结果。
[0008] 因此，存在对于用于关键基因（诸如，例如，与一线和二线抗药性相关的基因）的 全长基因分析的快速、标准化、成本节约的方案的需求。
[0009] 概述 本发明克服了与目前策略和设计相关的缺点，并且在此提供了用于分析包括全长基因 和完整基因组的核酸的序列信息的工具、组合物和方法。
[0010] 本发明的一个实施方案涉及通过半导体测序和，优选地，离子激流测序分析抗药 性突变。含有感兴趣的基因的核酸区段通过PCR扩增，并且将扩增产物处理，并随后通过 测序进行分析。测序优选通过离子激流，或下一代测序仪，包括离子激流个人基因组机器 (PGM)。优选地，所述扩增产物代表许多生物体的种、株系和/或血清型的基因的共同全长 或多个重叠片段。将扩增产物测序，并鉴定和作图突变。作图鉴定已知和先前未知的突变 两者，并且可用于追踪群体间抗药性的进展和活动。优选地，本发明分析病原体的核酸，诸 如，例如，病毒、细菌或寄生物。优选地，病毒病原体是流感或HIV的致病因子，并且细菌病 原体是结核病的致病因子。核酸区段的离子激流测序为全长基因分析的快速、有效、成本节 约的方案提供了增强的测序。立即测定抗药性和其它突变。
[0011] 本发明的另一个实施方案涉及用于对完整基因组进行半导体测序，优选离子激流 测序的工具、组合物和方法。本发明包括获得感兴趣的生物体的DNA序列，并使用多对核酸 引物进行聚合酶链式反应分析。设计每对引物以便在类似PCR条件下同时扩增基因组的重 叠区段。优选的引物具有类似的GC含量和总体大小。基因组的单一PCR扩增产生数百个 扩增产物，其序列包括生物体的全长基因、大基因和非编码区段或整个基因组。分析这些产 品，优选通过离子激流测序，并匹配序列以生成整个基因组的序列图。
[0012] 本发明的另一个实施方案涉及鉴定微生物基因组中赋予针对抗微生物化合物的 抗性的序列基序的方法，其包括：提供从微生物的多种不同菌株或血清型获得的多种核酸 样品；通过聚合酶链式反应扩增多种核酸样品的序列；通过离子激流测序获得扩增序列的 序列彳目息；从获得的序列彳目息鉴定至少一种微生物菌株或血清型的基因组中的多态性；和 将鉴定的多态性与至少一种微生物菌株或血清型的表型或基因组位置关联，以鉴定赋予针 对抗微生物化合物的抗性的序列基序。优选地，微生物是病毒、细菌、真菌或寄生物，并且病 毒是流感病毒且细菌是结核分枝杆菌。优选地，核酸样品在含水分子转运介质中提供，所 述含水分子转运介质含有离液剂、去污剂、还原剂、螯合剂、缓冲剂和醇，它们以足以裂解细 胞、变性蛋白、失活核酸酶、杀灭病原体且不会降解核酸的量一起存在。优选地，扩增在利用 扩增与针对抗微生物化合物的抗性相关的基因或核酸区段的引物对一步聚合酶链式反应 中进行，并且聚合酶链式反应在含水混合物中进行，所述含水混合物包含：热稳定聚合酶； 包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物，螯合剂，摩尔渗透压 浓度试剂，白蛋白，镁盐；和缓冲剂。优选地，抗微生物化合物是抗生素。
[0013] 本发明的另一个实施方案涉及用通过本发明的方法鉴定的抗微生物化合物治疗 由至少一种微生物菌株或血清型引起的疾病或病症的方法。
[0014] 本发明的另一个实施方案涉及用于测定微生物基因组的完整序列的方法，其包 括：通过在含水混合物中进行基因组的单一聚合酶链式反应（PCR)而产生一系列的扩增 子，所述含水混合物含有热稳定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核 苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；盐；缓冲剂；稳定剂；和多个引物对，其中多个引物对中的各 引物具有类似的退火温度；通过半导体测序来测序产生的扩增子系列中的每一个，并且关 联扩增子的序列，并且构建基因组的完整序列。优选地，多个引物对中的各引物包含长度为 15至25个核酸的引物，且各具有约25-50%的GC含量。优选地，设计各引物对以PCR扩增 扩增子，并且PCR扩增的扩增子的集合涵盖完整基因组序列的重叠区段。优选地，多个引物 与基因组杂交，并且以约每500到2, 000个核苷酸沿基因组隔开。优选地，微生物是病毒、 细菌、真菌、寄生物或细胞，并且病毒是流感病毒且细菌是结核分枝杆菌。
[0015] 本发明的另一个实施方案涉及在一个步骤中测定核酸区段的序列的方法，其包 括：对核酸区段进行聚合酶链式反应，以产生一系列扩增子，其中所述PCR包括：热稳定聚 合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；盐； 缓冲剂；稳定剂；和多个引物对，其中多个引物对中的各引物具有5°C内的退火温度；通过 半导体测序来测序产生的扩增子系列中的每个，并且关联扩增子的序列，并且构建核酸区 段的序列。优选地，核酸区段长度为1Mb或更长，更优选长度大于2或更多Mb，更优选长度 为5或更多Mb，且更优选长度为10或更多Mb。优选地，多个引物对中的各引物长度为16 至24个核苷酸，具有约28-35 %的GC含量，且具有其它各引物的3°C内的退火温度。优选 地，设计各引物对以PCR扩增代表核酸区段的序列的部分的扩增子，并且PCR扩增的扩增子 的集合代表区段的完整序列的重叠部分。优选地，多个引物对以长度为约800至1，200个 核苷酸的间隔与所述区段杂交。
[0016] 本发明的另一个实施方案涉及包含多对核酸引物的混合物，其中，在使该集合连 同核酸区段进行聚合酶链式反应之后，引物对的集合生成扩增子的集合，其中各扩增子长 度为约500至2, 000个核苷酸，从而使得区段的整个序列被代表在所得的扩增子集合中。 优选地，引物对集合中的各引物长度为约15至25个核苷酸，具有约25-45%的GC含量，和 其它各引物的3°C内的退火温度，并且引物对集合中的各引物含有与相同微生物的基因组 杂交的序列。优选地，微生物是病毒、细菌、寄生物或真菌。优选地，混合物含有热稳定聚合 酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；盐；缓 冲剂；稳定剂和无核酸酶的水。
[0017] 本发明的其它实施方案和优点部分地在其后的说明书中描述，并且部分地，可以 从该说明书中是显而易见的，或者可以从本发明的实践中知道。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 图1 说明pncA基因序列加上100个侧接碱基对以及反向互补序列、蛋白序列 和引物序列。
[0019] 图2 说明H37RV基因菌株的核苷酸序列以及TB16S核糖体RNA基因测序引物 的序列。
[0020] 图3 说明赋予对利福平的敏感性/抗性的rpoB基因以及rpoB的正向和反向 引物序列。
[0021] 图4 说明结核分枝杆菌H37Ra，完整基因组（GenBank:CP000611. 1)GyrA基因 和三组正向和反向引物。
[0022] 图5 结核分枝杆菌H37Ra，完整基因组（GenBank:CP000611. 1)过氧化氢 酶-过氧化物酶-过氧亚硝酸酶（peroxynitritase)TkatG和三组正向和反向引物。
[0023] 图6 说明旋转酶A和IS6110测定法的循环阈值。
[0024] 图7 说明通过循环数相比于Ct值使用序列分离株的旋转酶A测定法和IS 6110测定法。
[0025] 图8 说明相比于循环阈值（ct)使用序列分离株的旋转酶A测定法和IS6110 测定法。
[0026] 图9 使用各种引物对集合与离子激流测序方法在测序甲型流感基因组中获得 结果的总结。
[0027] 图10 用于甲型流感（H3N2)的全基因组离子激流测序的引物对的表征。
[0028] 图11 (A)将编码区显示为阴影的pncA基因序列，和⑶PCR平铺（PCR tiling)中利用的pncA正向和反向引物和pncA区域P1-P4。
[0029] 发明描述 与抗药菌株相关的基因的快速分析对于许多疾病和病症的成功治疗是一个主要挑战。 新出现的MTB抗药性的实时地理监测将有利于更适当的治疗策略（例如，药物、抗生素、化 学品）。目前，可用的分子方法，诸如GenoType?MTBDR/7A?LPA提供有限的检测能力，特别 是当新型/不常见氨基酸取代是在已知抗药性区域内时，或当未发现的氨基酸突变影响抗 药性时。此外，包括离子激流方案的目前方法需要多步骤、辅助设备和增加的费用，并且是 劳动密集型的。
[0030] 已经令人惊讶地发现了用于全长基因和基因组的快速表征的简化的半导体测序 方案。本发明包括利用全长基因的半导体测序和优选离子激流测序的标准化方案。该方案 使得能够测序实施的整个编码区，允许表征已知突变和发现新型多态性。该方案还使得能 够测序核苷酸信息的数兆碱基，从而使得可以测定细胞和生物体的完整基因组并容易作图 和鉴定遗传多态性。优选地，细胞或生物体是引起疾病的原核或真核细胞，或酵母或真菌细 胞。优选的引起疾病的生物体包括细菌、病毒、真菌和寄生物的株系。示例性生物体包括， 但不限于，分枝杆菌（例如，结核分枝杆菌），流感病毒（例如H5N1、H1N1、H7N9)，呼吸道合 胞病毒，HIV和痕原虫（例如，恶性痕原虫/a/cipa/--))。
[0031] 这种相对快速（例如，1、2或3天或更短）、标准化、成本节约的方案允许基因的全 长分析，所述基因诸如，例如，与一线和二线MTB抗药性相关的rpoB、katG、gyrA、pncA和 rrsMTB基因（参见图1-5)。用下一代离子激流个人基因组机器（PGM)使用在南非收集的 26种地理上不同的临床分离株（包括MDR和XDR菌株）评价该方案。将从这种开发的方 法获得的测序数据与来自培养物的HAINLPA和基因分型DST数据进行比较。这种方法首 次使得能够测序实现抗性的基因的整个编码区，允许表征已知突变和发现新型多态性。在 rrs、r/7〇从ia沉、和gjrJ基因上鉴定了先前未表征的取代突变。
[0032] 本发明提供了在资源贫乏的环境诸如非洲、亚洲和印度更好利用下一代仪器的显 著潜力。具体地，本发明改进了预先文库制备方法并使其简化。本发明的方法不需要使用 制造者通常利用或需要的昂贵辅助设备件。具体地，本发明的标准化程序不需要用于DNA 定量的Agilient生物分析仪；用于乳化PCR步骤的OneTouchePCR系统，或用于凝胶切割 的PipinPr印。此外，由于本发明的方案涉及重新测序全编码基因（不必全基因组），所以 不需要Bioruptor用于将DNA剪切为小块。此外，不必测序整个基因组，然后鉴定基因。本 发明的方法和工具允许预先选择待测序的感兴趣的基因和/或区域。由于Agilent2100 生物分析仪、OneTouch、PipinPrep和Bioruptor都需要额外训练来使用，消耗宝贵的实验 台空间，并且是非常昂贵的，所以本发明代表了相比于常规方法的显著进步和改进。
[0033] 本发明的测序方法在本文中可以使用离子激流测序来例举，因为该测序方法已被 应用于结核分枝杆菌。如相信对于本领域技术人员清楚的是，该方案涉及半导体测序，其通 过离子激流测序来例举，并且因此，涉及大量不同区域的同时测序。测序和核酸方法可应用 于基因、基因组或核酸序列的任何系列。
[0034] 本发明还包括用于选择用于测序感兴趣的目标的引物对的方法。优选选择关于目 标具有匹配的退火和解链温度的引物对。优选地，解链和退火温度基于序列特征，诸如序列 的GC含量、引物自杂交的可能性（例如，在引物内形成发夹环），和结合位点附近可能的结 构。优选地，引物在测序条件下不自杂交。优选地，引物的GC含量为约25%至50%，更优选 约30 %至40 %，更优选约25 %至35 %，并且还更优选约40 %至50 %。因此，基于序列特征 选择目标用于杂交的引物序列，从而使得用于该目标的所有引物对都将具有类似的对该目 标的解链和/或退火温度。优选地，引物序列不含引物序列的合理可能自杂交的区域。优选 地，针对退火和/或解离温度匹配引物对，所述退火和/或解离温度可在5°C内，4°C内，3°C 内，2°C内，1°C内，且更优选相同的退火温度，相同的解链温度，或两者。引物对优选生成代 表目标的重叠区段的长度为约500至约2, 000个核苷酸（NT)，更优选约600至1，500NT， 更优选约700至1，300NT，更优选约800至1，200NT，更优选约900至1，100NT，且更优选 约1，000NT的扩增子。引物长度通常为12NT至45NT，更优选15至35NT，且更优选约 18至25NT。尽管不是规则，但通常较长引物具有较低GC含量。针对pncA基因（参见图 1)、H37RV基因菌株（参见图2)、rpoB基因（参见图3)、GyrA基因（参见图4)和katG基 因（参见图5)鉴定示例性引物对。
[0035] 在本发明的一个实施方案，针对结核分枝杆菌的五个基因确定半导体测序方案， 用于确定MDR和XDR菌株中的抗药性（例如，累积测序11. 4kb/分离株）。结核分枝杆菌 感因编码RNA依赖的DNA聚合酶的1，178个氨基酸的3亚基。感因的81-bp"核 心区域"内的突变负责结核分枝杆菌菌株中近似95 %的利福平抗性。这些突变中在位置 516(D-V)、526(H-Y/D)和531(S-L)处的三个构成该区域内的大多数突变。在该 研究中表征的21种利福平抗性菌株中，11种（52. 4% )携带因的S531L突变，7种 (33. 3% )含有感因的位置516处的氨基酸取代，且3种（14. 3% )含有感因的 位置526处的突变（表1)。在位置516处观察到的最流行的rpoB取代为缬氨酸（D516V)。 根据本发明的离子激流测序揭示7种菌株中的6种在该位置处含有较罕见的甘氨酸残基 (D516G)(表1)。这6种菌株通过LPA对突变体和野生型条带两者均显示为不存在（表1)。 类似地，在r/7〇iS因的位置526处鉴定了不常见的氨基酸取代。在r/7〇iS因的位置526 处报道的最流行的氨基酸取代是组氨酸至酪氨酸或天冬氨酸（H526Y/D)。离子激流测序揭 示3种分离株中的1种含有不常见的精氨酸（R)残基（H526R)，其通过HAINLPA对野生型 和突变体条带两者均显示为不存在（表1)。尽管样品中不存在野生型和突变体条带根据 LPA试验被解释为抗性的，但仍然存在不确定性，因为没有直接表征氨基酸改变的类型。这 强调了离子激流测序用于抗性监测的实用性和流行的MTB菌株中新型氨基酸的发现。
[0036]表1 通过离子激流测序、HainLPA基因分型和培养推导的来自南非的26种（14种MDR、7种XDR和5种完全易感的）结核分枝杆菌分离株的rpoB基因的前900个氨基酸残基*中10 个氨基酸突变的总结。

【权利要求】
1. 鉴定微生物中的核酸序列基序的方法，其包括： 提供多种核酸样品，每种样品获自所述微生物的不同菌株或血清型； 通过聚合酶链式反应扩增所述多种核酸样品的序列； 通过离子激流测序获得经扩增的序列的序列信息； 从获得的序列信息确定至少一种微生物菌株或血清型的基因组中的多态性；和 将鉴定的多态性与所述至少一种微生物菌株或血清型的表型或基因组位置关联，以鉴 定所述核酸序列基序。
2. 权利要求1的方法，其中所述微生物是病毒、细菌、真菌或寄生物。
3. 权利要求1的方法，其中所述病毒是流感病毒。
4. 权利要求1的方法，其中所述细菌是结核分枝杆菌（ tuberculosis')。
5. 权利要求1的方法，其中所述核酸样品在含水分子转运介质中提供。
6. 权利要求5的方法，其中所述含水分子转运介质含有离液剂、去污剂、还原剂、螯合 齐U、缓冲剂和醇，其以足以裂解细胞、变性蛋白、失活核酸酶、杀灭病原体且不会降解核酸的 量一起存在。
7. 权利要求1的方法，其中所述扩增在一步聚合酶链式反应中进行。
8. 权利要求1的方法，其中所述核酸基序与微生物对抗微生物化合物的抗性相关。
9. 权利要求8的方法，其中所述抗微生物化合物是抗生素。
10. 权利要求1的方法，其中所述聚合酶链式反应在含水混合物中进行，所述含水混合 物包含：热稳定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混 合物，螯合剂，摩尔渗透压浓度试剂，白蛋白，镁盐；和缓冲剂。
11. 用通过权利要求1的方法鉴定的抗微生物化合物治疗由至少一种微生物菌株或血 清型引起的疾病或病症的方法。
12. 用于测定微生物的目标基因或基因组的完整序列的方法，其包括： 通过在含水混合物中进行所述目标的单一聚合酶链式反应（PCR)而产生一系列扩增 子，所述含水混合物含有热稳定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核 苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；盐；缓冲剂；稳定剂；和多个引物对，其中所述多个引物对中 的各引物具有类似的退火温度； 通过半导体测序来测序产生的一系列扩增子中的每一个，和 关联扩增子的序列，并且构建所述目标的完整序列。
13. 权利要求12的方法，其中所述多个引物对中的各引物包含长度为15至25个核酸 的引物，且具有约25% -50%的GC含量。
14. 权利要求12的方法，其中设计各引物对以PCR扩增扩增子，并且PCR扩增的扩增子 的集合涵盖所述目标的完整序列的重叠区段。
15. 权利要求12的方法，其中所述多个引物对与所述目标杂交，并且以约每500到 2, 000个核苷酸沿所述目标间隔开。
16. 权利要求12的方法，其中所述微生物是病毒、细菌、真菌、寄生物或细胞。
17. 权利要求12的方法，其中所述病毒是流感病毒。
18. 权利要求12的方法，其中所述细菌是结核分枝杆菌。
19. 用于在一个步骤中测定核酸目标序列的方法，其包括： 对所述核酸目标进行聚合酶链式反应，以产生一系列扩增子，其中所述反应包含：热稳 定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；螯合剂； 盐；缓冲剂；稳定剂；和多个引物对，其中所述多个引物对中的各引物具有5°C内的退火温 度； 通过半导体测序来测序产生的一系列扩增子中的每一个，和 关联扩增子的序列，并且构建所述核酸目标的序列。
20. 权利要求19的方法，其中所述核酸目标长度大于1 Mb。
21. 权利要求19的方法，其中所述多个引物对中的各引物长度为16至24个核苷酸，具 有约28-35 %的GC含量，和所述多个引物对中其它各引物的3 °C内的退火温度。
22. 权利要求19的方法，其中设计各引物对以PCR扩增代表所述核酸目标的序列的部 分的扩增子，并且PCR扩增的扩增子的集合代表所述目标的完整序列的重叠部分。
23. 权利要求19的方法，其中所述多个引物对以长度为约800至1，500个核苷酸的间 隔与所述目标杂交。
24. 包含多对核酸引物的混合物，其中，在使所述混合物连同核酸目标进行聚合酶链式 反应时，所述核酸引物在约相同温度与所述核酸目标杂交并生成扩增子的集合，其中所述 集合中的各扩增子长度为约500至2, 000个核苷酸，从而使得所述目标的整个序列被代表 在所得的扩增子集合中。
25. 权利要求24的混合物，其中引物对集合中的各引物长度为约15至25个核苷酸，具 有约25%-45%的GC含量，和其它各引物的3 °C内的对目标的退火温度。
26. 权利要求24的混合物，其中所述目标是微生物的基因或基因组。
27. 权利要求26的混合物，其中所述基因是赋予所述微生物的抗生素抗性的基因。
28. 权利要求26的混合物，其中所述微生物是病毒、细菌、寄生物或真菌。
29. 权利要求24的混合物，其含有热稳定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP和 dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；盐；缓冲剂；稳定剂和无核酸酶的水。
30. 权利要求24的混合物，其中所述核酸引物不会自杂交。
【文档编号】C12R1/93GK104508142SQ201380024174
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2012年5月9日
【发明者】T. 道姆 L., W. 费希尔 G. 申请人:长角牛疫苗和诊断有限责任公司