专利名称：全基因组范围内基因组dna修饰定量测序方法
技术领域：
本发明属于第二代基因测序技术领域，具体涉及一种全基因组范围内基因组DNA 修饰定量测序方法。
背景技术：
表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的可遗传的表型变化的学科。表观遗传学修饰主要有DNA甲基化/羟甲基化、组蛋白共价修饰、非编码RNA等。表观遗传学修饰在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因印记等方面发挥重要作用，表观遗传修饰异常与很多疾病相关(Feinberg AP. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature 2007； 447: 433-40. Ballestar Ε. Epigenetic alterations in autoimmune rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol 2011; 7:263-71.)，具有重要的石if 究意义。全基因组范围检测生物样本中表观遗传修饰的差异是一种重要的研究手段，可以无偏差的获得大量信息，对于研究发育分化与疾病发生机制具有重要意义。2005年以前，全基因组范围的表观遗传学研究手段主要依靠DNA芯片(如 ChIP-on-Chip)。2001年，由美、英、法、德、日、中六国合作的人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)宣告完成(Initial sequencing and analysis of the human genome. Lander ES, et al. . Nature. 2001 Feb 15;409 (6822) :860-921.)，此后各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，2006年，美国X大奖基金会(www. xprize. org)设立 Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队，从而加速第二代测序(Next-Generation Sequencing, NGS)的出现。 2005年罗氏(Roche)(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Margulies Μ, et al. Nature. 2005 Sep 15; 437 (7057) : 376-80.)、应用生物系统(Applied Biosy stems, ABI) (Universal Ii gat ion-detect ion-react ion microarray applied for compost microbes. Hultman J, et al. . BMC Microbiol. 2008 Dec 30;8:237. )、Illumina (Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Bentley DR, et al. . Nature. 2008 Nov 6;456 (7218):53-9.) 三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。基于焦磷酸测序原理的妨4测序系统(Roche)因其在读长方面的优势，因而在从头测序(de novo)和宏基因组测序(meta genome)方面有着不可替代的地位。基于寡聚物连接检测的测序系统 (ABI)准确率高、对于高GC含量的样本有非常大的优势。Illumina的测序系统基于DNA簇 (DNA cluster)、桥式 PCR (Bridge PCR)和可逆阻断(Reversible terminator)等核心技术以应用范围广泛著称，在功能基因组方面的应用占据优势。DNA甲基化或羟甲基化修饰参与了多个生物过程的调节，成为目前研究的热点。 DNA甲基化检测的方法有很多种，目前直接检测甲基化的方法有薄层层析、HPLC、质谱、单分子实时(SMRT)测序技术等，但每次检测的通量和范围有限。全基因组范围检测DNA甲基化修饰主要有三种方法(1)亚硫酸盐处理后高通量测序；(2)特异性抗体或甲基化DNA结合蛋白亲和富集5mC后高通量测序或启动子芯片分析；(3)甲基化DNA特异性酶切后高通量测序。亚硫酸氢盐转化存在转化不完全(亚硫酸氢盐转化是将序列中未甲基化的胞嘧啶 (C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变)、数据通量要求大、操作繁琐、费钱费力等缺点。最近的研究还表明亚硫酸盐转化与甲基化特异性酶切技术不能区分5mC与5hmC。 已有的全基因组范围检测DNA甲基化或羟甲基化修饰的方法仅适用于定性分析，并不适用于定量分析。 本发明是将第二代测序技术(Illumina NGS平台)应用于表观遗传学研究领域的一种全基因组范围DNA修饰的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可降低测序成本、减少免疫共沉淀(IP)背景干扰的全基因组范围DNA修饰定量测序方法。本发明提出的全基因组范围DNA修饰定量测序方法，是采用标签法(Barcode法)， 对多个待测样品分别加上特异性的序列标签(即Barcode)，然后将这些样品混合在一起进行羟甲基化DNA片段免疫沉淀(hMeD-IP)，从而实现全基因组范围内DNA羟甲基化修饰的定
量测序。本发明中，所述DNA修饰为5-羟甲基胞嘧啶即5hmC修饰，5_甲基化胞嘧啶即5mC 修饰，5-羧基胞嘧啶即5caC修饰，或5-甲酰胞嘧啶即5fC修饰；
本发明中，用到的接头及特异性的序列标签(即Barcode)如下所示 ESC Barcode: CCAG* 接头序列
5’ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAG*T 3’ 3’GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAGGT05’ NPC Barcode: TAGC* 接头序列
5，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGC* T3' 3’GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAATCG*5' MEF Barcode: GCTA* 接头序列
5，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GCTA*T3， 3'GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGACGAT*5'
本发明中，Barcode序列长短可以根据样品个数进行改变，Barcode碱基序列可以随意排列组合。本发明将第二代测序中的Barcode测序应用到功能基因组上的定量方面，可降低测序成本、减少免疫共沉淀(IP)背景对实验结果的干扰，主要应用于全基因组范围定量比较多个生物样品(如发育分化不同阶段的组织细胞、疾病不同阶段的病理组织)基因组DNA 中5hmC修饰差异，也适用于其它DNA修饰，如5mC、5caC、5fC等。本发明提出的全基因组范围DNA修饰(如5hmC修饰等)定量测序方法，具体操作步骤为1.细胞基因组DNA的抽提
可使用不同的方法抽取基因组DNA (如Qiagen公司的Blood & Cell Culture DNA Mini Kit抽提法、蛋白酶K消化后酚氯仿手工抽提法等)，只要得到相对完整， 0D260/280 ^ 1. 8 即可。2. Barcode 样品制备
精确定量基因组DNA，分别取等量的基因组DNA，相同条件下超声处理，将基因组DNA片段化至200-800bp (片段集中在200-500bp);对经超声处理的DNA片段进行末端补平，末端加A，用加了 Barcode的接头序列(接头序列见上)进行连接反应，纯化好的产物用作接下来的羟甲基化DNA片段免疫沉淀实验(hMeD-IP)。3.羟甲基化DNA片段免疫沉淀实验(hMeD-IP)及特异性产物PCR扩增将加好接头的基因组DNA充分混合变性为单链，然后进行羟甲基化DNA片段免疫沉淀
实验(hMeD-IP)反应。羟甲基化DNA片段免疫沉淀实验(hMeD-IP)之后分别对羟甲基化DNA 片段免疫沉淀实验(hMeD-IP)产物及免疫共沉淀前基因组DNA混合物(Input)进行纯化，得到的纯化后的DNA用于接下来的PCR富集反应。PCR完成后2%的琼脂糖胶电泳割胶回收。4.测序
按操作流程在illumina cluster generation及GA Il上进行测序。本发明的优点在于
本发明可以节约测序成本、降低免疫共沉淀带来的背景对实验结果的影响，在总体趋势上，与免疫荧光、点杂交及传统的全基因组测序的结果保持一致的同时，可以同时在全基因组范围对多个样本(组织、细胞)中的5hmC修饰进行定量比较，精确到基因组的某个位点不同修饰的含量比较
1.用免疫荧光的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测5hmC的含量，发现不同细胞的5hmC的含量有差别。2.用点杂交的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测5hmC的含量，进一步证实不同细胞中5hmC含量有差别。3.用全基因组5hmC定量测序技术的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测 5hmC的含量，发现不同细胞的5hmC的含量有差别，与传统方法(免疫荧光的方法、点杂交的方法)的实验结果一致，而且该方法能把基因组的各个区域5hmC的含量能清晰地反映出来，而且能反应5hmC在不同基因区域的分布趋势。4.分别用5hMeDIP-Seq与全基因组5hmC定量测序技术的方法在小鼠胚胎干细胞 (mESCs)中检测5hmC的含量，发现两种方法的趋势是一致的，说明全基因组5hmC定量测序技术的可靠性。
图1 为用免疫荧光的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测5hmC的含量。a, b, c 为用DAPI检测mESCs, mES-derived NPCs, MEFs三种细胞；d, e, f为用5hmC的抗体检测 mESCs, mES-derived NPCs, MEFs 三种细胞。注=DAPI即 4，，6- 二脒基 _2_ 苯基吲哚(4，，6-diamidino_2-phenylindole)。图2为用点杂交的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测5hmC的含量。图3为用全基因组5hmC定 量测序技术的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(mES-derived NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，检测 5hmC的含量。其中，a为5hmC在mESCs中的分布，b为5hmC在mES-derived NPCs中的分布，c为5hmC在MEFs中的分布，d为全基因组中特定区域中，5hmC在三种细胞中的含量。图4为分别用5hMeDIP-Seq与全基因组5hmC定量测序技术的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中检测5hmC的含量。其中，a为用5hMeDIP-Seq的方法在小鼠胚胎干细胞 (mESCs)中检测5hmC的含量，b为用全基因组5hmC定量测序技术的方法在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中检测5hmC的含量。
具体实施例方式下面通过具体例子进一步具体描述本发明。1.细胞基因组DNA的抽提
收集三种细胞小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(NPCs)以及成纤维细胞(MEFs)，分别抽取基因组DNA (Blood & Cell Culture DNA Mini Kit, Qiagen)。2. Barcode 样品制备
将三种细胞(小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞 (NPCs)以及成纤维细胞(MEFs))的基因组DNA精确定量(Quant-iT dsDNA HS assay kit Q32851, Invitrogen)，分别取 5ug 的基因组 DNA 超声(Bioruptor, Diagenode company ) 片段化至200-800bp (片段集中在200-500bp)。超声好的DNA片段按试剂盒(Epicentre， Ent-it DNA end-repair kit)说明进行末端补平，并用Qiagen PCR回收试剂盒(Qiagen PCR Purificaion kit)进行纯化。纯化后的产物用NEB的Klenow (Neb exo_)酶在37°C条件下进行末端加 A，并用 Qiagen Mini Elute PCR 回收试剂盒(Mini Elute PCR Purificaion kit)进行纯化。纯化产物分别与自己合成的加好Barcode的接头(ESC Barcode: CCAG*T， NPC Barcode: TAGOT, MEF Barcode: GCTA*T)按1: 10的摩尔比进行连接反应，分别用 Qiagen PCR回收试剂盒(Qiagen PCR Purificaion kit)进行纯化，纯化好的产物用作接下来的5hMeDIP实验。3. 5hMeDIP实验及特异性产物PCR扩增
将加好接头的三种细胞(小鼠胚胎干细胞(mESCs)及由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经前体细胞(NPCs)以及成纤维细胞(MEFs))的基因组DNA充分混合加TE至300ul，沸水浴 lOmin，立即冰浴 1 Omin,力口 33ul 的 IOXIP buffer，取 5ul 作为 Input。加 7. 5ul 的抗5hmC的抗体，4°C 2小时，在抗体与DNA孵育的过程中用PBS 0. 1%BSA清洗proteinA/G beads (Roche)3次，每次5分钟，并用IxIP buffer清洗2次后，加入抗体与DNA管中，4°C过夜。3000rpm离心1分钟，弃上清，IxIP buffer清洗beads 3次，用300 ul的protease K digestion buffer重悬beads加入4ul protease K，50°C孵育2小时，同时用相同的条件处理Input。离心取上清用H2O补齐至400ul，等体积的Phenol chloroform抽提，Input 与IP管取相同体积的上清，加入2体积的100% Ethanol, 10%体积的3M NaAc及Iul的 Glycogen-20°C过夜沉淀 DNA。14，OOOrpm 4°C离心 10 分钟，Iml 70% ethanol 洗一次，晾干， 30ul TE溶解并用于接下来的PCR富集反应。
权利要求
1.一种全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法，其特征在于采用标签法，对多个待测样品分别加上特异性的序列标签，即Barcode ；然后将这些样品混合在一起进行羟甲基化DNA片段免疫沉淀，从而实现全基因组范围内基因组DNA修饰的定量测序；所述DNA 修饰为5-羟甲基胞嘧啶即5hmC修饰，5-甲基化胞嘧啶即5mC修饰，5-羧基胞嘧啶即5caC 修饰，或5-甲酰胞嘧啶即5fC修饰；其中所用的接头及特异性的序列标签如下所示 ESC Barcode: CCAG* 接头序列5’ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAG*T 3’ 3’GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAGGT05’ NPC Barcode: TAGC* 接头序列5，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGC* T3' 3’GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGAATCG*5' MEF Barcode: GCTA* 接头序列5，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GCTA*T3， 3’ GAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGACGAT*5'。
2.根据权利要求1所述的全基因组范围内基因组DNA修饰定量测序方法，其特征在于具体操作步骤为(1)基因组DNA的抽提使用常规方法抽取基因组DNA，使DNA相对完整，0D260/280 1. 8 ；(2)Barcode样品制备精确定量基因组DNA，分别取等量的基因组DNA，相同条件下进行超声处理，将基因组DNA片段化至200-800bp ；对经超声处理的DNA片段进行末端补平，末端加A，用加了 Barcode的接头序列进行连接反应，纯化好的产物用作接下来的相应修饰的DNA片段的免疫沉淀实验；(3)相应修饰的DNA片段免疫沉淀实验及特异性产物PCR扩增将加好接头的基因组DNA充分混合变性为单链，然后进行相应修饰的DNA片段的免疫沉淀反应；相应修饰的DNA片段免疫沉淀反应之后分别对免疫共沉淀产物及免疫共沉淀前基因组DNA混合物进行纯化，得到的纯化后的DNA用于接下来的PCR富集反应；(4)测序按操作流程在illumina cluster generation及GA Il上进行测序。
3.根据权利要求2所述的全基因组范围的DNA修饰定量测序方法，其特征在于所述 Barcode序列长短根据样品个数进行改变，Barcode碱基序列可随意排列组合。
全文摘要
本发明属于第二代基因测序技术领域，具体为一种全基因组范围内基因组DNA修饰(如5-羟甲基胞嘧啶即5hmC，5-甲基化胞嘧啶即5mC，5-羧基胞嘧啶即5caC、5-甲酰胞嘧啶即5fC等)定量测序方法。本发明是采用标签法，对多个待测样品分别加上特异性的序列标签(即Barcode)，然后将这些样品混合在一起进行相应修饰的DNA片段免疫沉淀，从而实现全基因组范围内基因组DNA修饰的定量测序。具体步骤包括基因组DNA的抽提、Barcode样品制备、相应修饰的DNA片段免疫沉淀实验及特异性产物PCR扩增、illuminaGA‖平台测序。本发明可以在全基因组范围内同时对多个样本中的相应修饰的DNA进行定量比较，精确定位不同区域、不同修饰的DNA的含量差别。
文档编号C12Q1/68GK102329873SQ20111030442
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者吴飞珍, 施扬, 熊莉君, 石雨江, 谭理 申请人:复旦大学