一种基于CRISPR?Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种基于CRISPR?Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用，所述的酿酒酵母基因组编辑载体通过将Cas9蛋白表达框和sgRNA scaffold表达框整合在载体中，获得载体?Cas9?sgRNA scaffold，然后将以ADE1为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条整合到所述的载体?Cas9?sgRNA scaffold中得到所述的酿酒酵母基因组编辑载体。本发明采用单质粒并单拷贝的载体系统，采用一个质粒同时表达Cas9蛋白和sgRNA scaffold，使得靶基因编辑系统只需一步构件和转化，操作简便。
【专利说明】
一种基于CRI SPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其 应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着人类全基因组测序的完成，生命科学研究进入了一个以揭示基因功能为目的 的后基因组时代，基因组编辑技术成为了重要的研究工具和手段。传统的基因组编辑技术 利用同源重组机制(homologous recombination)对基因进行定向编辑，可以帮助科研人员 明确基因的功能，传统的基因组编辑技术是以长片段DNA为靶位点，"定位系统"也必须是长 DNA片段，编辑系统构建复杂且费时，实验周期长，效率很低、且基因易突变等缺陷。第二代 基因组编辑技术(包括ZFN系统和TALEN系统)在一定程度上解决了编辑系统特异性很低的 问题，但是，依旧没能解决编辑系统构建繁琐，费时费力的突出问题。第三代基因组编辑技 术CRISPR-Cas9基因组编辑系统在很大程度上解决了以上问题，相比于之前的基因编辑技 术，CRISPR-Cas9系统有着一些无可比拟的优点。1.靶点多，基因组中平均8个碱基就能找到 一个靶点；2.功能更加丰富，经过不同的改造后可提高编辑效率、及调控基因表达水平； 3.CRISPR-Cas9系统构建步骤简单、使用方便。因此CRISPR-Cas9技术能够大大降低实验难 度，缩短实验周期，提高效率。
[0003] 随着生物技术的发展，CRISPR_Cas9系统发展成为能够对多个物种进行精准基因 组编辑的技术。CRISPR-Cas9系统是来源于细菌和古生菌中的一种由RNA介导的适应性免疫 系统，包括两部分:有切割双链DNA活性的Cas9蛋白和能与靶点DNA序列结合的sgRNA(20个 核苷酸）<XRISPR-Cas9系统仅需20bp的RNA介导其对靶点的编辑，该系统存在构建简便快 捷、编辑效率高、实验周期短等优点，已经成为目前最受热捧的基因组编辑技术。
[0004] 此外，因 CRISPR_Cas9技术具有简便性和通用性，其在科研、农业、精准医疗领域展 现了巨大的应用前景，尤其在传染性疾病、遗传病(如地中海贫血）、肿瘤以及器官移植等领 域开辟了全新的途径。
[0005] 哈佛大学研究人员利用CRISPR_Cas9技术一次性敲除猪细胞中62个逆转录病毒基 因，扫清猪器官用于人体移植的重大难关。美国研究人员针利用该技术将艾滋病毒从艾滋 病患者的细胞基因组中剔除。中山大学黄军就应用CRISPR-Cas9对人体胚胎细胞中修改β-地中海贫血的基因进行的研究有望治愈这一疾病。
[0006] 参考文献
[0007] [l]:D0I:10.1126/science.aadll91
[0008] [2]:D0I:10.1038/srep22555
[0009] [3]:D0I:10.1007/sl3238-015-0153-5
[0010] 但是，现有的CRISPR-Cas9系统由两个质粒组成，其中一个质粒表达具有切割双链 DNA活性的Cas9蛋白，另一个质粒表达sgRNA scaffold。由于CRISPR-Cas9系统采用的是双 质粒系统，存在构建困难，且双质粒易受质粒相容性影响。
[0011] 酵母菌是酿酒和面包等发酵产品制作过程的主要"参与者"，与人类生产和生活息 息相关，广泛应用于食品、医药、化工等领域。酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)在分 子遗传学方面是最先作为外源基因表达的酵母宿主物的酵母菌具有比较完备的基因表达 调控机制和对表达产物的加工修饰能力。在医药领域酵母也具有得天独厚的优势，如斯坦 福大学Christina D.Smolke通过导入来自植物、细菌和啮齿动物的21个基因，成功地在酵 母菌内将糖转化为吗啡的前体--蒂巴因（thebaine)，Christina D. Smolke还发现，进一 步调整过的酵母可以产生氢可酮一一一种由蒂巴因化学合成的止痛药。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种在一个质粒中表达 CRISPR-Cas9系统，减少后续编辑系统构建难度的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组 编辑载体及其应用。
[0013]为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0014]本发明的一个目的是提供一种基于CRISPR_Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载 体，所述的酿酒酵母基因组编辑载体通过将Cas9蛋白表达框和sgRNA scaffold表达框整合 在载体中，获得载体-Cas9-sgRNA scaffold，然后将以ADE1为靶位点设计合成的多条sgRNA 片段中的任意一条整合到所述的载体-Cas9-sgRNA scaffold中得到所述的酿酒酵母基因 组编辑载体。
[0015] 具体地，所述的Cas9蛋白表达框包括TEF1启动子、Cas9蛋白、CYC1终止子。
[0016] 更具体地，所述的Cas9蛋白表达框的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 具体地，所述的sgRNA scaffold表达框包括SNR52启动子、sgRNA scaffold、SUP4 终止子。
[0018] 更具体地，所述的sgRNA scaffold表达框的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019] 具体地，所述的多条sgRNA片段的序列分别如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8所示。
[0020] 具体地，所述的载体为pSynoYAC0，其序列如SEQIDN0.9所示。
[0021 ] 具体地，所述的载体_Cas9_sgRNA scaffold的序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0022]本发明的另一个目的是提供一种所述的基于CRISPR_Cas9系统的酿酒酵母基因组 编辑载体的制备方法，其包括如下步骤：
[0023] 步骤（1)、根据已知序列设计并合成Cas9蛋白表达框、sgRNA scaffold表达框和多 条sgRNA片段；
[0024]步骤(2)、将Cas9蛋白表达框重组到经酶切的载体中，获得载体-Cas9;
[0025] 步骤（3)、将sgRNA scaffold表达框重组到经酶切的载体-Cas9中，获得载体-Cas9~sgRNA scaffold；
[0026] 步骤（4)、将多条sgRNA片段中的任意一条重组到经酶切的载体-Cas9-sgRNA scaffold中，获得所述的酿酒酵母基因组编辑载体。
[0027] 本发明中，按照常规基因合成方法合成Cas9蛋白表达框、sgRNA scaffold表达框 和多条sgRNA片段，其中，Cas9蛋白表达框分为每段lkb进行合成。
[0028] 具体地，步骤(2)采用AscI酶切载体;步骤(3)采用Pmel酶切载体-Cas9;步骤(4)采 用Notl酶切载体_Cas9_sgRNA scaffold。
[0029] 具体地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中进行重组的反应温度为48~52°C，重组反应 时间为50~70min。
[0030] 具体地，步骤(2)将Cas9蛋白表达框重组到经酶切的载体中，然后电转至Epi300感 受态细胞中进行培养，获得所述的载体_Cas9。
[0031] 具体地，步骤(3)将sgRNA scaffold表达框重组到经酶切的载体-Cas9中，然后电 转至Ep i 300感受态细胞中进行培养，获得所述的载体-Cas9_sgRNA scaffο 1 d。
[0032] 具体地，步骤（4)将多条sgRNA片段中的任意一条重组到经酶切的载体-Cas9_ sgRNA scaffold中，然后电转至Epi300感受态细胞中进行培养，获得所述的酿酒酵母基因 组编辑载体。
[0033] 更具体地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中电转至Epi300感受态细胞中，然后涂布 CmR平板，在36~38°C下进行培养11~12h。
[0034]本发明的第三个目的是提供一种基于CRISPR_Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑系 统的制备方法，其通过将所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体电转至 电转化感受态细胞中，然后进行培养得到所述的酿酒酵母基因组编辑系统。
[0035] 具体地，电转化感受态细胞为VL6-48N电转化感受态细胞。
[0036] VL6-48N电转化感受态细胞制备方法：
[0037] 1.取超低温冰箱中冻存的VL6-48N酵母菌液于YH)平板上稀释涂布，30°C培养2天， 获得单菌落；
[0038] 2.挑取单菌落于50mLYro液体培养基中培养过夜；
[0039] 3 ·当菌液生长到0D6QQ在0 · 4-0 · 6时3000rpm离心10min收集菌体；
[0040] 4.0°C预冷的无菌水重悬菌体，3000rpm离心10min;
[0041 ] 5 · 0°C预冷的10 %甘油重悬菌体，3000rpm离心10min;
[0042] 6.重复步骤5;
[0043] 7.1mL10%甘油重悬步骤6菌体，每管200uL菌液，分装于1.5mL无菌EP管中，即为 VL6-48N电转感受态。
[0044]本发明的第四个目的是提供一种所述的基于CRISPR_Cas9系统的酿酒酵母基因组 编辑载体在酿酒酵母基因中的应用。
[0045] 由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0046] 本发明采用单质粒并单拷贝的载体系统，采用一个质粒同时表达Cas9蛋白和 sgRNA scaffold(能在两种不同的生物中复制的载体，例如既能在原核生物中复制，又能在 真核生物中复制的载体），使得靶基因编辑系统只需一步构件和转化，操作简便。且本发明 构建的质粒为单拷贝，属于严谨性控制。
[0047] 说明书附图
[0048] 图 1 为pSynoYACO载体图；
[0049] 图2为pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold载体图。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施 例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。
[0051 ] 实施例1:
[0052] 1、根据已知序列设计以下序列：
[0053] 1)酵母Cas9蛋白表达框（TEFlpromoter-Cas9-CYClte;rminito;r)，包括TEF1 启动 子，Cas9蛋白，CYC1终止子，序列见SEQ ID N0.1，其中：位于SEQ ID N0.1序列首尾的 CGAACGCCATCGACTTACCAGTATGCTACTTACTAT和CAGCAGGAGCTGGACTCTACTGATGTCTGGACAGC为 Cas9蛋白表达框与pSynoYACO载体同源臂序列；ggcgcgcc和ggcgcgcc为AscI酶切位点序列， GTTTAAAC为Pme頂每切位点。
[0054] 2)sgRNA scaffold表达框（SNR52 promoter+sgRNA ScafTold+SUP4terminito;r) 序列见SEQIDN0.2，其中：位于SEQIDN0.2序列首尾的GGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGC和 gctgctaacaaagcccgaaag为sgRNA Scaffold表达框与pSynoYAC0_Cas9载体同源臂序列， GTTTAAAC为Pme頂每切位点序列。
[0055] 3)以ADE1为靶位点的6条sgRNA片段的引物，序列见SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
[0056] ADElsgRNA片段与pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold同源臂序列为
[0057] F：tctccgcagtgaaagataaatgatc(SEQ ID NO.11)
[0058] R:GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQ ID N0.12)。
[0059] 2、根据常规基因合成方法合成步骤1中所有片段。
[0060] 1)PCR 扩增
[0061] 其中Cas9蛋白表达框分为每段lkb进行合成，一轮和二轮反应体系如下表。
[0062] 表1为PCR扩增一轮反应体系，表2为PCR扩增一轮反应程序。
[0063] 表 1
[0064]
[0065]
[0066] 表 2
[0067]
[0068] 一轮反应结束后进行二轮反应。
[0069] 表3为PCR扩增二轮反应体系，表4为PCR扩增二轮反应程序。
[0070] 表 3
[0071]
[0075]经二轮扩增得到的PCR产物进行胶回收。
[0076] 2)平连反应：
[0077] 胶回收片段进行平连反应，反应体系如下表5,其中平连载体为经平末端内切酶酶 切后的PUC载体。
[0078] 表 5
[0079]
[0080] 平连反应程序为22Γ反应30min。
[0081] 3)转化、涂板
[0082] 将上述反应液冷却后加入到于冰上融化的感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰 浴放置30min。42°C热激90秒，冰浴2min。加入400~500yL LB培养基，37 °C恢复培养60min。 5000rpm离心5min后弃去上清，沉淀重悬后均勾涂布筛选平板上。于37°C培养12h。
[0083] 4)克隆鉴定
[0084] 用无菌牙签挑选单菌落于200μ1左右LB培养基中，放入37°C摇床1~2h后，取3μ1菌 液进行菌检PCR扩增【菌检引物为77:GATGTGCTGCAAGGCGATTA(SEQ ID Ν0.13)和88: TTATGCTTCCGGCTCGTATG(SEQ ID NO. 14)】，剩余菌液继续放入摇床。6h后将检到的菌液送测 2~4个。表6为菌检反应体系，表7为菌检反应程序。
[0085] 表 6
[0086]
[0087]
[0088] 表 7
[0089]
[0090] 菌检反应结束后，点胶验证PCR产物大小是否正确，培养6h后将检到的菌液送测2 ~4个，测序引物同样为77/88。
[0091] 将测序结果与设计序列进行比对，确定正确克隆。
[0092]以正确克隆质粒为模板进行扩增获得序列正确PCR产物，各PCR片段进行PCR反应 拼接，获得拼接产物，拼接产物胶回收。
[0093] Cas9蛋白表达框（TEF1 promo ter_Cas9_CYCl termini tor)片段，其与pSynoYACO 载 体AscI酶切位点两侧同源臂为CGAACGCCATCGACTTACCAGTATGCTACTTACTAT(SEQ ID NO. 15) 和GCTGTCCAGACATCAGTAGAGTCCAGCTCCTGCTG(SEQIDN0·16)(其与SEQIDN0·1的同源臂反 向互补），同时也是Cas9蛋白表达框扩增引物。sgRNA scaffold表达框与pSynoYAC0_Cas9载 体同源臂为GGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGC(SEQ ID N0.17)和CTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC(SEQ ID NO. 18)(其与SEQ ID NO. 2的同源臂反向互补），同时也是其扩增引物。sgRNA序列两端为 sgRNA片段与pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold载体NotI酶切位点两侧的同源臂为 tctccgcagtgaaagataaatgatc(SEQIDN0.1lWPGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQID N0.12)。
[0094] 3、Asc頂每切载体pSyn〇YAC0(SEQ ID N0.9)，采用切胶回收酶切后的载体。
[0095] 4、TEFlpromo ter_Cas9_CYCl termini tor 片段重组经 AscI 酶切的pSynoYACO 载体片 段，50 °C反应lh。反应结束后转化Epi 300感受态细胞，涂布CmR平板。37 °C培养12h后挑取单 克隆进行菌检，挑取菌检大小正确克隆进行送测，测序结果与序列进行比对，获得 pSynoYAC0-Cas9 正确克隆。
[0096] 5、Pme頂每切pSyn〇YAC0-Cas9载体正确克隆，采用切胶回收酶切后的载体。
[0097] 6、sgRNA scaffold表达框片段重组经Pmel酶切的pSynoYACO载体片段，50°C反应 lh。反应结束后转化Epi300感受态细胞，涂布CmR平板。37°C培养12h后挑取单克隆进行菌 检，挑取菌检大小正确克隆进行送测，测序结果与序列进行比对，获得pSyn 〇YAC0-Cas9-sgRNA scaffold正确克隆（SEQ ID Ν0· 10)。
[0098] 7、NotI酶切pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold载体正确克隆，采用切胶回收酶切 后的载体。
[0099] 8、sgRNA片段重组经Notl酶切的pSynoYAC0-Cas9-sgRNA scaffold载体片段，50Γ 反应lh。反应结束后转化Epi 300感受态细胞，涂布CmR平板。37 °C培养12h后挑取单克隆进行 菌检，挑取菌检大小正确克隆进行送测，测序结果与序列进行比对，获得pSyn〇YAC0-Cas9-ADEl-sgRNA scaffold正确克隆。
[0100] 9、制备VL6-48N电转化感受态细胞：
[0101] (1)取超低温冰箱中冻存的VL6-48N酵母菌液于YPD平板上稀释涂布，30°C培养2 天，获得单菌落；
[0102 ] (2)挑取单菌落于50mLYro液体培养基中培养过夜；
[0103] (3)当菌液生长到0D6QQ在0.4-0.6时3000rpm离心10min收集菌体；
[0104] (4)0°C预冷的无菌水重悬菌体，3000rpm离心10min;
[0105] (5)0°C预冷的10%甘油重悬菌体，3000rpm离心10min;
[0106] (6)重复步骤5;
[0107] (7) lmLIO %甘油重悬步骤6菌体，每管200uL菌液，分装于1.5mL无菌EP管中，即为 VL6-48N电转感受态。
[0108] 10、电转lug pSynoYAC〇-Cas9-ADEl_sgRNA scaffold载体。
[0109] 11、电转后菌液于含有Yro液体培养基的单管中培养I2h。
[0110] 12、3000rpm，2min离心上述菌液，山梨醇清洗两次细胞，涂布0 · 06g/L腺嘌呤的组 氨酸缺陷型酵母固体培养基。
[0111] 13、2天后观察酵母单克隆生长情况，统计红色克隆比例。
[0112] 14、挑取红色克隆于单管中进行培养30°C，1天。
[0113] 15、将上述菌液提取基因组。
[0114] 采用 ADE1 扩增引物 CAATTACGAAGACTGAACTGGACGG(SEQ ID N0. 19)和 CTACGTGACAAATCTTCACCCACCAG(SEQ ID NO. 20)扩增提取出的酵母基因组并对PCR产物进行 测序。分析测序结果，计算成功编辑的克隆比例30%。
[0115] 以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本 发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施 例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征在于:所述的酿酒 酵母基因组编辑载体通过将Cas9蛋白表达框和sgRNA scaffold表达框整合在载体中，获得 载体-Cas9-sgRNA scaffold，然后将以ADE1为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意 一条整合到所述的载体-Cas9-sgRNA scaffold中得到所述的酿酒酵母基因组编辑载体。2. 根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征在 于:所述的Cas9蛋白表达框包括TEF1启动子、Cas9蛋白、CYC1终止子。3. 根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征 在于:所述的Cas9蛋白表达框的序列如SEQ ID N0.1所示。4. 根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征 在于:所述的sgRNA scaffold表达框包括SNR52启动子、sgRNA scaffold、SUP4终止子。5. 根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征在 于:所述的sgRNA scaffold表达框的序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征 在于：所述的多条sgRNA片段的序列分别如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8所示。7. 根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体，其特征 在于:所述的载体为pSynoYAC0，其序列如SEQIDN0.9所示。8. -种如权利要求1至7中任一项所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑 载体的制备方法，其特征在于:其包括如下步骤： 步骤（1)、根据已知序列设计并合成Cas9蛋白表达框、sgRNA scaffold表达框和多条 sgRNA片段； 步骤(2)、将Cas9蛋白表达框重组到经酶切的载体中，获得载体-Cas9; 步骤（3)、将sgRNA scaffold表达框重组到经酶切的载体-Cas9中，获得载体-Cas9-sgRNA scaffold； 步骤（4)、将多条sgRNA片段中的任意一条重组到经酶切的载体-Cas9-sgRNA scaffold中，获得所述的酿酒酵母基因组编辑载体。9. 一种基于CRI SPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑系统的制备方法，其特征在于:其 通过将权利要求1至7中任一项所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体电 转至电转化感受态细胞中，然后进行培养得到所述的酿酒酵母基因组编辑系统。10. -种如权利要求1至7中任一项所述的基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编 辑载体在酿酒酵母基因中的应用。
【文档编号】C12N1/18GK106086061SQ201610599571
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月27日 公开号201610599571.0, CN 106086061 A, CN 106086061A, CN 201610599571, CN-A-106086061, CN106086061 A, CN106086061A, CN201610599571, CN201610599571.0
【发明人】季广建, 钟云鹏, 蔡晓辉, 李彦敏, 杨平
【申请人】苏州泓迅生物科技有限公司