一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法
【专利摘要】一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，包括如下步骤：首先通过PCR反应构建Mbp1基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵母两种配型的单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbp1基因的酿酒酵母突变菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，最后根据突变菌株细胞形态的变化来验证Mbp1基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbp1基因与细胞形态相关。在分析细胞形态时，本发明采用流式细胞仪对细胞体积变化进行分析，具有快速简单、耗时短和可大批量操作的优点，对于快速鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株表型相关基因资源有重要意义。CCTCC M 20144092014.09.11
【专利说明】-种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，具体是一种验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态 的方法。
【背景技术】
[0002] 根据用途及来源的不同，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)分为模式菌株和 工业菌株，模式菌株的基因信息、遗传背景较为清楚，有多种遗传标记可以选择，一般只是 作为实验室研究的对象或工具；工业菌株一般是从自然界中筛选获得的、对人们生活或生 产有价值的菌株，其遗传信息不明了，没有遗传标记，对其进行改造或研究的难度较大。为 了更好地应用工业酿酒酵母菌株，亟需鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株的基因的功能。
[0003] 酿酒酵母Mbpl基因编码Mbplp蛋白，该蛋白与Swi6p组成转录复合物MBF。MBF 是转录抑制因子[deBruinRAM,KalashnikovaTI，ChahwanC，etal.Constraining Gl-specifictranscriptiontolateGlphase:theMBF-associatedcorepressor Nrmlactsvianegativefeedback[J].Molecularcell, 2006,23(4) :483_496]。研究发 现，白色念珠菌（Candidaalbicans)在敲除Swi4基因和Swi6基因后会形成假菌丝，但单 独敲除Mbpl不会出现假菌丝[HusseinB,HuangH,GloryA，etal.Gl/Stranscription factororthologuesSwi4pandSwi6pareimportantbutnotessentialforcell proliferationandinfluencehyphaldevelopmentinthefungalpathogenCandida albicans]。敲除酿酒酵母Mbpl基因对酿酒酵母细胞形态，如假菌丝形成是否有影响尚无 报道。
[0004] 基因敲除是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一 定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影 响，进而推测该基因的生物学功能。目前构建基因敲除组件常用的方法是融合PCR。融合 PCR需要分别扩增出目标基因特定位点的上下游同源臂以及选择性标记基因，然后再通过 一步或两步PCR反应才获得基因敲除组件。融合PCR方法不仅费时费力，且融合效率低。
[0005] 酿酒酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过 有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常会死亡。二倍体是酵母的优势形态，可以通过简单 的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍 体的交配类型有两种，即a型和a型，这两种单倍体可以交配，重新形成二倍体。单倍体 酵母是a型还是a型，由单个基因座MAT所决定。MAT有一对等位基因MATa和MATa，它 们的片段大小不一样，根据片段大小即可验证单倍体酵母是属于a型还是a型。直接对二 倍体菌株进行基因改造，得到的只是显性突变，隐性突变会被漏掉。所以最好是先制备单倍 体，对单倍体进行改造，再将单倍体突变子通过有性交配恢复为二倍体，从而获得二倍体突 变株。
[0006] 现有技术中，通常采用光学显微镜分析细胞体积，该方法繁琐、需要用肉眼观察、 容易产生误差，不利于批量分析。
【发明内容】
[0007] 为了快速挖掘工业酿酒酵母菌株的基因资源，本发明提供一种验证酿酒酵母Mbpl 基因影响细胞形态的方法。本方法敲除单倍体的Mbpl基因后进行单倍体复性，得到敲除 Mbpl基因的二倍体突变菌株酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,通过酿酒酵 母细胞形态的变化来判断Mbpl基因是否与细胞形态相关。在分析细胞形态时，为了解决采 用光学显微镜分析细胞体积存在的繁琐、容易产生误差的问题，本发明采用流式细胞仪对 细胞体积变化进行分析，当细胞流通过流式细胞仪时，流式细胞仪发出的激光照射细胞而 发生散射，前向角散射（FSC)光与细胞的体积大小有关，并且FSC的强度与细胞大小成正 t匕。该方法具有快速简单、耗时短和可大批量操作的优点。本发明验证了Mbpl基因影响酿 酒酵母细胞形态。证实了只敲除Mbpl基因的酿酒酵母会形成假菌丝，而现有技术中发现只 敲除Mbpl基因的白色念珠菌不会形成假菌丝。
[0008] 本发明构建敲除组件时，在引物中引入与Mbpl基因上下游同源以及与选择性标 记基因互补的序列，即正向引物：与Mbpl基因上游同源的序列-选择性标记基因正向引物； 反向引物：与Mbpl基因下游同源的序列-选择性标记基因反向引物。通过一次PCR即可获 得Mbpl基因敲除组件，即Mbpl基因上游同源臂-选择性标记基因-Mbpl基因下游同源臂。 因为引物太长，本发明中敲除组件构建成功的关键是缩短退火时间，提高退火温度。由于退 火温度过高会使PCR效率过低，所以采用降落PCR这一简易的方法进行优化。降落PCR设 计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为 高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确 保第一个引物_模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反 应物之间。
[0009] 本发明的技术方案如下：一种验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，包括 如下步骤：首先通过PCR反应构建Mbpl基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵 母两种配型的单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbpl基因的酿酒酵母突变菌株酿 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,最后根据突变菌株细胞形态的变化来验证 Mbpl基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbpl基因与细胞形态相关。
[0010] 所述酿酒酵母为野生型二倍体工业酿酒酵母。
[0011] 所述突变菌株细胞形态的变化是指是否形成假菌丝。
[0012] 所述突变菌株细胞形态的变化是指细胞体积是否发生变化，所述细胞体积是否发 生变化是通过流式细胞仪进行分析。
[0013] 所述突变菌株细胞形态的变化是指单菌落形态是否发生变化。
[0014] 所述突变菌株细胞形态的变化是指SDS和刚果红是否抑制菌株生长。
[0015] 所述敲除Mbpl基因的酿酒酵母是指首先敲除单倍体的Mbpl基因，然后通过单倍 体复倍获得敲除Mbpl基因的二倍体酿酒酵母。
[0016] 本发明的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,该菌株已经于2014 年9月11日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏号为：CCTCCM 2014409。地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] 1、证实了Mbpl基因影响工业酿酒酵母细胞形态。
[0019] 2、证实了只敲除Mbpl基因的酿酒酵母会形成假菌丝，而现有技术中发现只敲除 Mbpl基因的白色念珠菌不会形成假菌丝。
[0020] 3、采用流式细胞仪对细胞体积变化进行分析，具有快速简单、耗时短和可大批量 操作的优点。
[0021] 4、本发明对于快速鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株表型相关基因资源有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例中以PUG为模板扩增敲除组件，其中，F:正向引物，A:Mbpl 基因上游同源臂，C:KanMX基因5'端互补序列，R:反向引物，B:Mbpl基因下游同源臂，D: KanMX基因3'端互补序列。
[0023] 图2为本发明实施例中敲除组件的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M:DNA分子量 marker, 1 :敲除组件。
[0024] 图3为野生型菌株和突变菌株的单菌落形态。
[0025] 图4为野生型菌株和突变菌株的单细胞形态。
[0026] 图5为野生型菌株和突变菌株在刚果红平板上的菌落形态。
[0027] 图6为野生型菌株和突变菌株在SDS平板上的菌落形态。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0029] 以下实施例所涉及实验材料如下：
[0030] 菌株和质粒：工业酿酒酵母菌株由广西科学院生物科学与技术研究中心筛选获 得；质粒PSH65和PUG6分别购自宝赛生物科技有限公司。
[0031] 试剂盒和试剂：TIANprepMiniPlasmidKit购自天根生化科技（北京）有限公 司，rTaq酶等PCR相关试剂购自TaKaRa公司，其它试剂为进口分析纯或国产产品。
[0032] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0033] 以下实施例所涉及引物如表1所示。
[0034] 表1引物序列表
[0035]
【权利要求】
1. 一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5,其特征在于，该菌株已经于 2014年9月11日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏号为：CCTCC M 2014409。
2. -种验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于，包括如下步骤：首 先通过PCR反应构建Mbpl基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵母两种配型的 单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbpl基因的酿酒酵母突变菌株，最后根据突变菌 株细胞形态的变化来验证Mbpl基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbpl 基因与细胞形态相关。
3. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述酿酒酵母为野生型二倍体工业酿酒酵母。
4. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指是否形成假菌丝。
5. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指细胞体积是否发生变化，所述细胞体积是否发生变化是 通过流式细胞仪进行分析。
6. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指单菌落形态是否发生变化。
7. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指SDS和刚果红是否抑制菌株生长。
8. 根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbpl基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述敲除Mbpl基因的酿酒酵母是指首先敲除单倍体的Mbpl基因，然后通过单倍体复倍获 得敲除Mbpl基因的二倍体酿酒酵母。
【文档编号】C12Q1/02GK104342378SQ201410482298
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】陈小玲, 张穗生, 罗贞贞, 陆琦, 吴仁智, 陈英 申请人:广西科学院