一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明将一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因TIR2转入植物并使得这种转基因植物能够具备增加植物抗寒性的作用。所述冷休克蛋白基因TIR2含756个碱基，编码的氨基酸251个；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。本发明中来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因采用人工方法合成，转基因植物具备较高的抗寒性。
【专利说明】一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因的序列，利用农杆菌将该基因转化到植物中，使植物抗冻能力得到提高。
【背景技术】
[0002]植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型所控制，又受系统发育中生理生态因素所制约。逆境会诱导植物表达大量的特异蛋白，不同的逆境诱导表达的蛋白不完全相同，既有交叉又有差别，而同一种逆境在同一种植物的不同部位所诱导表达的蛋白也不完全相同，在不同的植物物种中这些蛋白的合成差别就更大(Kasuga et al., Nature Biotechnol.，1999，17:287-291)。因此有很多的蛋白参与了植物对非生物逆境的反应，它们协同作用来调整植物生理代谢的变化，从而提高植物对非生物逆境的适应性，可见植物对非生物逆境的抵抗是体内的系统反应，并不是由一个两个功能基因就能完成的(Urrutia et al., Biochem.Biophy.Acta., 1992,1121 =199-206)。逆境胁迫导致植物体内产生多方面的变化:如抗逆基因的表达，新蛋白质的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累，气孔的关闭，光合作用的降低等(Smirnoff, Curr.0pin.Biotech.， 1998,9:214-219)。
[0003]人们就逆境对植物影响的认识和研究，首先是从表观生理指标一般性描述开始，其次研究植物在各种逆境下产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分子水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号传导、基因表达与调控、蛋白质组装和细胞膜功能获得。为更深入了解植物对不同逆境响应的分子机理和研究人工调控的生物技术等方面展示出良好前景。
[0004]温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布、生长和产量(Viswanathan etal., Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol Sc1.,2002,357(1423):877-886)。在研究中人们发现植物在长期的进化中发展·了许多对温度逆境的适应能力。但目前对植物这种冷适应的机理还不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。
[0005]本项发明利用PTDS法合成了来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，将该基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的抗冻能力，该类基因对于培育植物抗低温的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于将一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物的抗冻性的功能。
[0007]一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008]所述来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因长756bp，编码的氨基酸251个。[0009]所述来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因通过农杆菌介导转入拟南芥，应用于植物抗冻性。
[0010]所述来源于短杆菌的丙烯酰胺降解酶基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤:
[0011 ] I)冷休克蛋白TIR2的人工合成
[0012]依照PTDS(PCR-basedtwo-step DNA synthesis,PTDS)方法进行源自短杆菌的丙烯酰胺降解酶基因进行化学合成，在保持TIR2基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成了冷休克蛋白TIR2基因。
[0013]2)TIR2农杆菌双元载体的构建
[0014]TIR2基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在pCAMBIA-1301载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单兀，这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单兀内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355启动子+TMV omega leader sequence 控制
[0015]3)电击法转化农杆菌
[0016]参照MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions andApplication Guide (BIO-RAD公司)制备农杆菌GV3101感受态.并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。
[0017]4)农杆菌介导转化拟南芥
[0018]利用蘸花法将构建好的农杆菌`转入拟南芥体内.首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3~5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4 V冰箱贮存待用。
[0019]5)拟南芥转化植株种子的筛选
[0020]将得到的种子进行筛选，包括⑶S组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测得到转入TIR2基因的拟南芥。
[0021]6)转基因拟南芥抗冻性验证
[0022]将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于低温抗性实验。将野生型和转基因培养皿小苗在4°C冰箱下培养48小时，然后放到_20°C冷冻30min，然后再放回4°C冰箱放置过夜恢复，第二天再放回培养室恢复培养。结果表明，野生型和转基因拟南芥培养皿小苗的存活率有很大的差异。
[0023]本发明实现的有益.效果
[0024]本发明采用PTDS法合成了来源于酿酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，为了进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，我们比较了转TIR2基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明，野生型和转TIR2基因拟南芥植株在存活率上有很大的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力，这也表明TIR2的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是用于拟南芥转化的植物表达载体示意图。
[0026]图2是获得的转TIR2基因拟南芥的GUS染色图。
[0027]图3是转TIR2基因拟南芥与野生型拟南芥的抗冻表型图。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0029]本发明所用的试验材料及其来源包括:
[0030]野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia, 23°C人工气候室培养，16h光照培养。
[0031]克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。
[0032]本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
[0033]本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)
[0034]实施例1
[0035]酿酒酵母TIR2基因的人工合成
[0036]根据Genbank登录的酿酒酵母TIR2基因序列(Genbank N0.Z74918)，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98],在不改变RhlA和RhlB亚基基因编码的氨基酸序列的前提下，按以下原则进行合成基因编码区的设计:(一)优化基因密码子，提高基因翻译效率。(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。(四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性。(五)设计提闻基因5’端的自由能，以提闻基因翻译起始效率。
[0037]扩增条件为:94°C预热Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，2min，使用的 Taq DNA 聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。
[0038]PCR结束后，I %琼脂糖胶回收，取10 μ I直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化DH5a感受态中。获得阳性克隆。
[0039]实施例2
[0040]TIR2农杆菌双元载体的构建
[0041]上述人工合成的TIR2基因的阳性克隆用引物SPl基因ORF经PCR扩增后头尾分别加入Bam HI和Sac I切点，经Bam HI+Sac I双酶切，回收DNA片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体(见图1)。
[0042]实施例3[0043]电击法转化农杆菌
[0044]I)制备农杆菌GV3101感受态，方法参照MicroPulser?ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)((Raineri et al.，Bi0.Tech.，1990,8:33-38)。
[0045]2)取50 μ L GV3101感受态细胞，加入I μ L DNA,转入0.2cm电击杯转化(400 Ω，
2.5KV，25 μ f)。加入ImL含有I %甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28°C，250rpm)。分别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,庆大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)。
[0046]3)挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定，PCR检测。
[0047]实施例4
[0048]农杆菌介导转化拟南芥
[0049]A拟南芥的培养
[0050]I)拟南芥种子在4°C进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。
[0051]2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9: 3: 0.5的比例拌匀，经高温灭菌后装于IOcm的塑料小盆，以营养液PNS浸 湿待用。
[0052]3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养2-3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。
[0053]4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2-lOcm(少数已经开花)可用于转化(何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志，1991，13(3):97-101)。
[0054]B农杆菌的准备
[0055]I)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培养 20 小时。(Rashid et al., 1996)
[0056]2)取ImL菌液转接入20_30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培养约 12 小时，测 0D600 ~1.5。
[0057]3)8000rpm，4°C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖，
0.05% Silwet L-77)并稀释至 0D600 ~0.8。
[0058]C拟南芥蘸花法转化
[0059]I)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3~5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。
[0060]2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。
[0061]3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。
[0062]实施例5
[0063]拟南芥转化植株种子的筛选
[0064]I)称25_30mg种子放入1.5mL离心管。
[0065]2)乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒,去上清。
[0066]3)加入ImL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡,充分消毒)，8000rpm离心5秒,去上清。
[0067]4)无菌水洗涤3-4次。
[0068]5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg 50 μ g/mL)上，ParafiIm膜封口，4°C冰箱放置两天，220C，16小时光照培养6天。
[0069]6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Tl)继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。
[0070]实施例6
[0071]转基因阳性植株的检测
[0072]按Jefferson (1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液(50mmol/L NaH2P04, ρΗ7.0 ;0.5m mol/L Κ4 [Fe (CN) 6]，0.1% Triton Χ-100，20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保温2-4小时后，用75%乙醇脱色观察(见图2)。
[0073]实施例7
[0074]酿酒酵母TIR2基因转化植物后的抗冻分析 [0075](一 )试验方法:
[0076]将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于低温抗性实验。将野生型和转基因培养皿小苗在4°C冰箱下培养48小时，然后放到_20°C冷冻30min，然后再放回4°C冰箱放置过夜恢复，第二天再放回培养室恢复培养。结果表明，野生型和转基因拟南芥培养皿小苗的存活率有很大的差异。
[0077]( 二)试验结果:
[0078]经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的表型差异如图3所示。
【权利要求】
1.一种来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根据权利要求1所述的来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1或2所述的来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因采用人工方法制备而成。
4.权利要求1或2所述的来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因采用农杆菌蘸花法转化拟南芥。
5.权利要求1或2所述的来源于来源于酿酒酵母的冷休克蛋白基因植物抗寒性中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103789326SQ201210440002
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月29日 优先权日:2012年10月29日
【发明者】周惠, 苗辉, 蒋海燕, 张杨, 蒋小辉 申请人:无锡柏欧美地生物科技有限公司