专利名称：信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物工程技术领域。具体的说，本发明涉及一种信号调节蛋白 α (SIRPa)在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。
背景技术：
信号调节蛋白a (signal-regulatory proteins, SIRP α )是一个抑制性受体蛋白家族成员。在1996年的MOLECULAR AND CELL BIOLOGY杂志和1997年发表的NATURE杂志中，大鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶SIRP α首先被鉴定。SIRPa也叫SHPS-1，CD172，Ρ84，是一种主要表达与髓系细胞的膜蛋白，GeneID :1拟61. SIRP α结构由一个包含3个免疫球蛋白样结构的膜外段、包含一个ITIM基序的胞内段及包含M个氨基酸的跨膜区组成。由于其特殊的细胞定位和结构，决定了它在不同细胞中传递不同信号发挥不同的调节功能。SIRPa是目前发现的为数不多的同时表达于免疫细胞与组织细胞的抑制性受体； 而在免疫细胞它只表达在树突状细胞(DC)、单核/巨噬细胞和肥大细胞，而不在淋巴细胞表达。在免疫调节方面的作用，有报道在树突状细胞(DC)，SIRPa可抑制LPS诱导的DC成熟并抑制成熟DC分泌IL-12，且DC表面SIRP α还可通过与其在T细胞上的配体⑶47的作用双向负调节T细胞和DC的功能(参见本申请人于20100316申请的中国发明专利申请 CN201010125677.X，发明名称为信号调节蛋白α在制备预防和治疗肿瘤的DC疫苗中的应用)。目前尚无文献报道SIRPa在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。也无文献报道有关SIRP α调节肥大细胞激活。
发明内容
本发明的目的在于提供信号调节蛋白α的新用途，特别是提供SIRP α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。在本发明中我们克隆了 SIRPa基因，构建了质粒；同时我们分析和构建了干扰 SIRPa表达的siRNA和干扰质粒；本发明还利用上述两种质粒构建了慢病毒，可以过表达或干扰SIRP α表达。利用构建的质粒和siRNA，我们可以调控SIRP α表达水平。利用制备的生物材料我们可以通过干预肥大细胞SIRPa水平来预防和治疗过敏性疾病。本发明的技术方案主要包括一下几个方面1、siRNA干扰片段的设计和成；干扰SIRP α质粒的构建。2、SIRP α基因的克隆和表达质粒的构建。3、腺病毒表达载体、干扰载体的构建和病毒的包装。4、骨髓来源的肥大细胞的分离培养和腺病毒感染。5、体外观察过表达和干扰SIRP α表达肥大细胞的反应(a)过敏反应模型下观察肥大细胞脱颗粒情况；(b)过敏原刺激下肥大细胞炎性因子合成分泌情况和(C)激活信号通路情况；(d)肥大细胞激活状态下细胞骨架聚合情况和(e)细胞内钙离子流动情况。本发明提供了信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。本发明提供的调节SIRP α表达的工具能够显著地影响肥大细胞活化状态，实验结果表明1)高低不同SIRP α表达对肥大细胞脱颗粒反应调节作用。RBL细胞高表达SIRP α减少细胞钙离子流动，抑制脱颗粒反应，而肥大细胞内干扰SIRPa表达更容易激活肥大细胞脱颗粒反应。(图3g)2)高低不同SIRPa表达肥大细胞细胞因子表达分析。高表达SIRP α均能抑制肥大细胞 IL4、IL13 和 TNF α mRNA 水平。(图 3c，d. e)；3)1 1^2!13及骨髓来源的肥大细胞检测结果证明，511^0表达能够抑制IgE诱导的 p-p38、p-JNK, p-ERK 水平(图 4a，b)。4)应用RBL2H3细胞系检测证实SIRP α抑制AKT激活水平(图如，d)。本发明有希望用于预防和治疗过敏反应性疾病。因为肥大细胞是一种多功能效应细胞，其作用涉及天然免疫、获得性免疫及非免疫领域。肥大细胞不仅可以通过脱颗粒释放蛋白酶等杀伤病原体，还可分泌包括细胞因子、趋化因子等在内的近百种分子物质，并辅助特异免疫应答，更重要的是它是引起超敏反应的重要免疫细胞，所以对其功能的调节显得尤为重要(KalesnikoffJ, Galli SJ. New developments in mast cell biology. Nat Immunol. 2008Nov ；9(11) :1215-23.)。炎性因子和IgE-Ag是最有效刺激肥大细胞活化的因子，且多种炎性信号途径和Fc RI受体途径也研究得较为深入和明了，尤其多种炎性因子诱导的酪氨酸磷酸化及经MAPKs的活化途径已被证实(Hidemi Teramoto, Patrick Salem, Tyrosine Phosphorylation of the vav Proto—oncogene Product Links FceRI to the Racl-JNK Pathway. J Biol Chem. 1997April ；272(16) 10751-55.)。本发明提供的信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用，通过慢病毒干预肥大细胞SIRPa水平来预防和治疗过敏性疾病。本发明为临床基于SIRP α的过敏反应性疾病预防和治疗提供了新的思路。
图1 :SIRPa干扰、过表达质粒构建及效果鉴定。其中a是分离培养肥大细胞经设计干扰SIRPa鉴定图；b是构建干扰质粒 pSUPER-sirpa鉴定图；c是克隆SIRP α表达质粒鉴定图。图2 分离培养肥大细胞流式细胞仪鉴定。其中a是鉴定培养细胞表达了肥大细胞标志分子FceRI ；b是鉴定培养细胞表达了肥大细胞标志分子c-kit。图3 过表达SIRP α抑制肥大细胞脱颗粒或干扰SIRP α促进肥大细胞脱颗粒反应；SIRP α过表达抑制IgE诱导细胞因子合成。其中a 在RBL2HB细胞中过表达SIRP α抑制肥大细胞脱颗粒反应；b 在骨髓来源的肥大细胞干扰SIRP α促进脱颗粒反应；c 过表达SIRP α抑制IgE诱导的IL-4合成；
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d 过表达SIRP α抑制IgE诱导的IL-13合成；e 过表达SIRP α抑制IgE诱导的TNF α合成。f 过表达SIRP α不抑制F-actin参与的细胞骨架聚合。g 过表达SIRP α抑制IgE诱导的Ca2+流动图4 =SIRP α表达抑制IgE诱导肥大细胞MAPKs激活和AKT活性。其中a 过表达SIRP α抑制IgE诱导肥大细胞MAI3Ks激活；b 干扰SIRP α促进IgE诱导肥大细胞MAI3Ks激活；c IgE剂量梯度诱导AKT激活；d =IgE刺激不同时间段诱导AKT激活。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1 基因克隆、干扰序列设计和质粒构建以及鉴定1. SIRPa表达质粒构建材料1) SIRP α表达载体pcDNA3. IA购自hvitrogen公司；干扰表达载体pSUPER购自 Oligoengine公司；用于瞬时转染的干扰片段由^witrogen合成。2)克隆引物为鼠源SIRP a mRNA开放阅读框起始和终止引物序列，委托上海生工合成。3)克隆过程使用限制性内切酶和T4连接酶购自NEB公司。4) 细胞系购自上海市中科院细胞所。5)转染试剂 PEI 购自 Polyplus-transfection SA 公司。6)鼠源cDNA文库利用反转录法构建(详见分子克隆第三版，889页)，兔抗鼠多克隆抗体SIRP α由本实验室自行制备。(参见Kharitonenkov A. A family of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 1997Marl3 ； 386(6621) :181-6.)。方法DSIRPa过表达载体构建、鉴定首先应用合成的引物F5'-ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCTGG-3‘ (SEQ ID NO 1) ；R 5 ‘ -CTTCCTCTGGACCTGGACACTA-3 ‘ (SEQ ID NO :2)。从鼠源 cDNA 文库克隆 SIRP α，经琼脂糖电泳回收PCR片段，同时表达载体和片段个经酶切后回收，在使用T4连接酶在常温下连接5min。产物经转化后挑取阳性克隆，小抽质粒后再经酶切鉴定，最后将鉴定正确的质粒送测序。2) SIRP α干扰质粒构建、鉴定以pSUPER(OligoEngine，Seattle, WA)为载体的含有干扰SIRP α片断的质粒自行构建(构建方法参见Oligoengine公司的产品说明书pSUPERVEC-PBS_0005/0006)，其干扰序列为AGTGAAGGTGACTCAGCCTG(SEQ ID NO 3)禾口AATCAGTGTCTGTTGCTGCTG(SEQ ID NO 4)；
预先设计的干扰SIRP α的磷硫酰基化修饰的StealthTM RNA购自hvitrogen 公司，其序列分别为SIRPa , DlO 5' -AA⑶GAAG⑶GACUCAGCCUGAGAA-3‘ (SEQ ID NO 5)；D12 5' -CAAAGCCGGCUGUUGAUCUACA⑶U-3‘ (SEQ ID NO 6)；3)构建过表达质粒、干扰质粒以及合成的SiRNA片段鉴定。PEI法质粒转染在M孔培养皿中接种适量细胞(500 μ 1 1640+10% FBQ，使之培养Mhr后汇合率达到70-80%，在不同1. 5ml离心管中分别加入50 μ 1生理盐水，分别 WAlyg质粒和2 μ 1 JetPEI并混勻，随即将PEI溶液加入DNA溶液，振荡混勻，室温放置 15-30min,将质粒DNA-脂质体复合物滴加至细胞表面，置5% C02,孵箱内培养Mhr裂解。 收取裂解液经蛋白定量后western blot检测目的蛋白水平。结果如图1所示，合成的干扰片段成功的抑制了细胞内SIRPa表达(图la)。利用构建的干扰质粒，经瞬时转染也显著的抑制了内源性SIRP α表达(图lb)。克隆的表达质粒也顺利表达出内源的SIRP α。(图lc)实施例2 肥大细胞分离培养及鉴定材料1) C57BL/6小鼠购自上海必凯动物公司。2)IL3、SCF购自ρ印rotech公司，DMEM培养基、培养用抗生素购自GIBCO公司。3)鉴定用FceRI和c_kit抗体购自eBioscience公司。方法6-8周大c57小鼠股骨骨髓用注射器冲出，放入DMEM培养基内培养4_8周。培养基内添加10% FBSUOng/ml IL3、20ng/ml SCF同时添加抗生素。培养的肥大细胞用流式细胞仪检测细胞表面FceRI和c-kit表达。结果如图2所示，培养细胞表达了肥大细胞标志分子FceRI (图2A)和c_kit (图2B)， 表达细胞纯度95%以上。实施例3 =SIRP α调节肥大细胞脱颗粒反应和细胞因子表达
材料1)肥大细胞细胞系、原代分离培养的肥大细胞(实施例2获得)2)设计合成的干扰片段、干扰质粒和过表达质粒(实施例1获得)3)细胞模型诱导肥大细胞激活脱颗粒所用IgE和抗原DNP-BSA购自SIGMA公司。4) F肌动蛋白特异性荧光探针Alexa Fluor 488phalloidin购自invitogen公司5)钙离子指示剂Fluo-3，AM购自invitogen公司。6) PCR检测试剂购自TAKARA公司，引物由上海生工合成。方法1)稳定细胞株的建立RBL2H3细胞(来自ATCC)传至6孔板内，信号调节蛋白表达质粒和对照质粒用PEI 转染，4 后加G418筛选克隆，经鉴定后扩增。2)肥大细胞脱颗粒检测。
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建立的稳定转染细胞系和原代培养的细胞经瞬时转染对SIRP α进行干扰。4 后加IgE孵育池，不同时间点(0,2h,5h,10h,20h)加抗原DNP，收取细胞。脱颗粒检测方法见相关 β-己糖激酶检测的文献(David A. ffindmiller. Distinct Phosphoinositide 3—Kinases Mediate Mast Cell Degranulation in Response to G-protein-coupled Versus Fc ε RI Receptors. J Biol Chem. 2003Apr4 ；278 (14) :11874- 。3)过表达和干扰SIRP α表达肥大细胞细胞因子表达分析不同高低表达SIRP α的肥大细胞经IgE-DNP刺激后，细胞抽取RNA经逆转录后行定量PCR检测IL4、IL13和TNF α mRNA水平。4)高低表达SIRP α肥大细胞细胞骨架蛋白F-actin聚合检测不同高低表达SIRP α的肥大细胞经IgE-DNP刺激后，使用Alexa Fluor 488phalloidin 染料染色。实验方法参考文献(ffai-Hang Leung and Silvia Bolland. The Inositol 5 「-Phosphatase SHIP-2Negatively Regulates IgE-Induced Mast Cell Degranulation and Cytokine Production. J IMMUNOL, 2007,179 :95-102.)4)高低表达SIRP α肥大细胞细胞钙离子流动检测不同高低表达SIRP α的肥大细胞经IgE刺激池后，加入Fluo_3，AM孵育，细胞重悬后，加入抗原DNP刺激，流式细胞仪检测钙离子变化的动态过程。结果2)高低不同SIRPa表达对肥大细胞脱颗粒反应调节作用。如图3a，b所示，RBL 细胞高表达SIRPa抑制细胞脱颗粒反应，而肥大细胞内干扰SIRP α表达更容易激活肥大细胞脱颗粒反应。3)高低不同SIRPa表达肥大细胞细胞因子表达分析。结果如图3c，d，e所示，高表达SIRP α均能抑制肥大细胞IL4、IL13和TNF α mRNA水平。4)高低表达SIRP α肥大细胞活化后F-actin检测。结果如图3f所示，高表达 SIRP α不抑制F-actin参与的细胞骨架聚合过程5)高低表达SIRP α肥大细胞活化后Ca2+流动检测。结果如图3g所示，高表达高表达SIRP α抑制Ca2+内流。实施例4 =SIRPa对调节肥大细胞激活反应的信号途径的调节作用。材料1)建立的稳定细胞系和原代培养的肥大细胞2)细胞模型诱导肥大细胞激活脱颗粒所用IgE和抗原DNP-BSA3)检测相关信号通路激活的抗体均购自Cell Signaling Technology公司4)Western blot相关检测试剂盒设备由本实验室提供。方法RBL2H3细胞系或骨髓来源的肥大细胞进行SIRP α干扰，经IgE和抗原DNP-BSA 处理一定时间或剂量，收取细胞裂解液，经western blot实验检测p-p38、ρ-JNK, p-ERK和 ρ-ΑΚΤ水平。结果1)RBL2H3及骨髓来源的肥大细胞检测结果证明，SIRP α表达能够抑制IgE诱导的 p-p38、p-JNK, p-ERK 水平(图 4a，b)。
2)应用RBL2H3细胞系检测证实SIRP α抑制AKT激活水平(图4c，d)。
权利要求
1.信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用，其特征在于用病毒作为载体构建过表达质粒，过表达SIRP α。
3.根据权利要求2所述的信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用，其特征在于其中的病毒是腺病毒或慢病毒。
全文摘要
本发明属于医学生物工程技术领域。信号调节蛋白α(SIRPα)是一个抑制性受体蛋白家族成员。在免疫调节方面的作用，有报道在树突状细胞(DC)，SIRPα可抑制LPS诱导的DC成熟并抑制成熟DC分泌IL-12，且DC表面SIRPα还可通过与其在T细胞上的配体CD47的作用双向负调节T细胞和DC的功能。目前尚无文献报道SIRPα在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。本发明的目的在于提供信号调节蛋白α的新用途。本发明克隆了SIRPα基因，构建了质粒，可以过表达或干扰SIRPα表达。本发明提供了信号调节蛋白α在制备预防和治疗过敏反应性疾病药物中的应用。
文档编号C12N15/861GK102430128SQ20111030380
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者潘宇飞, 王敏, 王红阳, 董立巍, 谈冶雄 申请人:中国人民解放军第二军医大学