专利名称：扩增青虾gih-a和青虾gih-b的引物组及其扩增方法
技术领域：
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及扩增青虾GIH基因的引物组及扩增方法。
背景技术：
青虾，学名日本沼虾(MacrobrachiUin nipponense)，隶属十足目(Decapoda)，长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于全国各地，是我国重要的淡水养殖虾类。近年来青虾出现了种质资源退化严重，规格小、性早熟等现象成为制约青虾养殖业可持续发展的关键问题。解决这些生产问题的关键在于对青虾的生长发育、繁殖、蜕皮等调控机理的掌握。已有研究表明，性腺抑制激素(Gonad-inhibting hormone, GIH)作为甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族神经肽的重要成员之一，在调控甲壳运物的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压等方面起着重要的作用。GIH在雌性个体中又称为卵黄发生抑制激素(vitellogensis inhibiting bormone，VIH)，其主要作用是抑制雌性虾蟹的卵黄发生作用。目前有关青虾的研究主要集中在生物学特性、核型分析、养殖技术、病害防治和营养饲料以及群体遗传学等方面，而关于青虾眼柄神经激素的克隆研究还尚未报道。在美洲鳌龙虾、欧洲鳌龙虾iBoimrus ^a—r^s)、挪威海螯虾、刀额新对虾、斑节对虾，罗氏沼虾、沿fflicaris Karrei和普通卷甲虫中已经克隆获得了 GIH cDNA序列。研究表明，已获得的GIH cDNA序列所编码的GIH前体均由一个信号肽和一个成熟肽组成，信号肽的长度为31aa、23aa、17aa、3^ia、;Maa不等，成熟肽的长度为78aa、79aa、81aa不等.沼虾和龙虾的GIH氨基酸序列比较相似性为45-59%，对虾和龙虾的相似性为46%，而对虾和沼虾的相似性为30%，这表明GIH在物种间的保守性差，这也是CHH家族肽普遍存在的情况，可能是由于与脊椎动物相比低等生物在进化的过程中变异较大造成的。因此，提供引物组用于扩增青虾GIH基因，对于研究青虾的蜕皮、变态发育、 生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制等方面，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供扩增青虾GIH基因的引物组及克隆方法。利用本发明提供的引物组从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，对研究青虾蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制提供参考，为青虾良种繁育积累背景资料。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案
本发明提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的引物组，其由如下引物组成 引物组1:
4正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。本发明还提供了扩增Gene Bank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的引物组，其由如下引物组成
引物组1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的方法，包括如下步骤
步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；
步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2 由如下引物组成
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；
步骤5 将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的方法，包括如下步骤
步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
步骤5 将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。本发明以青虾眼柄为材料，分离了青虾GIH的全长cDNA序列，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3，-RACE)以及 5，端cDNA快速扩增(5，-RACE)的方法，对青虾GIH-A和GIH-B基因进行了研究，首次从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，并对其所编码的神经肽的序列特征、同源性、 进化地位进行了分析，为进一步研究青虾GIH基因的表达、调控奠定了基础，对研究青虾蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制提供参考，为青虾良种繁育积累背景资料，同时也为甲壳动物整个CHH家族的功能和进化研究提供了新的材料。
图1为青虾GIH-A和GIH-B的氨基酸序列与其它CHH家族神经肽的比对，其中“ |，，表示信号肽的切割位点；
““，，表示CHH前体相关肽的位置。 图2为甲壳动物CHH家族激素前体的NJ系统进化树。
具体实施例方式本发明公开了扩增青虾GIH基因的引物组及克隆方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的引物组， 其由如下引物组成
引物组1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。本发明还提供了扩增Gene Bank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的引物组，其由如下引物组成
引物组1:
正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的方法，包括如下步骤
步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；
步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2 由如下引物组成
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；
步骤5 将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的方法，包括如下步骤
步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；
步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
步骤5 将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。使用ClustalWl. 83将GIH-A和GIH-B的cDNA序列全长以及所编码的氨基酸进行比对，青虾GIH-A和GIH-B的cDNA序列全长以及所编码的氨基酸长度等均不相同(见表 1)。信号肽长度相差2个氨基酸，序列差异大，前体相似性为56%，成熟肽相似性为69%。 使用ClustalWl. 83将GIH-A和GIH-B氨基酸序列与已公布的部分虾蟹类CHH家族氨基酸序列进行了比对。前体的比对(不包括CHH的CPRP)结果如图1。结果显示，青虾GIH-A与罗氏沼虾SGP-A最相似(99% )，青虾GIH-B与罗氏沼虾的SGP-B最相似(94% )，都比青虾 GIH-A和GIH-B之间相似性(69% )高，总体而言青虾GIH-A与其它物种II型肽(GIH、MIH、 Μ0ΙΗ)的相似性要比青虾GIH-B与其它物种II型肽(GIH、ΜΙΗ、Μ0ΙΗ)的相似性高一些。通过对青虾中获得的该基因的序列与其它物种GIH序列利用DNAstar软件对GIH 进行alignment分析和使用MEGA 4构建NJ系统发育树(如图2)，由系统发育树可见，甲壳动物CHH家族分为两组，分别是虾蟹类的CHH和虾蟹类的GIH、MIH、MOIH这两组，这与CHH 家族结构的分型一致(I型和II型)。沼虾的II型肽与海螯虾的II型肽亲缘关系最近，其次与蟹的II型肽亲缘关系较近，与对虾II型肽亲缘关系较远，与鳌虾II型肽亲缘关系最远。本发明中青虾由太湖无锡湖区渔民提供，试剂均可由市场够得，纯化及cDNA第一链合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)。下面结合实施例，进一步阐述本发明 实施例1
总RNA提取逐个取青虾眼柄，去色素后迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，共取六个眼柄约30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；总RNA的提取使用上海博星生物公司的 Unizol RNA提取试剂结合RNeasy Mini Kit法进行，提取方法参照使用说明书。cDNA第一链合成据上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成试剂盒说明书进行。青虾GIH cDNA片段克隆
根据已获得的GIH cDNA序列(美洲鳌龙虾你fflarm afflerica/HAs，X87192 ；欧洲鳌龙 If Homarus ga/marus ,OQ181793 ；挪威海螯虫下 Afe^Aro/ ^· norvegicus, AF16 3 7 71 ’ Rimi car is kairei，FJ447500 ；罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii，AF432346)的编码区进行比对， 依据比对结果，在保守区域设计引物，用于PCR扩增，得到青虾GIH-A和GIH-B基因片段；正向引物
FZl 5' - GGBffTCTCTGYHCAGAGAGT -3' FZ2 5' - CGAATGCCCHGGBGTVATGG -3' 反向引物
RZ 5' - TAGACRCACCACAGGAARTC -3' PCR扩增反应体系如下
权利要求
1.扩增GeneBank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成引物组1:正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2 正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。
2.扩增GeneBank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成引物组1 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 引物组2 正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。
3.一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325. 1的青虾GIH-A基因的方法，其特征在于， 包括如下步骤步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2 由如下引物组成正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示； 反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示；步骤5 将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
5.一种扩增Gene Bank登录号为HQ7243^. 1的青虾GIH-B基因的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1 获得青虾眼柄总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；步骤3 用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成 正向引物FZl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；步骤4 用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；步骤5 将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
全文摘要
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及扩增青虾性腺抑制激素(Gonad-inhibtinghormone，GIH)基因的引物组及克隆方法。利用本发明提供的引物组从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，为青虾蜕皮、生殖、变态发育、血糖平衡以及体内渗透压的调控机制研究提供理论基础，为青虾良种繁育积累背景资料。
文档编号C12N15/10GK102433328SQ20111030379
公开日2012年5月2日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者乔慧, 傅洪拓, 吴滟, 王宁 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心