专利名称：特异性bFGF结合肽的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程领域，具体而言，本发明涉及特异性的bFGF结合肽，可用于结合bFGF而不影响其他类型的FGF，从而用于预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病。
背景技术：
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)属于成纤维细胞生长因子家族，是存在于细胞质中的血管生成因子，其通过自分泌或旁分泌方式参与肿瘤间质血管生成的调节，促进细胞迁移、有丝分裂和增殖，因此在肿瘤的发生、发展中都起着非常重大的影响。当前，bFGF的致病机理比较明确，其刺激内皮细胞分泌尿激酶型血浆素原激活剂(uPA)和胶原酶，降 解基膜和细胞外基质周围的蛋白质，使血管内皮细胞从基膜中脱离出来，向肿瘤区迁移、分裂、增殖，形成新的内皮细胞束，最终形成毛细血管。由于新生毛细血管壁缺乏平滑肌支持，血管壁薄，易通透，因此为肿瘤的转移提供了良好的条件。另外，bFGF还能够促进内皮细胞增殖分化并促使其向血管生成素的源头移动，这也在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。(参见bFGF、C0X-2研究进展及与胃癌的关系.国际消化病杂志，2009年，29 (6) :409 ；bFGF基因与头颈部肿瘤.现代肿瘤医学，2007年，15 (7) :1017，等)为此，人们寻求抑制bFGF的试剂来治疗由其过量而导致的疾病。例如，中国专利申请第200510051166号公开了利用反义核酸载体来阻止bFGF的翻译和表达，抑制由于bFGF过量而导致的肿瘤细胞的生长；又如，中国专利申请第200710028509公开了抗bFGF的抗体，用于诊断和治疗由于bFGF过量而导致的肿瘤以及肾、肝或肺等纤维化病变等。然而，本发明人在技术推广中发现，成纤维细胞生长因子家族的成员(例如，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)等)同源性程度较高，反义核酸和抗体的靶位片段容易位于同源的成员中，造成交叉反应，而不同的成纤维细胞生长因子家族成员所执行的生理功能有较大差异，这样的交叉反应会导致在预防或治疗由过量bFGF而导致的疾病时产生影响其他正常生理过程的副作用，导致了这些试剂难以在实践中推广，甚至难以被允许运用于临床。本发明人根据长期研究和实践经验，成功地设计出了新的bFGF结合肽，其具有特异性的bFGF结合活性，尤其是该结合肽具有结合bFGF的能力而同时没有与aFGF和FGF21的结合活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了新的bFGF结合肽，其具有结合bFGF的能力而同时没有与aFGF和FGF21的结合活性。另外，本发明还提供了该bFGF结合肽的编码核酸、载体、细胞、制备方法以及应用等。在第一个方面，本发明提供了 bFGF结合肽，其为蛋白质，其特征在于，(I)其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；
(2)其是在(I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而得的蛋白质，而且该蛋白质具有bFGF结合的活性。优选其中，bFGF结合活性是特异性的，即能够结合bFGF而同时没有与aFGF和FGF21的结合活性。在本发明的具体实施方式
中，本发明的bFGF结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2或4所示。常见的可以缺失或添加一个或几个氨基酸的部分包括纯化标签(如His-tag)、N端的Met、N端的信号肽等，这些都是本领域技术人员所熟知的。当在原核生物中表达，蛋白N端一般需要有编码Met的核苷酸序列；为了在真核生物中分泌表达，蛋白N端通常需要有信号肽。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南(第三版)》(北京科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。也优选在本发明的第一方面中，取代、缺失或添加的一个或几个氨基酸是一个至五个氨基酸，更优选是一个至三个氨基酸。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸。例如，侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。优选在本发明的第一方面中，bFGF结合肽可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它们可以延长融合蛋白的体内代谢时间，加速生物体对融合蛋白的吸收，增强融合蛋白的稳定性等。本发明的bFGF结合肽可以是糖基化的、也可以是非糖基化的，优选是糖基化的，尤其是哺乳动物细胞糖基化的，这样接近于人的糖基化模式，更适于在人体应用。在第二个方面，本发明提供了编码本发明第一个方面所述的bFGF结合肽的核酸。 本发明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括重组的DNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、DNA重组技术或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。事实上，根据设计的多核苷酸序列，当前已经能够通过商业渠道规范地制备出相应的DNA。一旦获得核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。在本发明的具体实施方式
中，本发明的核酸的多核苷酸序列如SEQ ID No. I或3所示。在第三个方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His, Leu, Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在本发明的具体实施方式
中，本发明的载体是pcDNA，其适合在哺乳动物细胞中表达。在第四个方面，本发明提供了细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体，或者所述细胞转化或转染有本发明第二个方面所述的核酸。本发明的细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。本领域技术人员熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法、原生质体融合法、脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。令人惊讶的是，本发明人从当前天文数字般的宿主细胞中发现了鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的bFGF结合肽，由此无需破碎细胞即可利用相对杂质成分较少的培养上清液直接进行纯化。因此，本发明优选所述细胞是转化或转染有本发明第二个方面所述的核酸的鼠骨髓瘤细胞，尤其是NSO细胞。在第五个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的bFGF结合肽的制备方法， 其包括以下步骤用本发明第四个方面所述的细胞表达本发明第一个方面所述的bFGF结合肽，并分离所述的bFGF结合肽。表达本发明第一个方面所述的bFGF结合肽的细胞可以通过常规方法培养和/或诱导来表达所需要的bFGF结合肽。表达的bFGF结合肽可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。分离(纯化)的方法包括但不限于裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及变性、复性处理等。由于鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的bFGF结合肽，因此优选直接将细胞表达的培养上清液用以分离。优选在本发明的第五个方面中，分离过程包括，将细胞表达的培养上清液依次用Protein A亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析和Q-sepharose层析纯化。在第六个方面，本发明提供了用于预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的bFGF结合肽以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物能预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病，例如由于bFGF过量而导致的肿瘤等。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、或喷雾剂型。在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的bFGF结合肽在制备用于预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病(如，由于bFGF过量而导致的肿瘤)的药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明的bFGF结合肽具有特异性的bFGF结合活性，能够结合bFGF而同时没有与aFGF和FGF21的结合活性，避免了在结合bFGF的时候产生影响aFGF或FGF21的副作用；本发明的bFGF结合肽可以利用特定的哺乳动物细胞分泌表达，在糖基化谱接近于人类的同时，更方便了后期的纯化。为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图I显示了氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质在转化的鼠骨髓瘤细胞中分泌表达的情况。图2显示了氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的蛋白质在转化的鼠骨髓瘤细胞中分泌表达的情况。图3显示了本发明的蛋白质的SDS-PAGE检测图谱，其中，泳道1、4为氨基酸序列如SEQ ID NO 4所不的蛋白质；泳道2、5为氣基酸序列如SEQ ID NO 2所不的蛋白质；泳 道1、2为在还原状态下进行SDS-PAGE ;泳道4、5为在非还原状态下进行SDS-PAGE ;泳道3为分子量标记。图4显示了本发明的蛋白质与aFGF、bFGF和FGF21的结合活性，其中，每栏中左柱表示氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白质参与的测试，右柱表示氨基酸序列如SEQIDNO 4所示的蛋白质参与的测试。图5说明了 bFGF结合肽抑制神经胶质瘤细胞的生长作用。如图数据，显示了本发明的蛋白质抑制lng/ml外源性bFGF诱导的人神经胶质瘤细胞的生长活性，其中，每栏左柱表示lng/ml bFGF诱导的人神经胶质瘤细胞在0D570nm/630nm处的光吸收值，中间柱表示氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质参与的测试，右柱表示氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质参与的测试。图6说明了 bFGF结合肽(FGFRl_Fc)抑制非小细胞肺癌细胞的增殖作用。如图数据显示了本发明的蛋白质抑制lng/ml外源性bFGF诱导的人非小细胞肺癌细胞的生长活性，其中，每栏左柱表示lng/ml bFGF诱导的人非小细胞肺癌细胞在0D570nm/630nm处的光吸收值，中间柱表示氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质参与的测试，右柱表示氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的蛋白质参与的测试。
具体实施例方式本发明将通过具体的实施例来进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，北京)等实验手册以及市售的试剂和试剂盒的使用说明。实施例I本发明的特异性bFGF结合肽的设计我们设计了氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白质，并根据我们研究得到的鼠骨髓瘤细胞密码子表达频率优化出了编码该蛋白质的基因，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示，根据常规的PCR法分段拼接出多核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示的DNA，并克隆入pcDNA质粒(可购自Invitrogen公司)中以形成pcDNA/23c质粒,转化大肠杆菌(E. Coli)XL-I。抽提出pcDNA/23c质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示的DNA，其在理论上能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质。另外，我们设计了氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的蛋白质，并根据我们研究得到的鼠骨髓瘤细胞密码子表达频率优化出了编码该蛋白质的基因，其多核苷酸序列如SEQIDNO 3所示，根据常规的PCR法分段拼接出多核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的DNA，并克隆入pcDNA质粒(可购自Invitrogen公司)中以形成pcDNA/lc质粒，转化大肠杆菌(E. Coli)XL-I0抽提出pcDNA/lc质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的DNA，其在理论上能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质。以上质粒均返回给我们进行下一步实验。实施例2本发明的特异性bFGF结合肽的表达和纯化以上两个质粒分别按照常规的电转化方法转染入鼠骨髓瘤细胞系NSO (可购自上海爱丁堡生物科技发展有限公司)中进行分泌表达。简而言之，pcDNA/23c和pcDNA/lc质粒各取40yg，用限制性内切酶Sal I.分别酶切以线性化，冰浴备用。在37°C、5%C02的条件下，将NSO细胞培养于Hybridoma Serum Free Medium(HSFM)培 养基上(可购自Life Technologies (Grand Island,美国))，当达到指数生长期并且存活率大于90%时，用冰冷的PBS(pH7. 2)洗涤后重悬于PBS (pH7. 2)中(浓度为IxlO7个细胞/ml)，然后用Gene Pulser电转化仪分别转化线性化的pcDNA/lc和pcDNA/23c质粒(电转化参数为1500伏，3 μ Fd)。冰浴5分钟后，加入HSFM培养基于37°C培养，然后转移入添加了 5 μ g/mlBlasticidin)的HSFM培养基中培养约3_4周，直至出现显著的细胞死亡情况并且存活的细胞呈离散状，得到分别转染了 pcDNA/23c和pcDNA/lc质粒的阳性转染细胞及其培养物。吸取两种细胞不同培养阶段的培养基上清液，分别根据ELISA检测其中氨基酸序列如SEQ ID NO :2和4所不的蛋白质的表达量。根据厂商说明，利用CalTagLaboratories (South SanFrancisco,美国)ELISA检测试剂进行检测，在微平板读数仪(Bio-Tek)上读取OD4ci5,计算所得蛋白质的表达量。结果如图1、2所示,这两种蛋白质都够被鼠骨髓瘤细胞分泌表达，而且表达量均能超过100mg/L的较高表达水平。)分别取3L两种细胞培养平台期的上清液，上样于用PBS(pH7. 2)平衡的ProteinA亲和层析柱(可购自GE Healthcare公司)，然后用5倍柱体积的PBS (pH7. 2)洗，均弃去流出液。然后用3倍柱体积的O. IM乙酸缓冲液(pH3. O)洗脱蛋白，收集洗脱液并加入2MTris以中和pH至5. 5。然后,将中和的洗脱液以4mL/min的流速上样于SP-Sepharose离子交换层析柱(可购自GE Healthcare公司)，用O. 05M乙酸缓冲液(pH5. 5)洗，弃去流出液。然后用含O. 15M NaCl的磷酸缓冲液(pH7. 4)洗脱蛋白，用分光光度仪检测流出液，当OD28tl超过O. 2开始持续收集，直至OD28tl重新回落到O. 4。将该洗脱液以4mL/min的流速上样于Q-sepharose层析柱(可购自GE Healthcare公司),用分光光度仪检测流出液,当OD28tl超过O. 2开始持续收集，直至OD28tl重新回落到O. 4。收集的流出液分别在还原条件下和非还原条件下进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :2、4所示的蛋白质都能够得到有效纯化，而且经纯化不改变二硫键等性质。实施例3本发明的bFGF结合肽的特异性结合测试本实验分别测试氨基酸序列如SEQ ID NO :2、4所示的蛋白质与aFGF、bFGF和FGF21的结合特异性。aFGF、bFGF和FGF21溶于PBS(pH7. 2)中(终浓度为I μ g/ml ;空白对照neg control用PBS代替)，分别取100 μ I加在96孔板上于4°C包被过夜。用含0.1%Tween-20的PBS (pH7. 2)洗涤，弃洗涤液，取用l%BSA(pH7. 2)稀释至I μ g/ml浓度的由实施例2获得的氨基酸序列如SEQ ID NO :2和4所示的蛋白质，梯度稀释，之后分别向平板上的各个孔加入100 μ I各稀释度的蛋白质，于室温孵育I小时。平板用含O. 1% Tween-20的PBS洗涤三次，弃去洗涤液，然后加入100 μ 11 3000稀释度的与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG Fe单克隆抗体(CalTag Laboratories),于室温孵育I小时。然后平板用含0.1%Tween-20 的 PBS 洗漆三次，加入显色底物(2, 2，-azino_bis (3-ethylbenz-thiazoline-6_sulfonic acid) diammonium salt (ABTS))溶液。15 分钟后，在微平板读数仪(Bio-Tek)上读取OD4tl5,结果如图4所示，本发明的蛋白质具有结合bFGF的能力而同时没有与aFGF和FGF21的结合活性，表明本发明的蛋白质具有特异性的bFGF结合活性。实施例4本发明的bFGF结合肽抑制bFGF诱导的人神经胶质瘤细胞(人非小细胞 肺癌细胞)增殖测试人神经胶质瘤细胞(非小细胞肺癌细胞)用含10%小牛血清的DMEM完全培养液于37°C、5%二氧化碳培养，待细胞融合度达80%，消化收集细胞，用完全培养液稀释细胞至浓度为每Iml含I. OX IO5个细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μ I。37°C、5%二氧化碳培养，24小时后换成含O. 4%小牛血清的DMEM维持培养液，37°C、5%二氧化碳培养24小时，弃去维持培养液，加入含lng/ml bFGF维持培养液，每孔100 μ I。96孔细胞板2、3列做为bFGF阳性增殖对照，4，5列起始孔加入100 μ IbFGF结合肽蛋白(SEQ ID NO 2)，6，7列起始孔加入100 μ IbFGF结合肽蛋白(SEQ ID NO 4)，4-7列依次二倍梯度稀释，共6个稀释度。37°C、5%二氧化碳培养48小时。每孔加入組1'溶液25111，371、5%二氧化碳培养5小时。弃去培养板中的液体，向每孔加入二甲基亚砜150ul，混匀后，放入酶标仪，以630为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
权利要求
1.bFGF结合肽，其为蛋白质，其特征在于， (1)其氨基酸序列如SEQID NO 2所示； (2)其是在(I)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而得的蛋白质，而且该蛋白质具有bFGF结合的活性。
2.权利要求I所述的bFGF结合肽，其中所述的bFGF结合活性是特异性的。
3.编码权利要求I或2所述的bFGF结合肽的核酸。
4.权利要求3所述的核酸，其多核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
5.载体，其含有权利要求3或4所述的核酸。
6.细胞,其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的载体,或者所述细胞转化或转染有权利要求3或4所述的核酸。
7.权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞是转化或转染有权利要求3或4所述的核酸的鼠骨髓瘤细胞。
8.权利要求I或2所述的bFGF结合肽的制备方法，其包括，用权利要求6或7所述的细胞表达权利要求I或2所述的的bFGF结合肽，并分离所述的的bFGF结合肽。
9.权利要求8所述的制备方法，其中所述的分离包括，将细胞表达的培养上清液依次用ProteinA亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析和Q-sepharose层析纯化。
10.权利要求I或2所述的bFGF结合肽在制备用于预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病(如，由于bFGF过量而导致的肿瘤)的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了特异性的bFGF结合肽，其为氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的蛋白质及其变体，可用于结合bFGF而不影响其他类型的FGF。该特异性的bFGF结合肽可用于预防或治疗由于过量的碱性成纤维细胞生长因子而导致的疾病。
文档编号C12N15/63GK102796180SQ20111030337
公开日2012年11月28日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者李校堃, 王晓杰, 胡培生 申请人:李校堃, 王晓杰, 胡培生