融合酸性嗜热α-淀粉酶基因和融合酸性嗜热α-淀粉酶、制备及应用的制作方法

专利名称：融合酸性嗜热α-淀粉酶基因和融合酸性嗜热α-淀粉酶、制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种融合酸性嗜热α-淀粉酶基因、生产融合酸性嗜热α-淀粉酶的工程菌(大肠埃希氏菌Escherichia coli)JDA001、利用该基因工程菌发酵生产的融合酸性嗜热α-淀粉酶及该淀粉酶在淀粉深加工中的应用。
背景技术：
淀粉酶(amylase)，是能够降解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照水解方式的不同，主要分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。α-淀粉酶家族包括了水解酶和转移酶，根据序列的相似性，又被划分为13、70、 77三个亚家族，其成员都是多结构域蛋白，具有结构和催化机制上的很多相似性，如都有一个(α/β)8-ΤΙΜ桶型的催化结构域，而活性位点处于桶型β片层的C末端。它们都具有相同的催化残基一个Glu(E)和两个Arg(D)，这三个催化残基和另外两个与维持过渡态稳定的His(H) —起存在于蛋白一级结构的四个保守序列中，贯穿于整个α-淀粉酶家族。虽然α-淀粉酶家族中其成员共享有一些相似的结构和性质，通过对其底物结合位点和整体结构的分析，发现至少二十多种不同酶具有各自的特性，对底物作用位点存在细微差别，包括专一识别α-1，4糖苷键的酶有α-淀粉酶、CGTase、 4- α -Glucanotransferases ；专一识另U α _1，6 糖苷键的酶有 isoamylase 禾口 oligo-1, 6-glucosidase ；可以同时作用于α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键的酶，如分支酶 SBE-II、Neopullulanases、Cyclomaltodextrinases ；除此之夕卜，还发现有可以在非还原端移动α-连接的α-Glucosidases以及作用于蔗糖而生成多聚糖的转移酶性质的 amyIosucrase ο在过去30年中，α _淀粉酶被广泛应用于淀粉加工业的各个方面，根据其热稳定性和最适反应温度，α -淀粉酶被分为耐高温α _淀粉酶、中温耐热型α -淀粉酶、非耐热型 α-淀粉酶和低温α-淀粉酶。耐高温α-淀粉酶在工业中有广泛的应用，可以替代化学的酸法水解淀粉，降低对设备的要求，减少环境污染；在啤酒工业、果汁生产、柠檬酸生产、纺织工业和味精工业等人类生活密切相关的化工行业，α -淀粉酶都能够发挥其特殊的作用。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，国内外对淀粉酶基因的克隆和改造研究很活跃，已有多种微生物淀粉酶基因得到克隆和表达，促进了淀粉酶的生物特性及相关功能的研究。自然界中存在着筛选耐高温α-淀粉酶的宝库，丰富的微生物资源，特别是耐热或嗜热古菌是其最重要的来源。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高和底物专一性强，而且酶的稳定性极好。因而它可以克服中温酶(mesophilic enzyme, 20-55°C )及低温酶(psychrophilic enzyme, -2-20°C )在应用过程中常常出现的生物学性质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应过程得以实现，这将极大地促进生物技术产业的发展，从而带动技术水平和生活质量的提高。目前工业上大规模使用的耐热淀粉酶大部分来自芽孢杆菌，其最适pH为6. O左右，而液化完成后进行糖化时所用糖化酶的最适pH为4. 5，需要进行pH值的调整。这不但增加了生产成本，而且造成后续处理设备的增加等问题。酸性α-淀粉酶能在低酸性条件(pH 4.0-5.0)下能水解淀粉，可直接用于淀粉的深加工、白酒酿造及饲料工业。因此，开发耐酸性的α-淀粉酶具有很大的经济、社会和环境效
■、Λ
frff. ο分离于B印pu Hot springs(别府温泉)的嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain7T(JCM 10545)隶属于古菌中的泉古菌门(Crenarchaea)硫化叶菌属(Sulfolobus) (Suzuki T，Iwasaki T，Uzawa T，et al. Sulfolobus tokodaii sp. nov. (f. Sulfolobus sp. strain 7)，a new member of the genus Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan. Extremophiles. 2002,6(1) :39_44·)。其最适生长条件是 pH = 2-3， 75-80°C ο Sulfolobus Tokodaii strain 7T(JCM 10545)全基因组序列已于 2001 年完成 (Kawarabayasi Y，Hino Y，Horikawa H,et al. Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon，Sulfolobus tokodaii strain7. DNA Res. 2001,8(4) 123-40.)，含有多个淀粉酶基因，是理想的酸性嗜热α -淀粉酶基因的来源菌。

发明内容
本发明的目的之一是利用重叠延伸PCR方法获得一种融合酸性嗜热α _淀粉酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明的另一目的是利用上述融合酸性嗜热α -淀粉酶基因通过基因工程技术构建一种生产融合酸性嗜热α-淀粉酶的工程菌，其特征在于该基因工程菌携带的质粒中包含表达融合酸性嗜热α-淀粉酶基因，宿主为大肠杆菌菌株Transetta (DE3)。工程菌名称为JDA001，于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(100101，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为 CGMCC No. 4486。分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；本发明的再一个目的是利用上述融合酸性嗜热α -淀粉酶工程菌制备一种稳定性好、耐热性强、在酸性条件下具有高催化效率的酸性嗜热α “淀粉酶；本发明的最后一个目的是通过对酸性嗜热α-淀粉酶的理化性质的研究，提供酸性嗜热α “淀粉酶在淀粉加工业中的用途，包括在麦芽糖和潘糖生产中的用途。本发明涉及的融合酸性嗜热α -淀粉酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列或与其至少同源95 %的序列。本发明所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶，其氨基酸序列是SEQ ID Ν0. 2所示的序列或与其至少同源95 %的序列。嗜热酸古菌 Sulfolobus Tokodaii strain 7T 来源于 kppu Hot springs (别府温泉)，最适生长条件是pH 2-3, 75-800C ο Sulfolobus Tokodaii strain 7T必须在含有硫元素的自养培养基中才能生长，在培养基的碳源逐渐减少的情况下生长缓慢，这说明它是专性需氧、兼性化学异氧的嗜热古菌。由于嗜热古菌生长周期长，人工培养困难，天然淀粉酶表达量低，因此不适宜作为天然酶的直接来源。而利用大肠杆菌异源表达能有效解决上述问题。我们从 NCBI 网站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索到了 Sulfolobus Tokodaii strain 7T基因组中有多个淀粉酶基因，我们选择了其中的两个淀粉酶基因 ST0926和ST0927作为研究对象。
对嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T通过培养、提取基因组、PCR扩增目的基因、重组质粒构建、转化宿主细胞得到表达ST0926和ST0927的工程菌，但两个蛋白在体外都没有活性。于是，我们对来自嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T中两个α -淀粉酶基因ST0926和ST0927进行了氨基酸序列分析，并与已有晶体结构的来自Salmonella
Typhimurium 的 α -淀粉酶-STAA(PDB :3Μ07)及来自 Sulfolobus Solfataricus 的
α -淀粉酶——SSGT (PDB :1ΕΗ9)进行BLAST比对预测和分析，结果见图1，发现ST0926和 ST0927的氨基酸序列的肽链长度比α -淀粉酶STAA和SSGT的小很多，不可能形成完整的蛋白三维结构而成为独立的α -淀粉酶。与已得出晶体结构的α -淀粉酶SSGT(PDB :1ΕΗ9) 作为模板序列进行序列相似性比对时发现ST0926和ST0927分别与模板序列的前后部分对应，相似性在60%以上，只是ST0926和ST0927全蛋白的拼接得到的模拟结构比模板序列多出一段小的loop环。而在Sulfolobus Tokodaii strain 7T基因组序列中，ST0926和 ST0927基因并非各自独立存在，其ORF表现出小部分的重叠。于是，我们将ST0926的重叠部分序列切去，与ST0927连接成为融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27，将融合蛋白再次与 α -淀粉酶STAA(PDB :3Μ07)及SSGT(PDB :1ΕΗ9)进行多重比对，结果见图2。融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27与两个模板序列具有60%的相似性，并且其蛋白序列中包含了与 α -淀粉酶家族相符的四段保守序列XDXXXNH(第185-191位的LDVVYNH)，GXRXDXXZZ (第 247-255 位的 GLRLDAVHA)，XXX (G/A) EZZZ (第 278-285 位的 FVIAESDL)，XXBBHD (第 369-374 位的YIQNHD)，其中X表示疏水性氨基酸，Z表示对专一性起作用的氨基酸。由于拼接位点选择的不同，可以得到不同的融合基因，所以本专利所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶基因， 其核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列或与其至少同源95%的序列；本专利所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶，其氨基酸序列SEQ ID NO. 2所示序列或至少同源95%的序列。我们将来自嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T的嗜热α-淀粉酶 ST0926和ST0927进行了分别克隆，采用重叠延伸PCR方法进行了基因拼接，获得了本发明所述的融合酸性嗜热α “淀粉酶ST0926-27，我们委托上海生工生物工程有限公司进行基因测序，测序结果见图5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。将本发明的融合酸性嗜热α -淀粉酶基因克隆到pET15b表达载体上，然后转入到大肠杆菌菌株Transetta(DE3)宿主中，得到了一株工程菌(JDAOOl)。该工程菌菌株已于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 4486。分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。如本发明提供的CGMCC No. 4486菌株的特征如下1.菌体形态特征菌体为两端钝圆的短小杆菌，革兰氏染色阴性，无芽孢。2.培养特征菌落为圆形半透明，有明显突起，边缘整齐。液体培养可以在普通摇床中进行，发酵液浑浊。3.菌株培养条件平板培养需在培养箱中进行，液体培养可以在普通摇床中进行，最适生长温度37°C，最适pH 7.0,培养基中加入100ug/mL的氨苄青霉素和30ug/mL的氯霉素。融合酸性嗜热α “淀粉酶的诱导条件为37°C振荡培养至0D600约为0. 8时，加人异丙基_ β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0. 5mM, 20°C、IOOrpm振荡培养过夜。4.培养基
5
培养基为LB固体培养基(1L的培养基中含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl IOg, 琼脂粉15g)和LB液体培养基(配方同LB固体培养基，不含琼脂粉)。工程菌表达产物是细胞内可溶性蛋白，通过超声破碎、加热使大肠杆菌杂蛋白失活，经亲和层析即可分离得到融合酸性嗜热α-淀粉酶蛋白。应用上述工程菌JDA001表达的融合酸性嗜热α _淀粉酶经活性实验鉴定具有水解淀粉活性(如图11所示)，其最适反应温度为70°c (如图7所示)；该酶即为本发明所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，它具有普通淀粉酶所不具备的优点，最适PH为5.0(如图9所示)，在60-80°C (如图8所示)，pH 4_6 (如图10所示)之间酶具有很高的反应活性，而且有很强的耐高温的能力；运用到生产中，有对反应器冷却系统要求低、储运成本低和加快动力学反应等优点。该重组酶能催化淀粉水解生成葡萄糖、麦芽糖和潘糖，在淀粉深加工领域有重要的应用潜力。本发明的融合酸性嗜热α -淀粉酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，不限定特定的表达载体，优选的表达载体采用原核表达载体，进一步优选的为PET 15b。上述重组表达载体可按生物学常规方法导入合适的宿主细胞。本发明不限定特定的宿主细胞，只要能表达所述重组表达载体。本发明优选使用Transetta(DE3)菌株。以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版， 科学出版社，2002年)。本发明所述的嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T (JCM 10545)、大肠杆菌Transetta (DE3)及表达载体均为生物技术普通技术人员公用的原料，可以从多种渠道获得。本发明所述的嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T (JCM 10545)是一种已知菌禾中，购自日本 Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center。本发明中用到的原核表达载体pET15b，pET28a和pET28b是本技术领域人员常用载体，其可购自美国Novagen公司，该公司的网址是http://www. novagen. com,网站上有 pET15b，pET28a和pET28b载体的性能、价格和操作等信息，文献折潇等，定向基因传递载体pET15b-Z-VPl的构建，西安交通大学学报(医学版)，2010，31 (3) :302_305 ；陶站华等， TAT-凋亡素融合蛋白的表达及其抗肿瘤活性，中国生物化学与分子生物学报，2006，22 (7) 525-542 ；赵英杰等，长白猪Y2干扰素基因的原核表达与分析，中国兽医科学，2006， 36(01) :46-51.所用载体即是购自该公司。另外，因该载体使用普遍，也可由本领域内的研究人员从商业公司购买后培养储存并相互交换或赠予，文献陈晨等，重组HIV表面抗原gpl20的表达纯化及免疫学鉴定，中国病毒学，2001，16(2) :109_113 ；黄学文等，可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达，检验医学，2007，22 (2) 146-149 ；林智敏等，水稻密码子优化的crylCa基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备，福建农业学报，2011，26(1) 24-28.所用载体即是通过赠予获得。本发明中使用的大肠杆菌Transetta(DE3)是一种在本领域普遍使用的宿主细胞，如文献(柴晓杰等，轮状病毒VP7基因的克隆与表达，生物技术通报，2011， 3 :160-162.)。该菌株购自北京全式金生物技术有限公司，该公司的网址是http:// transgen. com. cn，在该公司的主页上有该菌株的基因型信息，可以通过公司给定的联系方式购买，或通过该公司在国内各省市的代理公司购买。
本发明的目的是通过所构建的表达融合酸性嗜热α “淀粉酶的大肠杆菌表达体系，提供大量生产具有天然α-淀粉酶活性且稳定性好、耐热性强的融合酸性嗜热α-淀粉酶的方法，包括以下几个步骤(1)根据通过NCBI GenBank检索得到的来自泉古菌门嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T的嗜热α -淀粉酶基因ST0926和ST0927设计引物；培养嗜热酸古菌 Sulfolobus Tokodaii strain 7T，提取其基因组作为ST0926和ST0927的模板PCR扩增目的基因片段，并将其分别连接到质粒载体pET28a和pET28b上；(2)通过同源序列分析，找到ST0926和ST0927合适的拼接位点(ST0926第1到 198位氨基酸序列与ST0927多肽链融合构成ST0926-27融合蛋白，共557个氨基酸残基，分子量约61kDa)，设计拼接引物，通过重叠延伸PCR扩增得到酸性嗜热α _淀粉酶融合基因 ST0926-27 ；(3)将酸性嗜热α -淀粉酶融合基因ST0926-27连接到表达质粒载体pET15b上， 构建含有所述嗜热α“淀粉酶融合基因的质粒表达载体；(4)将所述质粒表达载体转入大肠杆菌Transetta (DE3)宿主细胞中，构建重组大肠杆菌JDAOOl ；(5)在所述的大肠杆菌表达系统中表达融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27 ；(6)分离纯化所述的融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27 ；(7)测定融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27的基本酶学性质。其中，所述步骤(1)中ST0926是通过BamHI和XhoI双酶切连入双酶切处理过的质粒载体pET28a，而ST0927是通过NdeI和XhoI双酶切连入双酶切处理过的质粒载体 pET28b。步骤(3)中，融合基因ST0926-27是通过NdeI和BamHI双酶切连入双酶切处理过的质粒载体pET15b。步骤(6)中，包括如下步骤a)将发酵液离心收集细胞，加入缓冲液超声破碎20min，7(TC热处理半小时， 12000rpm离心20min，收集到的上清即为粗酶液；b)将粗酶液经Ni-螯合层析分离，得到纯酶，洗脱液为含200mmol/L咪唑的 Tris-HCl缓冲液。通过本发明上述方法分离纯化得到的最终蛋白产品，其纯度达98%以上，在最适反应条件下，酶的比活力为274. 97U/mg。本发明的有益效果是(1)通过重叠延伸PCR扩增得到融合酸性嗜热α-淀粉酶基因ST0926-27，将其连入表达载体，在大肠杆菌中成功表达；(2)设计了简便的纯化工艺，获得高的回收效率和较好的纯化效果；(3)融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27具有较高的最适反应温度、热稳定性和较低的最适PH值，具有很好的工业应用前景。


图1 :ST0926和ST0927的序列同源性分析图谱，1EH9为来自Sulfolobus Solfataricus 的 α -淀粉酶 SSGT(PDB 1ΕΗ9), 3Μ07 为来自 Salmonella Typhimurium 的α-淀粉酶STAA (PDB :3Μ07)，其中黑色部分为相同的氨基酸，灰色为性质相似的氨基酸，方框内为ST0926和ST0927重叠氨基酸部分；图2 融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27的序列同源性分析图谱，1ΕΗ9为来自 Sulfolobus Solfataricus 的 α -淀粉酶 SSGT (PDB 1ΕΗ9)，3Μ07 为来自 Salmonella Typhimurium的α -淀粉酶STAA(PDB :3Μ07)，其中黑色部分为相同的氨基酸，灰色为性质相似的氨基酸；图3 :ST0926、ST0927和融合酸性嗜热α -淀粉酶基因ST0926-27的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中A为ST0926(621bp)、ST0927 (1080bp)的PCR产物电泳图谱， B 为 ST0926-27(1674bp)PCR 产物的电泳图谱，M =DNA 分子 Marker ；图4 重组表达载体pET15b-ST0926_27构建示意图；图5 融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27基因测序谱图，共测两个反应，进一步使用Chromas软件将图5(1)和图5(2)组装得到全长的融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27 基因(1674bp)；图6 融合酸性嗜热α -淀粉酶的SDS-PAGE电泳图谱，其中1 标准分子量蛋白标记；2 :PET15b在宿主菌中表达的空白对照；3 :PET15b-ST0926-27在宿主菌的表达；4 超声后的上清液在70°C热处理30min的样品；5 =Ni-NTA纯化后的样品。图7 融合酸性嗜热α -淀粉酶的温度_活力曲线；图8 融合酸性嗜热α -淀粉酶的温度稳定性曲线；图9 融合酸性嗜热α -淀粉酶的ρΗ-活力曲线；图10 融合酸性嗜热α -淀粉酶的ρΗ稳定性曲线；图11 融合酸性嗜热α-淀粉酶水解淀粉生成产物的薄层层析(TLC)图谱，其中 M 标准糖，包括葡萄糖(Gl)，麦芽糖(G2)，麦芽三糖(G3)，潘糖(PG3)和异麦芽三糖(IG3)； ST0926-27 融合酸性嗜热α -淀粉酶水解淀粉的产物得到葡萄糖、麦芽糖和潘糖)。
具体实施例方式实施例1 :ST0926和ST0927工程菌的构建及蛋白的表达，包括以下步骤(1)嗜热酸古菌(Sulfolobus Tokodaii strain 7T)的培养和基因组DNA的提取IL 嗜热酸古菌的培养基组成是4· 5mg Na2B4O7 · IOH20,1. 8mg MnCl2 · 4H20、 1. 3g (NH4)2SO4^O. 28g ΚΗ2Ρ04、0· 25g MgSO4 · 7Η20、0· 07g CaCl2 · 2Η20、0· 02g FeCl3 · 6H20、 0. 22mg ZnSO4 ·7Η20、0· 05mg CuCl2 ·2Η20、0· 03mg VOSO4 ·2Η20、0· 03mg Na2MoO4 ·2Η20、0· Olmg CoSO4 ·7Η20、1· Og 酵母提取物，加双蒸水 1. OL溶解。用 ION H2SO4 调 ρΗ 到 2. 0,1. 034X IO5Pa 高压蒸气灭菌20min。向购买自日本微生物菌种保藏中心的嗜热酸古菌sulfolobus Tokodaii strain 7T的干菌体中加入0. 5mL已灭菌的上述嗜热酸古菌培养基，重悬菌体后全部转移到已装有 5mL上述嗜热酸古菌培养基的试管中，混勻；从中吸取0. 5mL菌液转移到另装有5mL上述嗜热酸古菌培养基的试管，置于70°C静止培养7天。然后将菌体转移至装有IOOmL上述嗜热酸古菌培养基的锥形瓶中70°C振荡培养7天。取1. 5mL的上述培养后的嗜热酸古菌培养液，10，OOOrpm离心1分钟，倒尽上清液， 用 200 μ L 的 25mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8. 0，含 50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L EDTA)重悬沉淀；然后依次加入50 μ L的50mg/mL溶菌酶，在4°C下消化1小时；加入125 μ L的SDS 溶液(终浓度为2%，g/mL)反应10分钟；加入375 μ L的酚氯仿异戊醇(体积比为 25 24 1)，颠倒混勻，10，OOOrpm离心5分钟，将上清液转移到另一支离心管中，向上清液中加入700 μ L的无水乙醇，_20°C静置30min后，12000rpm离心5分钟，收集菌体染色体 DNA沉淀；用70% (体积比)的乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心后弃去上清，将离心管倒置在滤纸上，晾干后用100 μ L TE溶液重新溶解DNA沉淀，取5 μ L溶液于0. 8% (g/mL)的琼脂糖凝胶电泳鉴定所得染色体DNA的浓度和大小，在20kb附近有一条亮带，为所制得的染色体DNA，即ST0926和ST0927基因的PCR扩增模板，_20°C保存备用。(2)引物设计及PCR扩增ST0926和ST0927基因构建重组表达载体Sulfolobus Tokodaii strain 7T的全部基因序列已经通过鸟枪法得以测定，在其基因组中含有几段基因为可能的淀粉酶基因。我们选择了可能的淀粉酶基因ST0926和 ST0927作为研究对象，根据基因的序列我们设计了带有限制性酶切位点的引物，引物设计如下ST0926 上游引物 1 ATACGCGGATCCATGTTCGGACCTAGTTTTC 3'，横线处为内切酶BamH I识别位点；ST0926 下游引物 1 :5 ‘ AAGGCACTCGAGACGGCGTTTTATACTTTTGT,横线处为内切酶 Xho I识别位点；ST0927 上游引物 2 GATCTGGGGATCCCATATGATGTTTTTAGGTC3 ‘，横线处为内切酶Nde I识别位点；ST0927 下游引物 2 5' GATCGCTCGAGAAACTTTACTTACAATAGGT,横线处为内切酶Xho I识别位点。通过PCR法从步骤(1)所制得染色体DNA中扩增而分别得到ST0926和ST0927基因。设计好的两对引物是委托上海生工生物工程有限公司合成。扩增ST0926和ST0927基因的两对引物上所设计的酶切位点分别与表达载体 pET28a的BamH I和Xho I以及表达载体pET28b的Nde I和Xho I酶切位点匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。PCR反应在100 μ L反应体系中含IyL Taq DNA聚合酶，10 μ L Taq DNA聚合酶缓冲液(X 10)，2 μ L dNTP mix (每种核苷酸浓度为10mmol/L)，4 μ L染色体DNA, 1 μ L上游引物，1 μ L下游引物(扩增ST0926时加入上游引物1和下游引物1，扩增ST0927时加入上游引物2和下游引物2)，81. 5μ L超纯水。每个循环中95°C变性lmin，45°C -60°C退火 2min，72°C延伸lmin，共30个循环。PCR反应结束后以1.0% (g/mL)琼脂糖凝胶进行电泳检测产物，分子量与预期的(ST0926片段为654bp，ST0927为1080bp) —致。PCR产物使用杭州维特洁生化技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒进行纯化。利用BamH I和Xho I切割位点将纯化后的ST0926克隆进表达载体pET28a中的 BamH I和Xho I酶切位点之间，连接后成为重组载体pET28a_ST0926 ；利用Nde I和Xho I 切割位点将纯化后的ST0927克隆进入表达载体pET28b中的Nde I和Xho I切割位点之间， 连接后成为重组载体pET28b-ST0927。上述表达载体的构建步骤具体如下双酶切反应将l.Oyg上述纯化后的PCR产物与pET28a、pET28b分别与适量去离子水混勻，使总体积为40 μ L，各加入限制性内切酶BamH I (或Nde I)和Xho I各2. 5 μ L， 5 μ L相应的缓冲液10ΧΗ/Κ，混合，37°C水浴保温4小时，分别使用DNA纯化试剂盒回收目的 DNA。消化的ST0926与载体pET28a以及ST0927与载体pET28b的连接取1 μ L上述步骤回收的pET28a (或pET28b)载体DNA，加入10倍摩尔量的消化的PCR产物ST0926 (或 ST0927)，加入等体积的连接反应液I (购自大连宝生物工程有限公司的DNA连接试剂盒)， 混勻后于16°C水浴连接过夜，得到连接好的重组DNA pET28a-ST0926和pET28b-ST0927。将连接产物转入大肠杆菌Transetta (DE3)感受态细胞中，因pET28a和pET28b载体上有卡那霉素抗性基因，所以涂布于含终浓度为50 μ g/L卡那霉素的LB琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。从菌落中提取质粒，用限制性内切酶BamHI (或NdeI)和XhoI酶切质粒鉴定重组质粒，得到大小两个片段，其大小分别与表达载体和目的基因片段大小一致。质粒的提取、大肠杆菌感受态细胞制备及载体转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002 年)。实施例2 融合酸性嗜热α -淀粉酶基因的PCR扩增、工程菌的构建及酶的表达(1)采用重叠延伸PCR法扩增融合酸性嗜热α -淀粉酶基因ST0926-27基因通过同源序列分析，找到ST0926和ST0927合适的拼接位点(ST0926第1到198位氨基酸序列与ST0927多肽链融合构成ST0926-27融合蛋白，共557个氨基酸残基，分子量约6 IkDa)， 设计的引物为(ST0926上游引物序列3 :5' CATCGGGCCATATGTTCGGACCTAG 3'，横线处为 Nde I酶切位点；下游引物3 ACATCATGTAATTACCCTCTG 3‘，横线处碱基与ST0927上游引物4互补；ST0927上游引物4 5' TCCAGAGGGTAATTACATGAT 3’，横线处与ST0926的下游引物3互补；下游序列4 5' TTACGCGGATCCTGCTCGAGAAACT，横线处为BamH I酶切位点)。分别以pET28a-ST0926为模板，用上游引物3和下游引物3扩增ST0926的1至594 位核苷酸片段；以pET28b-ST0927为模板，用上游引物4和下游引物4扩增ST0927基因。 PCR反应100 μ L体系中含IyL TaqDNA聚合酶、10 μ L IOXTaq DNA聚合酶缓冲液、2 μ L dNTP混合物(每种核苷酸浓度lOmmol/L)、1 μ L质粒模板DNA、1 μ L上游引物、1 μ L下游引物、84 μ L超纯水。每个循环中95°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，最后再延伸 lOmin，共30个循环。PCR产物通过1.0% (g/mL)琼脂糖凝胶电泳检测，见图3A，分子量与预期的(ST0926片段为594bp，ST0927为1080bp) —致。用杭州维特洁生化技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒纯化，经1.0% (g/mL)的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像仪下检测并估算产物浓度来确定重叠延伸PCR中两个模板的加入量。纯化的ST0926和ST0927片段按1 1的摩尔比混合后，_20°C保存，作为之后的重叠延伸PCR的模板。融合酸性嗜热α -淀粉酶基因的扩增是以上述纯化的ST0926和ST0927片段混合物为模板，用ST0926上游引物3和ST0927下游引物4进行重叠延伸PCR扩增融合酸性嗜热α -淀粉酶基因ST0926-27，反应条件如下i)第一步反应体系为50 μ E
10
Taq/pfu (3:2混合)DNA聚合酶 dNTPs (各种核苷酸浓度均为10mmol/L) ST0926/0927DNA 混合物(50ng/(iL) IOxPCR Buffer ddH20
0.5μ
Ιμ 5[iL 40.5μ
PCR条件
温度
解链95 V 退火47°C 延伸72 °C
IOmin0
时间 20s 15s 2min
1 μ L 1 μ L
循环数14 72 °C延伸时间 )第一步PCR循环结束后，向反应体系补加上游引物3(20ymol/L) 下游引物4(20μπιΟ1/υ 继续PCR反应，条件为
温度
解链95 V 退火52°C 延伸72 0C
时间 20s 15s 2min循环数3172°C，延伸 IOmin。PCR反应结束后，产物用1. 0% (g/mL)琼脂糖凝胶电泳检测，在1700bp附近出现亮带，与预期的片段大小(1674bp)相符，如图3B所示。PCR产物使用杭州维特洁生化技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒纯化，超纯水洗脱，-20°C保存，备用。(2)重组表达载体pET15b-ST0926_27的构建利用Nde I和BamH I切割位点将纯化的融合酸性嗜热α -淀粉酶基因ST0926-27 克隆到表达载体pET15b上，构建重组表达载体pET15b-ST0926-27，其中目的基因的5，端融合了载体上编码6xHis标签序列(6xHis标签的核苷酸序列见pET15b的质粒图谱)，它是表达的该蛋白的纯化标签。表达载体的构建步骤如下分别对PCR产物和质粒pET15b进行双酶切反应取40 μ L上步骤纯化的PCR产物 (或提取的pET15b质粒)，加入5yL IOXK缓冲液，加入Nde I和BamHI各2. 5 μ L，37°C 下反应4小时，用杭州维特洁生化技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒回收目的 DNA。取IyL上述步骤回收的pET15b载体DNA，加入10倍摩尔量的消化的PCR产物ST0926-27，加入等体积的连接反应液I (购自大连宝生物工程有限公司的DNA连接试剂盒)，混勻后于16°C水浴连接过夜，得到连接好的重组DNA pET15b-ST0926-27。重组 DNApET15b-ST0926-27的构建过程如图3所示。重组表达载体pET15b-ST0926_27连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞 Transetta (DE3)，因宿主细胞无氨苄青霉素抗性，而重组质粒pET15b-ST0926_27上含有氨苄青霉素抗性基因，所以涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板进行单克隆菌株的筛选。分别挑取单克隆菌落接于5mL LB培养基(含终浓度为100yg/L氨苄青霉素)中，37°C，200rpm 振荡培养6h。提取质粒，经限制性内切酶BamHI和NdeI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，重组质粒pET15b-ST0926-27酶切后得到大小两个片段，其大小分别与表达载体pET15b片段和目的基因ST0926-27片段大小一致。质粒的提取、大肠杆菌感受态细胞制备及载体转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。融合酸性嗜热α-淀粉酶基因的序列分析委托上海生工生物工程有限公司，如图5所示，共测两个反应，进一步使用chromas和Bioedit软件组装得到全长的融合酸性嗜热α-淀粉酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示(1674bp)。(3)融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27的表达与制备重组表达载体pET15b-ST0926-27可转化大肠杆菌BL21(DE3)系列细胞中，如 BL21 (DE3)、BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)pLysE、Rosetta (DE3)及 Transetta (DE3)细胞等， 获得高表达的融合酸性嗜热α "淀粉酶ST0926-27。在本实施例中使用大肠杆菌菌株Transetta(DE3)为宿主细胞，得到可高效表达融合酸性嗜热菌淀粉酶的工程菌JDA001，具有抗氨苄青霉素和氯霉素两种抗性，酶蛋白是细胞内可溶性蛋白。质粒转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002 年)。挑取转入重组表达载体pET15b-ST0926-27的单克隆菌落，接种于5mL LB培养基 (含终浓度为100 μ g/mL的氨苄青霉素和30 μ g/mL的氯霉素)中，37°C 200rpm振摇培养过夜。以1 100 (体积比)的比例接种于500mLLB培养基(含终浓度为100 μ g/mL的氨苄青霉素和30 μ g/mL的氯霉素)，37°C 160rpm振摇培养至0D600为0. 8左右时(约2 3小时)，加人异丙基_ β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0. 5mM开始诱导，20°C、IOOrpm振荡诱导过夜。以6000rpm离心10分钟，收集菌体，用1/10培养液体积的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH5. 0)重悬菌体，置冰浴中超声波破碎细胞(功率约200W)20分钟，然后将细胞破碎液置于70°C水浴中热处理半小时，可以使部分大肠杆菌杂蛋白变性沉淀，12000rpm离心20min所得上清液，即为粗酶液。我们在构建质粒时即设计将目的蛋白的N末端融合了组氨酸标签，因此可以用 Ni-NTA亲和层析柱纯化得到本发明的融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27 向准备好的粗酶液中滴加5mol/L NaCl至终浓度为0. 5mol/L,混勻后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤杂质，将滤液加入到层析柱中，调低流速至0. 6mL/min,使目的蛋白充分与Ni结合，重复上柱2次。 用10倍柱体积50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5. 0)洗去未结合的蛋白；用5倍柱体积含20mmol/L咪唑的50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5. 0)洗去非特异结合的杂蛋白。然后用2. 5倍柱体积的含150mmol/L咪唑的50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱本发明的融合酸性嗜热α-淀粉酶，流速控制在0.4mL/min，收集流出液。用 lL50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5. 0)于4°C透析2h，换3次透析液重复操作。透析后的样品用聚乙二醇20000浓缩后，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的融合酸性嗜热α “淀粉酶的纯度和分子量，结果如图6中5所示，在61kDa处有一蛋白带，说明纯化得到的融合酸性嗜热α “淀粉酶ST0926-27的分子量为61kDa，与理论值相符。本发明利用重叠延伸PCR方法将嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii的ST0926和 ST0927基因拼接得到了融合酸性嗜热α-淀粉酶基因ST0926-27，使用该基因表达出融合酸性嗜热α-淀粉酶ST0926-27。所述的融合酸性嗜热α -淀粉酶以胞内可溶性蛋白形式表达，使用Ni-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27。实施例3 融合酸性嗜热α -淀粉酶的特性(1)最适反应温度和温度稳定性温度是影响酶催化活力的重要因素。通常情况下，酶在高温下的反应活力远高于低温，当温度达到或高于最适反应温度时酶的稳定性降低。对本发明所述融合酸性嗜热 α -淀粉酶ST0926-27的催化活力检测的温度范围为20-100°C。以可溶性淀粉为底物，在20 100°C的温度范围内测定本发明所述融合酸性嗜热 α -淀粉酶ST0926-27的活力，以酶的相对活力对温度作图，如图7所示，表明融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27的活力在20_70°C温度范围内随温度的升高而提高，在此温度以上，活力则下降，最适反应温度为70°C，并且在60-80°C之间较宽的温度范围内，该酶可保持90%左右的活力。酶活性的检测采用3，5_ 二硝基水杨酸(DNS)比色定糖法测定淀粉酶的活力， 将稀释的酶液50 μ L加入到已于70°C预热的900 μ L含1 % (g/mL)淀粉的50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中，70°C反应30min后，立即取出，加入50yL 2mmol/L NaOH终止反应。取50(^1^反应液，于251^血糖管中加入1.511^ DNS试剂，混勻，沸水中加热5min，冰水浴冷却，最后加入蒸馏水至25mL，混勻。测定546nm处的OD值。1个酶活力单位(U)定义为30分钟降解(g/mL)可溶性淀粉，产生相当于1微摩尔葡萄糖还原端所需的酶量。将浓度为0. 2mg/mL的纯酶在70、80、95°C中保温不同时间，按上述方法分别测定酶的残余活力，结果如图8所示，表明在70°C下融合酸性嗜热α -淀粉酶一直保持较高的活性，前6h内温度对酶有激活作用，保温12h后，依然保持85%以上的活性；而当温度提高到80°C时，保温6h内酶的活力保持80%以上，之后酶活迅速降低，保温12h后残余活力已不足40%;95°C时，酶的半衰期在6h左右。这说明融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27具有非常好的热稳定性。(2)最适反应PH和PH稳定性环境pH值会影响分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶的催化活力。以可溶性淀粉为底物，70°C下测定融合酸性嗜热α-淀粉酶ST0926-27在 ΡΗ2. 2-8. 0范围内的活力(pH 2. 2-4. 0，柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；pH 3. 3-6. 0，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；ΡΗ6. 0-8. 0，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液)，实验结果如图9所示，本发明酶在pH 4 至6之间能够有效地催化淀粉的水解，最适pH为5. 0。融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27在最适反应条件(pH5. 0，70°C )下，比活力为274. 97U/mg。将本发明酶置于50mmol/L不同pH值的缓冲液(pH 2. 3，柠檬酸-Na2HPO4缓冲液； PH4. 0和5. 0，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)中，在室温放置l_24h，70°C测定其残余活力，结果如图10所示，表明融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27在酸性(ρΗ4· 0和5. 0)范围内稳定性较高，24h内酶活性可以保持在最高活力的90%以上。而在pH4.0时，16h内酶的活性一定程度被激活，酶活力最大提高15%。(3)金属离子对酶活力的影响向浓度为0. 2mg/mL融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27酶液中加入Im mmol/L的如表一中所述的金属离子，于70°C水浴保温2h，取样按DNS法测定酶的残余活力，结果如表 1所示，表明融合酸性嗜热α “淀粉酶ST0926-27对Ca2+不具有依赖性，相反Ca2+及大部分金属离子的存在对酶活都具有微弱的抑制，其中Fe3+的抑制作用明显，达到45%以上；Mn2+ 和Ni2+表现了一定的激活作用，Mn2+的激活作用明显，酶活力提高16%以上，但Ni2+的作用不明显。因此在使用该酶时，应避免Fe3+的存在，可适当加入Mn2+来提高酶活力。表1 金属离子、EDTA和SDS对嗜热α -淀粉酶活力的影响
权利要求
1.一种融合酸性嗜热α-淀粉酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列或与其至少同源95%的序列。
2.一种融合酸性嗜热α-淀粉酶，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 2所示的序列或与其至少同源95%的序列。
3.一种制备权利要求2所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶的工程菌JDA001，其于2010 年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4486，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
4.一种权利要求2所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶的制备方法，其步骤如下(1)根据通过NCBIGenBank检索得到的来自泉古菌门嗜热酸古菌Sulfolobus Tokodaii strain 7T的嗜热α -淀粉酶基因ST0926和ST0927设计引物；培养嗜热酸古菌 Sulfolobus Tokodaii strain 7T，提取其基因组作为ST0926和ST0927的模板PCR扩增目的基因片段，并将其分别连接到质粒载体pET28a和pET28b上；(2)通过同源序列分析，找到ST0926和ST0927合适的拼接位点，设计拼接引物，通过重叠延伸PCR扩增得到酸性嗜热α -淀粉酶融合基因ST0926-27 ；(3)将酸性嗜热α-淀粉酶融合基因ST0926-27连接到表达质粒载体pET15b上，构建含有所述嗜热α-淀粉酶融合基因的质粒表达载体；(4)将所述质粒表达载体转入大肠杆菌Transetta(DE3)宿主细胞中，构建重组大肠杆菌 JDAOOl ；(5)在所述的大肠杆菌表达系统中表达融合酸性嗜热α-淀粉酶ST0926-27 ；(6)分离纯化所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶ST0926-27。
5.如权利要求4所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶的制备方法，其特征在于步骤(1)中嗜热α _淀粉酶基因ST0926是通过BamHI和XhoI双酶切连入双酶切处理过的质粒载体pET28a，嗜热α -淀粉酶基因ST0927是通过NdeI和XhoI双酶切双酶切处理过的质粒载体pET28b，步骤(3)中，融合基因ST0926-27是通过NdeI和BamHI双酶切连入双酶切处理过的质粒载体pET15b。
6.如权利要求4所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶的制备方法，其特征在于步骤(6) 的分离纯化是将发酵液离心收集细胞，加入缓冲液超声破碎20min，7(TC热处理半小时， 12000rpm离心20min，收集到的上清即为粗酶液；然后将粗酶液经Ni-螯合层析分离，得到纯的融合酸性嗜热α -淀粉酶ST0926-27酶，洗脱液为含200mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液。
7.权利要求2所述的融合酸性嗜热α-淀粉酶在淀粉深加工领域中的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种融合酸性嗜热α-淀粉酶基因、生产融合酸性嗜热α-淀粉酶的工程菌(大肠埃希氏菌Escherichia coli)JDA001、利用该基因工程菌发酵生产的融合酸性嗜热α-淀粉酶及该酶在淀粉深加工中的应用。通过本发明上述方法分离纯化得到的最终蛋白产品，其纯度达98％以上，比活力为274.97U/mg。本发明通过重叠延伸PCR扩增得到融合酸性嗜热α-淀粉酶基因ST0926-27，将其连入表达载体，在大肠杆菌中成功表达；获得高的回收效率和较好的纯化效果；融合酸性嗜热α-淀粉酶ST0926-27具有较高的最适反应温度、热稳定性和较低的最适pH值，具有很好的工业应用前景。
文档编号C12N15/70GK102321648SQ20111030340
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者常琳, 曹淑桂, 潘冬, 解桂秋, 高仁钧 申请人:吉林大学