嗜热侧孢霉生产耐热超氧化物歧化酶(sod)的方法
【技术领域】
[0001]利用嗜热侧孢霉生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程技术领域。本发明涉及利用菌株Sporotrichum thermophile保藏号为ATCC 34628，通过液态发酵获得耐高温SOD0
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能够增强机体抗辐射损伤的能力。近年来，它已经成为治疗炎症、肿瘤和自身免疫疾病的新型抗炎药物；化妆品和食品行业中用于防晒、防皮肤衰老和抗炎的添加剂以及用于某些疾病探针的生化试剂。SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。当前，SOD主要从动物血液(如猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法[P].申请号，02147888.0, 2002-12-19 ;徐文中，阎家麒.超氧化物歧化酶大规模生产新工艺[P].申请号，01144922.5，2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动物血液来源困难，而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前报道，已经可以通过微生物发酵法生产S0D，但主要为胞内酶(刁治民，姚银霞，张文静.酵母菌SOD发酵条件的研宄[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2002，4:48-51 ;杨明琰，郭爱莲，沈俭，等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研宄[J].食品科学，2005，26(10): 147-150)，提取工艺较为繁琐。
[0003]天然SOD热稳定性较差，在加工和使用过程中容易受热失活。如何有效地解决SOD在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，如何使含SOD的产品在生产工艺流程中不用顾忌高温是高效利用SOD的关键。利用生物工程生产新一代高稳定性、高耐热性的SOD是当前SOD开发最重要的途径。
[0004]本发明采用嗜热侧孢霉生产S0D，嗜热侧孢霉是一种耐热菌，可以产生耐高温的S0D,采用该菌发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能耐高温，开发前景广阔。
【发明内容】
[0005]目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。本发明的目的是针对当前问题，利用菌株Sporotrichum thermophile保藏号为ATCC 34628，通过液态发酵获得胞外耐热S0D。
[0006]本发明的技术方案如下:液态发酵培养基组成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l, K2HP04l-4g/l, MgS047H200.1-0.5g/l，NaCl l_2g/l。在一定体积的发酵罐内装入发酵体积60-70% (v/v)的培养基，灭菌冷却后接入嗜热侧孢霉，接种量为1_10%，起始PH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为20-45°C，发酵周期为2_6天。最终发酵液中SOD活力最高可达2500U/ml。
[0007]本发明所有种子培养基配方与发酵培养基相同。将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶后，种子的培养时间为48小时，种子的培养温度为45°C。
[0008]菌种保存用斜面培养基配方为:葡萄糖20g/l，MgS047H20 0.2g/l，酵母膏g/1，琼脂20g/l，pH自然。
[0009]SOD活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用。SOD活力测定方法和 SOD 活力定义详见:Chin_Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su, Theextract1n and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-ffenLin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.
[0010]本发明有如下特征:
[0011](I)嗜热侧孢霉用于SOD发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4)2S04、NH4Cl、NH4N03、NaN03、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、黄豆饼粉。
[0012](2)嗜热侧孢霉发酵SOD采用的发酵罐体积为5-50L。搅拌转速为70_150r/min，通风量1:0.1-1:0.5v/v/m。结合本领域的基本常识可根据生产情况调整发酵罐大小。
[0013]本发明的有益效果:首次采用嗜热侧孢霉进行了 SOD的发酵，不仅酶活高，而且生产的SOD具有良好的耐热效果，该方法适合工业化大规模生产耐热S0D，不仅解决当前SOD不耐热的缺点，而且提供了大量的SOD来源。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
[0015]将斜面菌种接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏 10g/l，蛋白胨 10g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉 12g/l，pH 自然。45°C，发酵 72小时。发酵结束后，将50ml发酵液10000转/min离心，去除菌体。上清粗酶液用于测定酶的PH及温度参数。取上清粗酶液0.5ml，分别置于pH 4，5，6，7，8的柠檬酸一磷酸缓冲液3.5ml 中，在 45°C下测定 SOD 活力分别为 1800，1900，2500，2300，2200U/mL。因此该 SOD 的最适反应pH是6。分别取上清粗酶液0.5ml,与3.5ml pH 6的柠檬酸一磷酸盐缓冲液混合，在 25，35，45，55，65°C 下分别测得酶活为 1900，2000，2500，2400，2300U/mL，因此该酶的最适温度为45°C。分别取上清粗酶液0.5ml，与3.5ml pH 6的柠檬酸一磷酸盐缓冲液混合，在25，35，45，55，65，75°C下保温48小时，然后测定酶活分别为2500，2500，2500，2500，2100，2000U/ml，结果表明该酶具有良好的耐热性。不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲液的配制方法参见:诸葛健，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994。
[0016]实施例2
[0017]将斜面菌种接种到装有50ml的种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉12g/l，pH自然，121灭菌20min，摇床转速150转/分钟，45°C下培养48小时。该过程有10个相同的三角瓶，共得到500ml种子液。
[0018]将500ml种子液接种入50L发酵罐，发酵培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉6g/l，pH自然，发酵温度为45°C，装液量70%，通风量为l:1.5v/v/m。发酵时间为3天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2300U/ml。
[0019]实施例3
[0020]将培养好的IL种子液接种到1L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:果糖30g/l，牛肉膏 10g/l，玉米浆粉 20g/l，K2HP044g/l，MgS047H20.5g/l，pH 自然。发酵温度为20°C，装液量70%，通风量为1:0.3v/v/m,发酵时间为5天，在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2500U/mlo
[0021]实施例4
[0022]将培养好的2L种子液接种到20L发酵罐中。种子及发酵培养基组成为:乳糖20g/1，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。接种量为10%，培养温度为45°C，装液量60%，通风量为1:0.5v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵时间为6天，在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2150U/mlo
[0023]实施例5
[0024]将培养好的300ml种子液接种到5L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:蔗糖20g/l，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。发酵温度为40°C，装液量65 %，通风量为1:0.lv/v/m，搅拌转速为70r/min，发酵周期为3天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2350U/mlo
[0025]实施例6
[0026]将培养好的3.5L种子液接种到50L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:麦芽糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，黄豆饼粉5g/l，pH自然，发酵温度为28°C，装液量70%，通风量为1:0.4v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵周期为5天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为2200U/ml。
[0027]实施例7
[0028]将培养好的600ml种子液接种到1L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:半乳糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，尿素5g/l，pH自然。发酵温度为30°C，装液量60%，通风量为1:0.3v/v/m，搅拌转速为120r/min，发酵时间为4天。在该条件下，发酵液中最终SOD 活力为 2120U/ml。
[0029]实施例8
[0030]将培养好的250ml种子液接种到5L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:木糖10g/l，酵母膏 5g/l，NaCl lg/1，K2HP04lg/l，MgS047H200.lg/l，pH 自然。发酵温度为 45°C，装液量50%，通风量为1: 1.2v/v/m,发酵时间为4天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为 2050U/ml。
【主权项】
1.本发明利用嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)通过液态发酵生产耐热的超氧化物歧化酶(SOD)。
2.根据权利要求1所述的嗜热侧孢霉，其特征在于可利用的产SOD的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清。
3.根据权利要求1所述的嗜热侧孢霉，其特征在于可利用的产SOD的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉。
【专利摘要】利用嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程技术领域。本发明采用嗜热侧孢霉在液态发酵条件下生产SOD，为胞外酶。耐热SOD产量最高可达2500U/ml，本发明具有良好的工业应用前景。
【IPC分类】C12N9-02, C12R1-645
【公开号】CN104694510
【申请号】CN201510071111
【发明人】丁彦蕊, 牟兆琳, 王雪芹, 饶榕
【申请人】江南大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月10日