具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体的制作方法

专利名称：具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体的制作方法
技术领域：
本发明描述了亲本α-淀粉酶的变体，该变体与该亲本α-淀粉酶相比呈现出下 列性质中至少一种性质的改变比活(specific activity)、底物特异性、底物结合、底物裂 解、热稳定性、PH依赖活性、pH依赖稳定性、氧化稳定性、Ca2+依赖性、pi和洗涤性能。该变 体适用于淀粉转化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。
背景技术：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)构成一组酶，其催 化淀粉，以及其他线性和有分支的1，4_糖苷低聚糖和多糖的水解。α -淀粉酶可以商业应 用于淀粉加工的初始阶段(液化)；湿玉米碾磨；醇的生产；用作洗涤剂基质中的清洁剂； 纺织工业中用于淀粉脱浆；在烘烤应用中；在饮料工业中；在油矿中用于钻孔过程；再循环 纸的脱墨和用于动物饲料中。尽管目前可用的α-淀粉酶已在应用于这些用途中取得了一些成功，还需要具有 提高的比活、合适的底物特异性、改良的热稳定性、PH稳定性和氧化稳定性，和降低的Ca2+ 依赖性的α-淀粉酶。发明概述一个方面，提供了 Spezyme Xtra或AmyS-样α -淀粉酶的新α -淀粉分解(酶) 变体(突变体)，特别是显示作为在淀粉工业加工(淀粉液化、糖化、清洁等)方面相关的优 点的改变特性的变体。可通过在亲本α-淀粉酶中引入突变实现此类特性的改变，该亲本α-淀粉酶影 响如比活、底物特异性、底物结合、底物裂解模型、热稳定性、pH/活性特征、pH/稳定性特 征、针对氧化的稳定性、Ca2+依赖性和其他目的特性。例如，此改变可以产生这样的变体，其 与亲本Spezyme Xtra样α -淀粉酶相比，具有降低的Ca2+依赖性和/或改变的pH/活性特 征和/或热稳定性。在一些实施方案中，变体基于亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌(GecAacillus stearothermophiIus) α -淀粉酶，或与此α -淀粉酶具有特定程度的氨基酸序列同一性， 如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或者甚至99%的氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，变体基于相关亲本α-淀粉酶， 例如与嗜热脂肪土芽孢杆菌α -淀粉酶具有至少60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者甚至99%的氨基酸序列同一性的那些亲本α-淀粉酶。在一些实施方案中，提供了具有α -淀粉酶活性和至少一种改良酶的性能的改变 的特征的变体多肽，此变体多肽包含与选自AmyS (SEQ ID NO 1)或AmyS的截短变体(SEQ ID NO 2)的亲本α-淀粉酶多肽具有至少60%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且在通 过比对变体多肽与亲本多肽而确定的亲本α-淀粉酶多肽的氨基酸残基相应的氨基酸残 基处具有至少一种以下突变，其中突变改变来自亲本多肽的氨基酸残基a)在一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自 D19、N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、N281、D306、D318、Q319、Q358、D393、Q443 和 D458 ；b)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自74A、115L、124K、 124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、 159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、 181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、 278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、 333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、 432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、 474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S 和 474V ；c)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6I、6N、6Q、6T、6V、 14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、50Q、52S、53T、67N、 67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、141R、141S、141V、 150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、213L、213M、213V、 217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、252L、253Y、254E、 254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、258H、258K、258Q、 258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、301F、301I、301P、 301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、 318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、340T、343C、343I、 343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、394V、400A、400N、 400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、403V、404C、404E、 404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、433K、433L、433M、 433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、445I、445N、445T、 445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、448N、448Y、450C、 450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、463M、463S、463T、 463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、471V、473G、473Y、 476A、476G、476L、476M、476N和 476T ；d)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自1MN、125A、125K、 125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、166F、 166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、180N、180T、180V、 180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、187N、187P、187Q、 187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、321H、321Q、321R、 333Q、432Q、437Y、446A、474Q和 474S ；
e)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6A、6D、6E、6H、6I、 6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、15E、015G、15H、15K、 15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、16R、16T、25C、39D、 39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、192A、192D、192G、 192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、196H、1961、196K、 196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、216G、216H、216M、 216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、221R、221S、221V、 221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、250F、250G、250I、 250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、268G、268H、268K、 268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、274Q、274R、274S、 274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、318M、318R、318S、 318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、320T、338A、338G、 338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、340N、340Q、345E、 363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、370N、370Q、370S、 375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、419S、419V、448Y、 452N、452Q、452R、452S、471R和 471Y ；和f)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自I181A、I181P、 I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y 和 E188P。在一些实施方案中，变体包括一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基的取代， 所述位点选自 D19、N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、N281、D306、D318、Q319、Q358、D393、 Q443和D458 ；并且变体多肽展示出改良的清洁性能。在具体实施方案中，改良的清洁是在 北美洗衣条件下，并采用微量样品测定法(microswatch assay)确定的。在具体实施方案 中，带正电的氨基酸残基是精氨酸。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残 基的取代，所述氨基酸残基选自 74A、115L、124K、124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、 148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、 169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、 242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、 302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、 418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、 437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、 474Q、474R、474S和474V，并且变体与亲本多肽相比具有改良的热稳定性。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残 基选自 6I、6N、6Q、6T、6V、14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、 50N、50Q、52S、53T、67N、67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、 141Q、141R、141S、141V、150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、 193Y、213L、213M、213V、217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、 250M、252L、253Y、254E、254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、 258G、258H、258K、258Q、258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、 294W、301F、301I、301P、301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、 340Q、340T、343C、343I、343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、 394L、394V、400A、400N、400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、 403T、403V、404C、404E、404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、 433I、433K、433L、433M、433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、 445G、445I、445N、445T、445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、 448I、448N、448Y、450C、450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、 463A、463M、463S、463T、463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、 471I、471V、473G、473Y、476A、476G、476L、476M、476N 和 476T，并且变体与亲本多肽相比具 有改良的热稳定性。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残 基选自 124N、125A、125K、125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、 159R、159S、159T、166F、166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、 180L、180N、180T、180V、180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、 187K、187N、187P、187Q、187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、 304Y、321H、321Q、321R、333Q、432Q、437Y、446A、474Q 和 474S，并且变体与亲本多肽相比展 示出提高的活性或表达。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残 基选自 6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、 15D、15E、015G、15H、15K、15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、 16Q、16R、16T、25C、39D、39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、 191K、192A、192D、192G、192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、 196F、196H、1961、196K、196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、 216E、216G、216H、216M、216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、 221N、221R、221S、221V、221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、 250E、250F、250G、250I、250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、 268E、268G、268H、268K、268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、 274N、274Q、274R、274S、274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、 318L、318M、318R、318S、318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、 320R、320T、338A、338G、338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、 340K、340N、340Q、345E、363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、 370K、370N、370Q、370S、375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、 419P、419S、419V、448Y、452N、452Q、452R、452S、471R 和 471Y,并且变体与亲本多肽相比展 示出提高的活性或表达。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残 基选自 I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y 和 E188P,并且变体 与亲本多肽相比在淀粉液化试验中展示出提高的粘性降低。在一些实施方案中，提供了变体α-淀粉酶多肽，其包含衍生自亲本α-淀粉酶 多肽的氨基酸序列，并在一些位点上具有三个或更多个突变的组合，所述位点选自5、6、13、14、15、16、18、20、25、27、29、36、39、50、52、53、54、67、71、73、75、77、80、81、83、85、90、92、 107、111、113、114、120、121、126、128、131、133、137、138、139、141、143、147、149、150、151、 152、155、160、165、168、172、173、177、188、191、192、193、196、200、201、202、213、216、217、 220、221、227、232、235、237、238、240、246、249、250、252、253、254、255、257、258、268、272、 274、275、279、283、285、293、294、297、300、301、306、309、312、313、317、318、319、320、338、 339、340、343、345、363、366、369、370、375、379、381、385、386、391、392、393、394、400、402、 403、404、406、407、410、413、414、416、419、422、427、433、436、439、442、445、447、448、450、 452、455、463、465、469、471、473和476，其中多肽具有α -淀粉酶活性，并且每个所述至少 三个或更多个突变在这些位点引入与亲本多肽中的氨基酸残基不同的氨基酸残基。在具体 实施方案中，突变数量是4、5、6、7、8、9、10或更多。在一些实施方案中，如果突变未出现在位点Μ2，突变与取代S242A、S242E、 S242Q、S242F、S242H或S242N—起出现。在具体实施方案中，取代是S242Q。在一些实施方 案中，如果突变未出现在位点179或180，突变与在位点179和180缺失一起出现。在一些 实施方案中，如果突变未出现在位点349或428，突变与在一个或多个这些氨基酸处的半胱 氨酸的取代一起出现。在一些实施方案中，如果突变未出现在以下任一位点，突变与在位点P17、D19、 T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、S124、D125、N127、 I130，G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、P209、N224、S242、 G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、K383、T398、H405、 T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、G474 或 R483 处的 取代一起出现。在一些实施方案中，如果突变未出现在以下任一位点，突变与在位点M8、M9、M15、 M96、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、M200、M206、A209、A210、M284、M307、M311、 M316、H405、T412、M438、N193F 和 V416G 处的取代一起出现。在一些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO 1的多肽具有至少80%、至少85%、至 少90%或甚至至少95%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO 2的多肽具有至少80%、至少85%、至 少90%或甚至至少95%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本多肽与选自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12,SEQ ID NO :15 禾口 SEQ ID NO :16 的多肽具有至少 80 %、至少85 %、至少90 %或甚至至少95 %的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本 多肽包含C-端氨基酸残基的截短。在具体实施方案中，该截短是C-端四个氨基酸残基。在一些实施方案中，变体多肽不包含在位点106或199或这两个位点处的突变。在一些实施方案中，从不脱离本说明书的突变清单中可以增加或缺失一个或多个 突变。相关地，出现在突变清单背景中的任一个或多个突变可组合为突变子集。在另一方面，提供了包含一个或多个上述变体α-淀粉酶的组合物。在具体实施 方案中，该组合物是清洁组合物，如衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂、硬表面清洁组合物等。此组合 物可包括洗涤剂。
在另一方面，提供了使用α-淀粉酶变体水解可溶淀粉底物的方法。在一些实施 方案中，变体包含引入选自 I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、S242Q、G132A、 N193Y和E188P的一个或多个氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，变体α-淀粉酶与植酸水解酶组合使用，其中α-淀粉酶的 活性(按α-淀粉酶单位)与植酸活性(按植酸酶单位)的比率，即AAU FTU，是从约 1 15到约15 1，且优选从1 10到约10 1。在具体实施方案中，AAU FTU的比率 是从1 4到3 1，或甚至1 1。在另一方面，提供了用于在包含底物的料浆中液化淀粉的方法，其涉及包含植物 材料(如来自干磨法或湿磨法的颗粒淀粉)的底物，该方法包括初级和/或次级液化步骤， 涉及在初级和/或次级液化步骤中同时或分别地以任意顺序添加至少一种植酸水解酶和 至少一种变体α-淀粉酶的组合至料浆。该方法可以还包括糖化液化的淀粉以获得可发酵 糖；并且回收可发酵糖。在一些实施方案中，该方法还包括在合适的发酵条件下发酵可发酵 糖以获得终产物如醇。在一些实施方案中，酶组合物含有至少一种变体α-淀粉酶和植酸 酶。在一些实施方案中，酶组合物为掺合物形式。在另一方面，提供了涉及用于发酵淀粉底物的方法，该方法包括以任意顺序添加 单一或分批量的变体α-淀粉酶和植酸酶的组合。在另一方面，将处理的淀粉底物发酵成乙醇。在另一方面，提供了不要求添加酸或碱来调节ρΗ的淀粉转化方法和/或乙醇发酵 方法。一个实施方案涉及无调节PH的液化步骤，其中液化的ρΗ在ρΗ4. 5到ρΗ5. 4范围内 且液化过程步骤中不添加酸中和化学品。另一实施方案中，液化的PH在ρΗ4. 8到ρΗ5. 8范 围内且液化过程步骤中不添加酸中和化学品。在另一方面，提供了获得可发酵底物的方法，涉及使含有颗粒淀粉的磨碎谷物料 浆与植酸水解酶在比淀粉糊化(gelatinization)温度低约0°C至30°C的温度接触，使该料 浆与变体α -淀粉酶接触，升高温度高于颗粒淀粉糊化温度以引起淀粉糊化，并通过使糊 化的淀粉与α -淀粉酶接触足以水解该淀粉的时间而水解糊化的淀粉，并且获得可发酵底 物。植酸水解酶可以是细菌或真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉属(Aspergillus)植 酸酶或布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶。在一些实施方案中，细菌植酸酶来自大肠杆菌 (E. coli) ο在另一方面，提供了用于产生可发酵糖的方法，其包括(a)将含有磨碎淀粉的材 料与水和稀釜馏物(thin stillage)混合，其中稀釜馏物占10至70% v/v，并且获得包含淀 粉及具有20至干固体(ds)含量的料浆，(b)用植酸酶在液化淀粉之前或与之同时 处理该料浆，(c)液化该淀粉，(d)在步骤(b)期间和/或与液化步骤同时添加变体α-淀 粉酶至所述淀粉和(e)糖化液化的淀粉以获得可发酵糖，其中在步骤(a)、(b)、(c)、(d)或 (e)的任意步骤期间不调节ρΗ。在一些实施方案中，将可发酵糖回收和纯化或异构化。在 其他实施方案中，在液化步骤之前添加植酸酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶随植酸酶一 起添加。在其他实施方案中，在液化步骤期间添加第二份α-淀粉酶剂量。在另一实施方案中，提供了从含淀粉的材料中生产醇的方法，其包括按照以上公 开液化并糖化已液化的淀粉，以获得可发酵糖，并进而在合适的发酵条件下使用发酵微生 物发酵可发酵糖来获得醇。在一些实施方案中，液化和发酵同时进行。在一些实施方案中，醇是乙醇。在另一方面，提供了编码变体α -淀粉酶的DNA构建体，包括表达载体，以及单独 或与其他α-淀粉分解酶组合用于例如各种工业过程(如淀粉液化和清洁)的表达和使用 变体α-淀粉酶的方法。附图简述

图1显示几种AmyS相关α -淀粉酶氨基酸序列的比对。图 2 显示 pHPLT-AmyS 质粒。图3显示S242文库变体在95°C热应激30分钟后的残余活性百分数。变体位点 P、S、W和Y缺失，并由野生型AmyS (SPEZYME Xtra-标记为“Z” )取代。线条指示在野生 型酶的残余活性百分数的标准差之上2倍和3倍。SM2A和SM2Q清晰地显示比野生型更 高的残余活性。图4A-4I显示图1中所示的氨基酸序列的逐对比对。图5显示在没有钙添加的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图6显示在有2mM的钙情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图7显示SPEZYME Xtra和两种变体相对于LIQUOZYME SC在三个时间点的活性特 征。图8显示4种变体相对于SM2Q变体在3个时间点的活性特征。图9显示因30 μ g剂量的α -淀粉酶LIQUOZYME SC或SPEZYME Xtra的作用 所致的谷物粉粘度降低。图10显示因30 μ g剂量的α -淀粉酶LIQUOZYME SC或SPEZYME Xtra或两 种变体(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。图11显示因20 μ g剂量的α -淀粉酶LIQUOZYME SC或SPEZYME Xtra或两 种变体(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。图 12 显示用 LIQUOZYME SC、SPEZYME Xtra 或两种变体(S242A 和 S242Q)之 一经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。图 13 显示用 LIQUOZYME SC、SPEZYME Xtra 或两种变体(SM2A 和 S242Q)之 一经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。图14显示用植酸酶和淀粉酶(SPEZYME Xtra或SM2Q变体)经过时间(0、30、 60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。MAXALIQ 是从Danisco分公司Genencor可 获得的植酸酶/淀粉酶掺合物。参考实施例8。图15显示用植酸酶和淀粉酶(例如，SPEZYME Xtra或SM2Q变体)经过时间 (0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。图16显示用SM2Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的DE进展。参考实施例9。图17显示用SM2Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的喷射之后粘度。参考实施例 9。图18显示植酸酶处理全磨谷物对提高S242Q变体的热稳定性和低pH稳定性的影 响并参考实施例9。图19显示在全磨谷物初级液化期间添加植酸酶对喷射蒸煮后粘度降低的影响并 参考实施例9。
图20显示DDGS中的硫酸和植酸含量的比较1)来自常规方法；2)来自无pH调节 的方法。参考实施例10。图21是显示DE进展的速率和植酸降低百分数作为IP6的图。图22是显示SM2Q变体α -淀粉酶对常规加工条件下DE进展的影响的图。参考 实施例8。图23是描述及其变体在北美洗衣条件下，在稻淀粉微量样品测定法中作为 电荷之函数的性能的图。此条件为20°C的Tide 2x。参考实施例16。图M是描述了另一 α -淀粉酶(即，芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)截短TS-23 淀粉酶)在西欧洗衣条件下，在稻淀粉微量样品测定法中随电荷突变的性能的图。此条件 为40°C的PERSIL⑧。参考实施例16。图25是描述SM2Q及其变体在BODIPY-淀粉测定法中作为电荷之函数的性能的 图。参考实施例16。图26A是描述作为相对振摇管表达之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用(即，相 对BODIPY-淀粉水解与相对振摇管表达)的图。图26B是描述作为相对振摇管表达之函数 的相对微量样品-淀粉水解作用(即，相对微量样品-淀粉水解作用与相对振摇管表达) 的图。参考实施例19。图27A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图27B是描述作为电荷之 函数的相对BODIPY-淀粉水解作用的图。参考实施例19。图28A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图28B是描述作为电荷之 函数的相对微量样品清洁活性的图。参考实施例19。图四是描述在采用第一 AmyS Ladder (阶梯)30% DS、pH5. 8、酶剂量30mg的谷物 使淀粉液化后的最终粘度的图。对于+6变体，最终粘度太高且无法测量(仪表超量程)。 参考实施例16。图30是描述作为电荷之函数的相对于野生型的第一 AmyS电荷阶梯的热稳定性的 图。实施的实验采用标准淀粉酶热稳定性测定法。参考实施例17。图31A是描述作为pH之函数的第一 AmyS电荷阶梯的稻淀粉清洁活性的图。 pH3. 0-4. 25 是 200mM 甲酸钠 +0. 01 % Tween-80。pH4. 25-5. 5 是 200mM 醋酸钠 +0. 01 % Tween-80。数据符合滴定曲线，每条曲线都有单一 pKa值。参考实施例21。图31B是描述电荷突变对用于AmyS催化(第一电荷阶梯)的直观pKa的影响的 图。参考实施例21。图32A显示相对于SPEZYME Xtra，通过AmyS变体的谷物粉的粘度降低。图32B显示通过AmyS N193Y的谷物粉的粘度降低。图32C显示通过AmyS N193Y的植酸添加对粘度降低的影响。序列简述本文参考以下氨基酸和核酸序列SEQ ID NO 1(全长、野生型 AmyS)AAPFNGTMMQ YFEffYLPDDG TLffTKVANEA NNLSSLGITA LffLPPAYKGT SRSDVGYGVYDLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DVVFDHKGGA DGTEffVDAVEVNPSDRNQEI SGTYQIQAffT KFDFPGRGNT YSSFKffRffYH FDGVDffDESR KLSRIYKFRG0083]IGKAffDffEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK0084]FSFFPDffLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASK0085]SGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPffFKPLAYAFILTRQEG0086]YPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKP0087]GSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGffGEFKVNGGSVSVff0088]VPRKTTVSTIARPITTRPffTGEFVRffTEPRLVAffP0089]SEQ ID NO 2 (截短、野生型 AmyS ；SPEZYME Xtra)0090]AAPFNGTMMQYFEffYLPDDGTLffTKVANEANNLSSLGITALffLPPAYKGTSRSDVGYGVY0091]DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEffVDAVE0092]VNPSDRNQEISGTYQIQAffTKFDFPGRGNTYSSFKffRffYHFDGVDffDESRKLSRIYKFRG0093]IGKAffDffEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK0094]FSFFPDffLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASK0095]SGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPffFKPLAYAFILTRQEG0096]YPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKP0097]GSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGffGEFKVNGGSVSVff0098]VPRKTT0099]SEQ ID NO 3(全长、SM2AAmyS)0100]AAPFNGTMMQYFEffYLPDDGTLffTKVANEANNLSSLGITALffLPPAYKGTSRSDVGYGVY0101]DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEffVDAVE0102]VNPSDRNQEISGTYQIQAffTKFDFPGRGNTYSSFKffRffYHFDGVDffDESRKLSRIYKFRG0103]IGKAffDffEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK0104]FAFFPDffLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASK0105]SGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPffFKPLAYAFILTRQEG0106]YPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKP0107]GSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGffGEFKVNGGSVSVff0108]VPRKTTVSTIARPITTRPffTGEFVRffTEPRLVAffP0109]SEQ ID NO 4(全长、S242Q AmyS)0110]AAPFNGTMMQYFEffYLPDDGTLffTKVANEANNLSSLGITALffLPPAYKGTSRSDVGYGVY0111]DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEffVDAVE0112]VNPSDRNQEISGTYQIQAffTKFDFPGRGNTYSSFKffRffYHFDGVDffDESRKLSRIYKFRG0113]IGKAffDffEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK0114]FQFFPDffLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASK0115]SGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPffFKPLAYAFILTRQEG0116]YPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKP0117]GSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGffGEFKVNGGSVSVff0118]VPRKTTVSTIARPITTRPffTGEFVRffTEPRLVAffP0119]SEQ ID NO 5(全长、S242E AmyS)0120]AAPFNGTMMQYFEffYLPDDGTLffTKVANEANNLSSLGITALffLPPAYKGTSRSDVGYGVY0121]DLYDLGEFNQKGTVRTKYGT KAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEffVDAVE
VNPSDRNQEI SGTYQIQAffT KFDFPGRGNT YSSFKffRffYH FDGVDffDESR KLSRIYKFRGIGKAffDffEVD TENGNYDYLM YADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIKFEFFPDffLSY VRSQTGKPLF TVGEYffSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASKSGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPffFKPLA YAFILTRQEGYPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH DYLDHSDIIG WTREGVTEKPGSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGffGEF KVNGGSVSVffVPRKTTVSTI ARPITTRPffT GEFVRffTEPR LVAffPSEQ ID NO 6 (Yamane 707)HHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNHWNRLNSDASNLKSKGITAVWIPPAWKGASQNDVGYGAYDLYDLGEFN
QKGTVRTKYGTRSQLQMVTSLKNNGIQVYGDVVMNHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVTGEYTIEAWTRFDFPGRGNTHSSFKWRWYHFDGVDWDQSRRLNNRIYKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWINHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLQKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASKSGGNYDMRNIFNGTVVQRHPSHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFKPLAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHGVPAMRSKIDPILEARQKYAYGKQNDYLDHHNIIGffTREGNTAHPNSGLATIMSDGAGGSKWMFVGRNKAGQVWSDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNKSEQ ID NO 7(野生型 AmyL ；LAT)ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDHPDVM
ElKRffGTffYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDffVNHVREKTGKEMFTVAEYffQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLMLITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQRSEQ ID NO 8 (野生型 AmyL ；Termamyl)ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDHPDVMElKRffGTffYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDffVNHVREKTGKEMFTVAEYffQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAF
ILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLMLITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQRSEQ ID NO 9 (解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)淀粉酶)VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIffYANELSLDGFRIDMKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYffQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQMSSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSMKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK
SEQ ID NO 10 (STAINZYME )HHNGTNGTMM QYFEffYLPND GNHWNRLRSD ASNLKDKGIS AVffIPPAffKG ASQNDVGYGAYDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TRNQLQAAVN ALKSNGIQVY GDVVMNHKGG ADATEMVRAVEVNPNNRNQE VSGEYTIEAff TKFDFPGRGN THSNFKffRffY HFDGVDffDQS RKLNNRIYKFRGDGKGffDffE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVffYTNTLGL DGFRIDAVKHIKYSFTRDffI NHVRSATGKN MFAVAEFffKN DLGAIENYLN KTNWNHSVFD VPLHYNLYNASKSGGNYDMR QIFNGTVVQR HPMHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEffFKP LAYALTLTREQGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMKSKIDPIL EARQKYAYGR QNDYLDHHNI IGffTREGNTAHPNSGLATIM SDGAGGNKWM FVGRNKAGQV WTDITGNRAG TVTINADGffG NFSVNGGSVSIffVNK

SEQ ID NO 11 (NATALASE )HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASNLRNRGITAIWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVYGDVVMNHKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEISGDYTIEAWTKFDFPGRGNTYSDFKWRWYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMDHPEVVNELRRWGEWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLTHVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAVTFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHSVPAMKAKIDPILEARQNFAYGTQHDYFDHHNIIGffTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGEKWMYVGQNKAGQVWHDITGNKPGTVTINADGWANFSVNGGSVSIWVKR
SEQ ID NO 12 (KAO KSM 1378)HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDMNLKSKGITAVWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFN
QKGTVRTKYGTRSQLQGAVTSLKNNGIQVYGDVVMNHKGGADGTEMVNAVEVNRSNRNQEISGEYTIEAWTKFDFPGRGNTHSNFKWRWYHFDGTDWDQSRQLQNKIYKFRGTGKAWDWEVDIENGNYDYLMYADIDMDHPEVINELRNWGVWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSYTRDWLTHVRNTTGKPMFAVAEFWKNDLAAIENYLNKTSWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGYFDMRNILNGSVVQKHPIHAVTFVDNHDSQPGEALESFVQSWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHGVPSMKSKIDPLLQARQTYAYGTQHDYFDHHDIIGWTREGDSSHPNSGLATIMSDGPGGNKWMYVGKHKAGQVWRDITGNRSGTVTINADGWGNFTVNGGAVSVWVKQ
SEQ ID NO 13 (KAO KSM K38)DGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAMLSDAGITAIWIPPAYKGNSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINVYGDVVMNHKMGADFTEAVQAVQVNPTNRWQDISGAYTIDAWTGFDFSGRNNAYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQENHIFRFANTNWNWRVDEENGNYDYLLGSNIDFSHPEVQDELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWVRHQRNEADQDLFVVGEYWKDDVGALEFYLDEMNWEMSLFDVPLNYNFYRASQQGGSYDMRNILRGSLVEAHPMHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFKPLAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDNISAKKDMIDELLDARQNYAYGTQHDYFDHWDVVGWTREGSSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGRQNAGQTWTDLTGNNGASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ
SEQ ID NO 14 (KAO KSM K36)DGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAEALSNAGITAIWIPPAYKGNSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINVYGDVVMNHKLGADFTEAVQAVQVNPSNRWQDISGVYTIDAWTGFDFPGRNNAYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQENHLFRFANTNWNWRVDEENGNYDYLLGSNIDFSHPEVQEELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWVRHQRSEADQDLFVVGEYWKDDVGALEFYLDEMNWE
MSLFDVPLNYNFYRASKQGGSYDMRNILRGSLVEAHPIHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFKPLAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDNISAKKDMIDELLDARQNYAYGTQHDYFDHWDIVGWTREGTSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGQQHAGQTWTDLTGNHAASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ
SEQ ID NO 15 (LIQUIZYME SC)MPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQMHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLSRIYKFRGKAWDWEVDTEFGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLMLITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVS
SEQ ID NO 16 (SPEZYME Ethyl)MPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQMHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLSRIYKFIGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYffSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTSEQ ID NO : 17 (引物 S242F)5' -[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG-3'SEQ ID NO : 18 (引物 S242R)5' -[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC-3'SEQ ID NO 19 (BP 17 植酸酶)NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTffP EffPVKLGYITPRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVffAD VDQRTLKTGEAFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEAQTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAffC QKHSADKSCD LGLSMPSKLSIKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAffGNI HSEQEffASLLKLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKILFIAGHDTNI ANIAGMLWR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTRVVSQSVEPGC QLQSEQ ID NO :20 (LAT信号肽的编码序列)atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttcttgctgcctc attctgcagc ttcagcaSEQ ID NO :21 (LAT 信号肽)MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASASEQ ID NO :22 (截短 S242Q AmyS)CN 102057040 A说明书13/370 页AAPFNGTMMQ YFEffYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALffLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQ KGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAffTKFDFPGRGNTYSSFKffRffYHFDGVDffDESRKLSRIYKFRGIGKAffDffEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFQFFPDffLSY VRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTL MTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPffFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY GIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGffGEFKVNGGSVSVWVPRKTTSEQ ID NO 23(成熟AmyS的编码序列)gccgcaccgtttaacggtaccatgatgcagtattttgaatggtacttgccggatgatggcacgttatggaccaaagtggccaatgaagccaacaaacttatccagccttggcatcaccgctctttggctgccgcccgcttacaaaggaacaagccgcagcgacgtagggtacggagtatacgacttgtatgacctcggcgaattcaatcaaaaagggaccgtccgcacaaaatatggaacaaaagctcaatatcttcaagccattcaagccgcccacgccgctggaatgcaagtgtacgccgatgtcgtgttcgaccataaaggcggcgctgacggcacggaatgggtggacgccgtcgaagtcaatccgtccgaccgcaaccaagaaatctcgggcacctatcaaatccaagcatggacgaaatttgattttcccgggcggggcaacacctactccagctttaagtggcgctggtaccattttgacggcgttgactgggacgaaagccgaaaattaagccgcatttacaaattccgcggcatcggcaaagcgtgggattgggaagtagacacggaaaacggaaactatgactacttaatgtatgccgaccttgatatggatcatcccgaagtcgtgaccgagctgaaaaactgggggaaatggtatgtcaacacaacgaacattgatgggttccggcttgatgccgtcaagcatattaagttcagtttttttcctgattggttgtcgtatgtgcgttctcagactggcaagccgctatttaccgtcggggaatattggagctatgacatcaacaagttgcacaattacattacgaaaacaaacggaacgatgtctttgtttgatgccccgttacacaacaaattttataccgcttccaaatcagggggcgcatttgatatgcgcacgttaatgaccaatactctcatgaaagatcaaccgacattggccgtcaccttcgttgataatcatgacaccgaacccggccaagcgctgcagtcatgggtcgacccatggttcaaaccgttggcttacgcctttattctaactcggcaggaaggatacccgtgcgtcttttatggtgactattatggcattccactccttcgctgaaaagcaaaatcgatccgctcctcatcgcgcgcagggattatgcttacggaacgcaacatgattatcttgatcactccgacatcatcgggtggacaagggaaggggtcactgaaaaaccaggatccgggctggccgcactgatcaccgatgggccgggaggaagcaaatggatgtacgttggcaaacaacacgctggaaaagtgttctatgaccttaccggcaaccggagtgacaccgtcaccatcaacagtgatggatggggggaattcaaagtcaatggcggttcggtttcggtttgggttcctagaaaaacgaccgtttctaccatcgctcggccgatcacaacccgaccgtggactggtgaattcgtccgttggaccgaaccacggttggtggcatggcct
SEQ ID NO :24(Satori F)5' -CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3'
SEQ ID NO :25(Satori R)
5 ‘ -TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3‘发明详述介绍本组合物和方法涉及亲本α -淀粉酶的变体，该变体与亲本α -淀粉酶相比呈现 出下列性质中至少一种性质的改变比活、底物特异性、底物结合、底物裂解、热稳定性、PH 依赖活性、PH依赖稳定性、氧化稳定性、Ca2+依赖性、pi和洗涤性能。该变体适用于淀粉转 化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。尽管描述了大量突变，它们普遍具有在氨基酸序列同一性和立体结构方面有相同 结构特征的亲本α-淀粉酶的改良的性能。已发现这些突变中的几种突变可与其他突变组 合，这使它们在设计具有预选择的特性的变体α-淀粉酶方面具有特定价值。还描述了或 者通常不可突变的位点，或者对突变和与其他突变的组合不可行(amendable)的位点。这 些位点的确定在设计具有预选择的特性的变体α-淀粉酶方面也是重要的。尽管主要使用来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的特定亲本α -淀粉酶来实施支持本组 合物和方法的研究，结构相关的α-淀粉酶可能从等效突变中受益。因此，本描述基于某些 氨基酸残基在特定位点的出现，提供用于改变大量α-淀粉酶的任意α-淀粉酶，以在性能 特征方面产生有益改变；并确定有可能具有合意的性能特征的新α -淀粉酶的路线图。以下更详细地描述了组合物和方法的这些和其他方面及实施方案。IL.定义和侖名法在更详细地描述了本组合物和方法之前，以下列出各种术语、命名法和通用原则。Α.定义清楚定义了以下术语和习惯用语。未定义的术语和习惯用语应具有其如本领域 所用的通常意义。参考标准分子生物学参考文献，如Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING A LABORATORY MANUAL (第 二 版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人，编著.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994) ；Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 第 2 版，John Wiley 和 Sons，New York(1994)；和 Hale 与 Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial，NY(1991)。如此处所用的术语“淀粉”指包含植物复杂多糖糖类、包含具有式(C6HltlO5)x (其中 X可以是任意数)的直链淀粉和支链淀粉的任何材料。淀粉的示例性来源包括但不限于谷 物、草、块茎和根，更具体地，是指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯。如本文所使用的术语“α-淀粉酶”指催化1，4-α-糖苷键(即E.C.类3. 2. 1. 1) 水解的酶。这些酶还被描述为影响包含1，4- α -连接的D-葡萄糖单元的多糖中1，4- α -糖 苷键的内切或外切水解。用于描述这些酶的另一术语是糖元酶。示例性酶包括α-1，4_葡 聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。如本文所使用的在涉及细胞、核酸、蛋白质或载体时使用的术语“重组”，是指该细 胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质，或天然核酸或蛋白质的改变而被 修饰，或者指的是该细胞源自这样修饰过的细胞。所以，例如重组细胞表达在天然(非重组 的)形式的细胞中未发现的基因，或者表达那些否则会异常表达(下调或者完全不表达)19的天然基因。如本文所使用的术语“蛋白质”和“多肽”在本文互换地使用，指由肽键链接的氨 基酸残基的连续的链。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。如本文所使用的“信号序列”指在多肽的N-端的氨基酸残基序列，其促进胞外多 肽向细胞外分泌。胞外蛋白的成熟形式缺少在分泌过程中被切除的信号序列。如本文所使用的“基因”指参与产生多肽，并包括在编码区之前及之后的区域以及 各个编码区段(外显子)之间间插序列(内含子)的DNA区段。基因的名称通常是斜体的， 相应蛋白的名称通常不是斜体且第一个字母大写。如本文所使用的术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，指由磷酸二酯酶或类 似键链接的核苷的连续的链，包括DNA、RNA、单链、双链，或部分部双链、以及其化学修饰的 DNA或RNA或合成衍生物。除非另外说明，核酸的序列以5’至3’的方向出现。因为遗传密 码是简并性的，本领域的技术人员喜欢多于一个密码子可以编码一个特定的氨基酸。如本文所使用的“载体”是指设计了用来将核酸引入一种或多种细胞类型的多核 苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。如本文所使用的“表达载体”指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列有效连接 能够影响其在适宜宿主中表达的适宜控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动 子、控制转录的可选操纵子序列、编码mRNA上合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制 转录和翻译终止的序列。如本文所使用的“启动子”是在结合RNA聚合酶以起始基因转录中涉及的调 节序列。启动子可以是诱导性启动子或组成型启动子。示例性启动子来自里氏木霉 (Trichoderma reesei)cbhl基因，其是诱导性启动子。如本文所使用的术语“在转录控制下”是指特定多核苷酸(通常是DNA序列)的 转录依赖于其有效连接的调节其转录的特定启动子和/或其他一个或多个元件。如本文所使用的术语“在翻译控制下”是指特定多核苷酸(通常是mRNA序列)的 翻译，其依赖于其有效连接到的调节其翻译的一个或多个特定元件。
如本文所使用的术语“源自，，包含术语“起源于”、“获自”或“可得自，，和“分离自”， 并用于表示特定多肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞或类似物是亲本多肽、多核苷酸、表达 载体、宿主细胞或类似物的改变的变体。如本文所使用的“有效连接的”指所述及的组分之间处于允许它们以其预期方式 发挥功能的关系中。例如，调节序列与编码序列以这样的方式“有效连接”，即，由此可在与 控制序列匹配的条件下实现该编码序列的表达。术语“选择/可选择标记”指这样的基因，该基因能够在宿主细胞中表达，以允许 使用培养基成分或生长条件容易地选择那些宿主细胞。可选择标记的实例包括但不限于提 供抗生素/对抗微生物抗性(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢或营养优 势的基因。如本文所使用的，当碱基或氨基酸残基所占的特定百分比与随后的比对序列相 同时，多核苷酸或多肽与另一序列具有一定“百分比/百分比序列同一性”(例如80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% )。比对和百分比同源性 或同一性可以使用本领域已知的适宜软件程序来测定，例如记载于⑶RRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY (F. Μ. Ausubel 等人编辑(1987)，增刊 30，7. 7. 18 部分)中的那些。优 选的程序包括Vector NTI Advance 9. 0(Invitrogen Corp. Carlsbad,CA),GCG Pileup程 序，FASTA (Pearson 等人(1988) Proc. Natl Acad. Sci USA 85:2444-2448)禾口 BLAST (BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda, Md.，和 Altschul 等人，(1997)NAR 25 :3389-3402)程序。另一优选的比对程序 是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，其使用缺省参数。另一个可 用的序列软件程序是TFASTA数据搜索程序，可来自序列软件包6. 0版Sequence Software Package Version 6. 0)(威斯康辛麦迪逊的威斯康辛大学遗传计算机组(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。如本文所使用的“宿主菌株”或“宿主细胞”是指这样的生物体，其适于引入包含 编码目标多肽的多核苷酸的表达载体或DNA构建体。宿主细胞优选为细菌或真菌细胞但也 可以是植物细胞(如原生质体)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。如本文所使用的术语“培养”是指在适宜条件下，在液体或固体培养基中生长微生 物细胞群体。培养包括含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵生物转化为终产物(通常是在容器或 反应器中)。如本文所使用的术语“发酵”是指用微生物酶促和基本厌氧分解有机底物来产生 更简单的有机化合物。虽然一般在厌氧条件下发生发酵，但是这并不意味着该术语仅仅限 于严格厌氧条件，因为在氧存在的情况下也发生发酵。如本文所使用的术语“接触”涉及酶及其底物时指将酶放置到足够靠近底物的位 点，以使该酶能够转化底物为终产物(即，对底物起作用)。混合酶与底物的溶液或悬浮体 能够导致接触。如本文所使用的术语“酶转化” 一般指通过酶作用的底物修饰，例如，通过淀粉酶、 葡糖淀粉酶或其他酶的作用对淀粉底物的修饰。如本文所使用的术语“糖化”指淀粉酶促转化为葡萄糖。如本文所使用的术语“糊化”指通过烹饪形成粘稠悬浮体的淀粉(如生或晶体状 淀粉)的溶解。如本文所使用的术语“液化”是指其中糊化的淀粉水解为低分子量可溶糊精的淀 粉转化阶段。如本文所使用的术语“聚合度(DP)”指给定糖的无水吡喃葡萄糖单元数量。DPl 糖的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2糖的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP>3的 糖具有大于3的聚合度。如本文所使用的术语“终产物”或“目的终产物”指从底物如淀粉酶促衍生的分子。如本文所使用的术语“干固体含量(ds) ”指以干重计(％ wt/wt).，料浆中总固体 的百分含量(％)。如本文所使用的术语“料浆(slurry) ”指含有不溶固体的含水混合物。如本文所使用的术语“残余淀粉”指发酵后在淀粉组合物中剩余的淀粉(可溶或 不可溶)。如本文使用的“再循环步骤”指醪液(mash)成分的再循环，醪液中可包括残余淀 粉、酶和/或影响或参与额外的淀粉组合物发酵的微生物。21
如本文所使用的术语“醪液”指可用于产生发酵产物(例如醇)的可发酵碳分子 (例如糖类)在水中的混合物。术语“发酵醪(beer)”和“醪液”可互换使用。如本文所使用的术语“釜馏物(Stillage) ”指未发酵的固体和水的混合物，其是从 发酵的醪液中除去乙醇之后的残留物。如本文所使用的术语“干酒糟(DDG) ”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS) ”指谷物发 酵的有用副产物。如本文使用的“产乙醇微生物”指能够将糖或寡糖转化为乙醇的微生物。产乙醇 微生物由于其能够表达一种或多种酶而一般能够产乙醇，该酶可单独或一起将糖转化为乙如本文使用的术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙 醇的任何生物或细胞。一般来讲，产乙醇细胞含有乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微 生物的实例包括真菌微生物，例如酵母菌。优选的酵母菌包括酵母属(Sacchromyces)，特别 是酿酒酵母(S. cerevisiae)。如本文使用的涉及多核苷酸或多肽的术语“异源的”指不是天然发生于宿主细胞 中的多核苷酸或多肽。蛋白质可以是商业上重要的工业多肽，例如酶。这意味着，该术语涵 盖了作为天然基因、突变基因和/或合成基因(或由天然基因、突变基因和/或合成基因编 码的)的多核苷酸或多肽。如本文使用的涉及多核苷酸或多肽的术语“内源的“指天然发生于宿主细胞中的 多核苷酸或多肽。如本文使用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”用于指从与其天然相关的至 少一种组分中分离出来的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。如本文所使用的涉及细胞的术语“转化的” “稳定转化的”和“转基因的”意思是该 细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，该序列整合到细胞基因组中或者作为游离质 粒在多次传代中得以保持。本文中使用的术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括 转录和翻译。如本文所使用，在将核酸序列插入到细胞中的背景中，术语“引入”意指“转染”或 “转化”或“转导”，并包括指将核酸序列合并到真核或原核细胞中，其中该核酸序列可以并 入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子或瞬时表达 (例如转染的mRNA)。本文使用的术语“比活”指在特定条件下每单位时间被酶或酶制剂转化为产物的 底物的摩尔数。比活一般用单位(U)/mg蛋白质表示。本文使用的术语“产量”指使用特定方法和特定试剂(包括酶)产生的终产物的 量。该终产物的量可以按质量、体积、浓度等表达，且可以包括原始材料(如底物)的量、时 间或其他条件。本文使用的术语“性能指数(PI) ”指变体酶于亲本或参照酶之间的性能比。在该 背景中，多种其他术语和惯用语被用来表征变体的性能“启动区突变(up mutation) ”具有 PI > 1 ；中性突变具有PI > 0. 5 ；非缺失突变具有PI > 0. 05 ；缺失突变具有PI = 0. 05 ；可 组合的突变对至少一种性能具有PI = 0. 5，并对所有性能具有PI > 0. 05。
本文使用的术语“可组合的突变”是能够组合以产生(deliver)具有针对一种或 多种预期性质(见上文)的预选性能指数(PI)的蛋白质的突变。本文使用的术语“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，其位于ManasshVA，美国。本文使用的术语“NRRL”指农业研究服务培养物保藏中心，农业应用研究国家 中心(Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research，以前叫USDA北方地区研究实验室)，其位于 Peoria, IL,美国。一般而言，数值范围包括定义该范围的数值。除非上下文另有明确说明，否则单数 形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。本文提供的题目是为方便阅读，且不应 解释为将所述主题内容局限在为说明书的一部分。所有专利和出版物明确引入本文作为参 考，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列。B.命名法除非另有说明，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码。为了。用下列命名 法描述变体多肽原始氨基酸位点取代氨基酸。根据这种命名法，例如，在位点242用丙氨酸取代丝氨酸表示为Ser242Ala 或 S242A位点30的丙氨酸缺失表示为Ala30* 或 A30* 或 ΔΑ30其他氨基酸残基的插入，例如赖氨酸的插入，表示为Ala30AlaLys 或 A30AK连续氨基酸残基片段的缺失，例如氨基酸残基30-33，表示为(30_33广或 Δ (Α30-Ν33)。当多肽与其他多肽(或亲本多肽)相比，包含“缺失”且在这一位点进行了插入， 表示为*36Asp或*36D，该实例指在位点36插入天冬氨酸。多个突变用加号隔开。例如，在30和34位分别用丙氨酸和谷氨酸取代天冬酰氨 和丝氨酸的突变表示为Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S当一个或多个备选氨基酸残基可以插入在指定位点时，表示为A30N，E 或 A30N 或 A30E。并且，当鉴定了适宜于修饰的位点但没有指定的任何特定修饰时，应理解为任何 氨基酸残基可以取代此位点的氨基酸残基。因此，例如，当提及位点30处的丙氨酸的修饰 但是并未指明时，应理解为丙氨酸可以被缺失或取代为任何其他氨基酸，即下列氨基酸中 的任何一个R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另外，“Α30Χ”指下列取代中的任何一个A30R、Α30Ν、A30D、A30C、A30Q、Α30Ε、A30G、Α30Η、Α30Ι、A30L、Α30Κ、Α30Μ、A30F、 Α30Ρ、A30S、Α30Τ、A30W、Α30Υ 或 A30V ；也可以表示为A30R、N、D、C、Q、Ε、G、H、I、L、K、Μ、F、 P、S、T、W、Y、V。
如果用于编号的亲本酶已经含有所讨论的，在其位点建议进行取代的氨基酸残 基，当例如N或V之一存在于野生型中的情况下，则用下列命名法“X30N” 或 “X30N，V”。所以，这意味着其他相关的亲本酶在位点30处被取代为“Asn”或“Val ”。C.氨基酸残基特征提供以下氨基酸残基的一般信息特征供参考带电荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His带负电荷的氨基酸(从带负电最多的残基开始排列)Asp、Glu带正电荷的氨基酸(从带正电最多的残基开始排列)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val> Leu> lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水氨基酸残基(最疏水的残基排在最后):Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，亲水氨基酸(最亲水的残基排在最后)Thr、Ser、Cys、Gln、AsnIII. α-淀粉酶用于本发明组合物和方法以下段落描述了根据本本文说明可修饰和使用的“ Spezyme Xtra-样，，或 “AmyS-样” α-淀粉酶。Α. α-淀粉酶的同源性已实施的支持本组合物和方法的实验采用由SEQ ID NO :2示例的嗜热脂肪土 芽孢杆菌(之前为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi lus) α-淀粉酶(即， AmyS)实施。这种淀粉酶的变体是市售的，如SPEZYME Xtra (Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA, USA)。芽孢杆菌物种产生的大量α -淀粉酶与AmyS在氨基酸水平上具有高度同源性 (同一性)，且本文描述的许多突变在这些淀粉酶内产生时预计将产生类似效果，这些酶总 体指如“SPEZYME Xtra-样” α -淀粉酶或“ AmyS-样” α -淀粉酶。大量已知芽孢杆菌 α-淀粉酶的同一性总结在表A中表Α.百分比同一性
权利要求
1.具有α-淀粉酶活性和至少一种改变的特征的变体多肽，所述改变的特征改良酶的 性能，所述变体多肽包含与选自AmyS (SEQ ID NO 1)或AmyS的截短变体(SEQ ID NO 2)的亲本α -淀粉酶多 肽具有至少60%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和在通过比对变体多肽与亲本多肽而确定的亲本α-淀粉酶多肽的氨基酸残基相应的 氨基酸残基处具有至少一种以下突变，其中所述突变改变来自亲本多肽的氨基酸残基a)在一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自D19、 N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、N281、D306、D318、Q319、Q358、D393、Q443 和 D458 ；b)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自74A、115L、124K、1MR、 132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、159K、 159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、181E、 181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、278K、 278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、333Q、 378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、432N、 432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、474A、 474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S 和 474V ；c)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6I、6N、6Q、6T、6V、14T、 16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、50Q、52S、53T、67N、67S、 80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、141R、141S、141V、150E、 151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、213L、213M、213V、217Q、 220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、252L、253Y、254E、254F、 254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、258H、258K、258Q、258T、 258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、301F、301I、301P、301R、 301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、 338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、340T、343C、343I、343P、 343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、394V、400A、400N、400V、 402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、403V、404C、404E、404G、 404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、433K、433L、433M、433V、 433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、445I、445N、445T、445V、 445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、448N、448Y、450C、450H、 450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、463M、463S、463T、463V、 463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、471V、473G、473Y、476A、 476G、476L、476M、476N 和 476T ；d)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自124N、125A、12^(、125N、 130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、166F、166G、 166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、180N、180T、180V、180Y、 181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、187N、187P、187Q、187R、 187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、321H、321Q、321R、333Q、 432Q、437Y、446A、474Q 和 474S ；e)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、 6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、15E、015G、15H、15K、15N、 15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、16R、16T、25C、39D、39E、 39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、192A、192D、192G、192N、 192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、196H、196I、196K、196P、 196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、216G、216H、216M、216Q、 216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、221R、221S、221V、221Y、 237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、250F、250G、250I、250K、 250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、268G、268H、268K、268N、 268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、274Q、274R、274S、274T、 275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、318M、318R、318S、318T、 318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、320T、338A、338G、338I、 338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、340N、340Q、345E、363D、 363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、370N、370Q、370S、375A、 375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、419S、419V、448Y、452N、 452Q、452R、452S、471R和 471Y ；和f)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自I181A、I181P、I181C、 I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y 和 E188P。
2.权利要求1的变体，其中所述突变在一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基，所 述位点选自 D19、N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、拟81、D306、D318、Q319、Q358, D393、 Q443和D458，并且所述变体多肽显示改良的清洁性能。
3.权利要求2的变体，其中所述带正电的氨基酸残基是精氨酸。
4.权利要求1的变体，其中所述取代引入一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选 自 74A、115L、124K、124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、 159F、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、 181A、181C、181D、181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、 271V、278A、278H、278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、 321H、321Q、321R、333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、 432D、432L、432M、432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、 454A、464Q、464Y、474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S 和 474V，并且 所述变体与亲本多肽相比具有改良的热稳定性。
5.权利要求1的变体，其中所述取代引入一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选 自 6I、6N、6Q、6T、6V、14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、 50Q、52S、53T、67N、67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、 141R、141S、141V、150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、 213L、213M、213V、217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、 252L、253Y、254E、254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、 258H、258K、258Q、258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、 301F、301I、301P、301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、 340T、343C、343I、343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、 394V、400A、400N、400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、 403V、404C、404E、404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、 433K、433L、433M、433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、 445I、445N、445T、445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、 448N、448Y、450C、450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、 463M、463S、463T、463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、 471V、473G、473Y、476A、476G、476L、476M、476N和476T，并且所述变体与亲本多肽相比具有 改良的热稳定性。
6.权利要求1的变体，其中所述取代引入一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选 自 124N、125A、125K、125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、 159S、159T、166F、166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、 180N、180T、180V、180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、 187N、187P、187Q、187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、 321H、321Q、321R、333Q、432Q、437Y、446A、474Q和474S，并且所述变体与亲本多肽相比显示 提高的活性或表达。
7.权利要求1的变体，其中所述取代引入一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选 自 6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、 15E、015G、15H、15K、15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、 16R、16T、25C、39D、39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、 192A、192D、192G、192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、 196H、196I、196K、196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、 216G、216H、216M、216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、 221R、221S、221V、221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、 250F、250G、250I、250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、 268G、268H、268K、268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、 274Q、274R、274S、274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、 318M、318R、318S、318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、 320T、338A、338G、338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、 340N、340Q、345E、363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、 370N、370Q、370S、375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、 419S、419V、448Y、452N、452Q、452R、452S、471R和471Y，并且所述变体与亲本多肽相比显示 提高的活性或表达。
8.权利要求1的变体，其中所述取代引入一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基选 自 I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y 和 E188P,并且所述变体 与亲本多肽相比在淀粉液化试验中显示提高的粘性降低。
9.变体α-淀粉酶多肽，其包含衍生自亲本α-淀粉酶多肽的氨基酸序列，并在以下位 点上具有三个或更多个突变的组合，所述位点选自5、6、13、14、15、16、18、20、25、27、29、36、.39、50、52、53、54、67、71、73、75、77、80、81、83、85、90、92、107、111、113、114、120、121、126、 128、131、133、137、138、139、141、143、.147、149、150、151、152、155、160、165、168、172、173、 177、188、191、192、193、196、200、201、202、213、216、217、220、221、227、.232、235、237、238、 240、246、249、250、252、253、254、255、257、258、268、272、274、275、279、283、285、293、294、 297、300、301、.306、309、312、313、317、318、319、320、338、339、340、343、345、363、366、369、 370、375、379、381、385、386、391、392、393、394、.400、402、403、404、406、407、410、413、414、 416、419、422、427、433、436、439、442、445、447、448、450、452、455、463、465、469、.471、473 和 476，其中所述多肽具有α-淀粉酶活性，并且每个所述至少三个或更多个突变引入与亲本 多肽中的氨基酸残基不同的氨基酸残基。
10.权利要求1-9中任一项的变体，其中当突变未出现在位点242时，所述突变与位点 242的谷氨酰胺一起出现。
11.权利要求1-9中任一项的变体，其中当突变未出现在位点179或180时，所述突变 与在位点179和180缺失一起出现。
12.权利要求1-9中任一项的变体，其中所述亲本多肽与SEQID NO :1的多肽具有至 少90%的氨基酸序列同一性。
13.权利要求1-9中任一项的变体，其中所述亲本多肽与SEQID NO :2的多肽具有至 少90%的氨基酸序列同一性。
14.权利要求1-9中任一项的变体，其中所述亲本多肽与选自SEQID NO=USEQ ID NO 2,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO :12,SEQID NO :15和SEQ ID NO :16的多肽具有至少90%的氨基酸序列同一性。
15.权利要求1-9中任一项的变体，其中所述亲本多肽包含C-端四个氨基酸残基的截短。
16.清洁组合物，其包含权利要求1-15中任一项的多肽。
17.淀粉液化组合物，其包含权利要求1-15中任一项的多肽。
18.使用α-淀粉酶变体水解可溶淀粉底物的方法，其包括使所述淀粉底物与权利要 求1-15中任一项的变体α -淀粉酶接触。
19.权利要求17的方法，其中所述变体包含引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述 氨基酸残基选自 Ι181Α、Ι181Ρ、I181C、Ι181Ε、Ι181Υ、S242A、S242E、S242Q、G132A、Ν193Υ 和 Ε188Ρ。
20.权利要求17或18的方法，其还包括在与变体α-淀粉酶接触之前或同时，所述淀 粉底物与植酸酶接触。
全文摘要
本发明描述了亲本α-淀粉酶的变体，该变体与该亲本α-淀粉酶相比呈现出下列性质中至少一种性质的改变比活、底物特异性、底物结合、底物裂解、热稳定性、pH依赖活性、pH依赖稳定性、氧化稳定性、钙依赖性、pI和洗涤性能。该变体适用于淀粉转化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。
文档编号C11D3/386GK102057040SQ200980121027
公开日2011年5月11日 申请日期2009年6月2日 优先权日2008年6月6日
发明者A·R·托波扎达, A·肖, D·A·埃斯特尔, S·H·哈迪, S·W·拉默, W·A·奎瓦斯, W·韦勒, 李祥揆 申请人:丹尼斯科美国公司