专利名称：嗜热脂环芽孢杆菌来源的羧酸酯酶D-1CarE5及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种嗜热脂环芽孢杆菌来源的羧酸酯酶D-lCarE5及其基因。
背景技术：
羧酸酯酶(Carboxylesterases, E C3. I. I. I)是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于a/3水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构，Ser, Asp, His构成了羧酸脂酶的催化活性中心(Nardini, M, etal., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9 (6):732-737.)。羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J.，et al.，journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.),其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性(Ramos Tombo, et al. , Agricultural and BiologicalChemistry. 1987，51:1833-1838.)。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景(Jaeger K. E.，et al.，Trends inBiotechnology. 1998, 16 (9):396-403.)。羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，然而天然菌株产酶低、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高农药降解酶的表达量，实现其大规模工业化生产。本文从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组中克隆羧酸脂酶基因故与表达载体pET28a(+)连接后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达并对羧酸酯酶酶学性质进行了初步研究，为进一步研究羧酸酯酶对农药的降解奠定了理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧酸酯酶。本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明所述羧酸酯酶D_lCarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌(thermophilic
AlieyelobaciIlus tengchongensisstrain CGMCC1504)。D_lCarE5 的氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示。本发明的羧酸酯酶D-lCarE5总共含有513个氨基酸，理论分子量为58. 65kDa。以a -乙酸萘酯为底物最适温度40°C ;最适pH7. 38 ;终浓度I mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用；在温度35 1以下保温50 min基本保持稳定；经1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38和pH8. 04缓冲液下处理80 min，分别保持40%,90%和45%以上的活性；在pH7. 38及40 °C下，该酶对0. 6 mol/L a -乙酸萘酯的比活力为108.65±0.01 U/mg ;在pH7. O及60 °〇下，该酶对0.6 mol/L P -乙酸萘酯的比活力为14. 78±0. 01 U/mg。本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因故，该基因序列如SEQ ID NO. 2。本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶D_lCarE5的编码基因万，其全长1542 bp,起始密码为 ATG,终止密码为 TGA。经 BLAST 在 GeneBank(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)数据库进行比对分析,该羧酸酯酶基因D-2编码的氨基酸序列与GeneBank中Paenibacillus sp. JDR-2来源的潜在羧酸脂酶(YP_003012983. I)具有最高一致性，为&m^_Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 来源潜在脂酶(YP_909165. I)具有最高一致性，为45%，说明羧酸酯酶是一种新的羧酸酯酶。
本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因的重组载体，优选为m_D-lCarE5。将本发明的羧酸酯酶基因插入到表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的羧酸酯酶基因插入到质粒pET-28a(+)上的及I和通o I限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒m-D_lCarE5。本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株(DE3)/ D-lCarE5。本发明制备羧酸酯酶D_lCarE5的方法按以下步骤进行
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组羧酸酯酶表达；
3)回收并纯化所表达的羧酸酯酶D-lCarE5。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株现之2 (DE3)/ D_lCarE5。本发明提供了一个新的羧酸酯酶基因，其编码的羧酸酯酶以a-乙酸萘酯为底物最适温度40°C ;最适pH7. 38 ;终浓度I mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用；在温度35 V以下保温50 min基本保持稳定；经 1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38 和 pH8. 04 缓冲液下处理 80 min,分别保持 40%,90% 和 45%以上的活性；同时也能够水解￠-乙酸萘酯；可应用于农药残留或农药污染治理方面。
图I :在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶D_lCarE5的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子量蛋白质Marker ；1 :纯化的重组羧酸酯酶D_lCarE5。图2 :重组羧酸酯酶D_lCarE5的最适温度。图3 :重组羧酸酯酶D_lCarE5的热稳定性。图4 :重组羧酸酯酶D_lCarE5的最适pH。图5 :重组羧酸酯酶D_lCarE5的pH稳定性。图6 :不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D_lCarE5活性的影响。图7 :重组羧酸酯酶D_lCarE5 1/[S]与1/V的关系。
具体实施方式
实验材料和试剂
I、菌株及载体嗜热脂环酸芽孢杆菌(thermophilic Alicyclobacillustengchongensisstrain CGMCC1504)为实验室筛选菌株；大肠杆coli BL21(DE3)和表达载体pET_28a ( + )可购于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；坚固蓝B购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。3、培养基
LB培养基蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，氯化钠1%，pH自然(约为7. O)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。实施例I :羧酸酯酶基因D-lCarE5的克隆
嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组DNA =CTAB裂解法，具体步骤为将液体培养12 h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 UL溶液I ( 20 mM Tris, pH8. 0, 2 mM Na2-EDTA,终浓度20 mg/mL溶菌酶)，37 °C保温30 min，加100 u L 10% SDS上下颠倒混匀，再加10 u L10 mg/mL 的蛋白酶 K，37 °C保温 30 min，加 150 u L 5 M NaCl 和 150 u L 10% CTAB 溶液上下颠倒混匀，65 °C保温20 min，加入等体积的酚/氯仿/异丙醇(体积比25 :24:1)进行抽提，在4 °〇下12000 rpm离心10 min，取上清于氯仿/异丙醇(体积比24 :1)中再次抽提除去杂蛋白，4 1下12000 rpm离心10 min，再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5. 2 3M NaAc,_70°C沉淀Ih, 4。(^下13500 rpm离心20 min,弃上清，再用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20 °C备用。根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因D~lCarE5并设计表达引物CarF和CarR
上游引物 CarF: 5’ CGCGGATCCATGCAAAGCATGCTGCGG 3’(划线部分为 I 酶切位
点)
下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGAAAATGTACTGTTTTTGCTTAAAG 3’(划线部分为ZAo I 酶切位点)
上游引物 17: 5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG 3，
下游引物Hter: 5’TGCTAGTTAITGCTCAGCGG 3’为PCR检测阳性克隆子引物。以嗜热脂环酸芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94 °C 预变性 5 min;然后 94 °C 变性 30 sec ；52 °C 退火 30 sec ；72 °C 延伸 I min30 sec ；30个循环后72 °C保温5 min。PCR纯化产物经汉I和沿o I双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET-i -7ferf^，4 °C过夜。取 10 ii I 连接产物■转化到 100 u I Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37 1温箱培养13 h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物(T7，T7ter)进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/D-lCarE5。实施例2 :羧酸酯酶D_lCarE5的制备[a3]取含有重组质粒成l-D-lCarE5的Escherichia coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET-28a (+)的空质粒coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接种量接种于LB (含50 l^g/mL Kan)培养液中，37 1快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB (含50 Pg/mL Kan)培养液中，快速振荡培养约2-3 h (OD600达到0.6-1. 0)后，加入终浓度0. 7 mM的IPTG进行诱导，于20 1继续振荡培养约20 h或26 °C振荡培养约8 h。12000 rpm离心5 min，收集菌体。用适量的pH7. 0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13，000 rpm离心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图I)表明，重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。[a4]纯化的重组羧酸酯酶D_lCarE5的性质测定
I、重组羧酸酯酶D-lCarE5的活性分析
2[a5]纯化的重组羧酸酯酶D_lCarE5的活性测定方法采用a -萘酚法取三支10 ml 试管，分别编号1、2、3,1号和2号试管为实验组,3号为对照组。分别向I号和2号试管中加入2. 5 ml l/15mol/L pH为7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，向3号试管中加入3ml l/15mol/L pH为7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。向三支试管中加入30 yl底物a-乙酸萘酯醇溶液，置于37 °C水浴锅中预热5 min，然后向I号和2号试管中加入0.5ml适当稀释的酶液，反应5 min后，将三支试管取出，在冰浴条件下每支试管加入0.5 ml显色剂(1%坚固蓝B盐水溶液和5% SDS使用前2 5混合)溶液，充分摇匀后，静置5 min-10min后，在分光光度计595 nm下测定其吸光度值。I个酶活单位(U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物a -乙酸萘酯生成I UmoL a-萘酹所需要的酶量。以0 -乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同a-乙酸萘酯。2、重组羧酸酯酶D_lCarE5的最适温度和热稳定性的测定
酶的最适温度的测定将羧酸酯酶D-lCarE5在1/15 mol/L pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，分别在20 0C >30 0C >35 0C >40 °C >45 °C >50 °C >60 °〇下进行酶促反应。温度稳定性的测定将羧酸酯酶D-lCarE5在1/15 mol/L pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，在20 °C、35 1和45 °C三个温度下分别保温10 min,20min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以a -乙酸萘酯为底物，反应5 min,测定纯化羧酸酯酶D-lCarE5的酶学性质。结果表明D_lCarE5的最适温度40°C (图2);35 1以下保温50 min基本保持稳定(图3)。3、重组羧酸酯酶D_lCarE5的最适pH和pH稳定性的测定
酶的最适pH的测定将羧酸酯酶D-lCarE5在最适温度40 °C,分别在1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同pH4. 92,5. 91,6. 47,6. 98,7. 38,8. 04和8. 67条件下酶促反应。PH稳定性的测定将羧酸酯酶D-lCarE5在最适温度40°C，在pH5. 91、pH7. 38和pH8. 04下分别耐受20 min、40 min、60 min和80 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以a -乙酸萘酯为底物，反应5 min,测定纯化羧酸酯酶D-lCarE5的酶学性质。结果表明D-lCarE5 的最适 pH7. 38 (图 4);经 1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38 和 pH8. 04 缓冲液下处理80 min，分别保持40%、90%和45%以上的活性(图5)。4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D_lCarE5活性的影响
在酶促反应体系中加入终浓度I mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以a-乙酸萘酯为底物，在40 °C、pH7. 38条件下，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D_lCarE5的酶活力。结果(图6)表明，终浓度I mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用。5、重组羧酸酯酶D_lCarE5的动力学参数的测定
在40 °C、pH7. 38条件下，以0.6 M a -乙酸萘酯为底物，依次在酶促反应的1-30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.005-0. 5 M a-乙酸萘酯为底物([S])，在40 V、pH7. 38和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度(V)，如图7，根据Lineweaver-Burk方法测定心 和fear。经测定,在40 °C、pH7. 38条件下，重组羧酸酯酶D-lCarE5对a -乙酸萘酯的命和Vmax分别为0. 948 mo I和534. 12U/mg。6、重组羧酸酯酶D_lCarE5对底物P -乙酸萘酯的水解
在60 °C、pH7.0条件下，重组羧酸酯酶D-lCarE5对0.6 mol/L ￠-乙酸萘酯的比活力为 14. 78±0. 01 U/mg。
权利要求
1.一种羧酸酯酶D-lCarE5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—种编码权利要求I所述的羧酸酯酶D-lCarE5的羧酸酯酶基因其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种包含权利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE5的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE5的重组菌株。
全文摘要
本发明涉及一种羧酸酯酶D-1CarE5及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。且本发明提供了上述羧酸酯酶的编码基因D-1CarE5，羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组载体和羧酸酯酶基因D-1CarE5的重组菌株。本发明的羧酸酯酶具有以下性质以α-乙酸萘酯为底物最适温度40℃；最适pH7.38；终浓度1mM的金属离子Mn2+和Zn2+对酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有较强的抑制作用；在温度35℃以下保温50min基本保持稳定；经1/15mol/LpH5.91、pH7.38和pH8.04缓冲液下处理80min，分别保持40%、90%和45%以上的活性；同时也能够水解β-乙酸萘酯；可应用于农药残留或农药污染治理方面。
文档编号C12N15/63GK102787107SQ20121025085
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者周峻沛, 唐湘华, 李俊俊, 杨云娟, 许波, 谢振荣, 黄遵锡 申请人:云南师范大学