专利名称：酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂盒，尤其是涉及一种采用环介导等温扩增技术的酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
酸土环脂芽抱杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)是一种嗜热、嗜酸、好氧的杆菌，是耐热菌(thermo-acidophilic bacteria, TAB)中污染果汁的主要菌种,其芽孢能经受酸性果汁加工中的巴氏杀菌而存活，在适宜的温度下可大量繁殖，引起果汁感官品质劣变，耐热菌超标是浓缩果汁产品最为严重的质量问题之ー(胡贻椿，岳出利，袁亚宏等.果汁中脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp.)的危害及其控制[J].食品科学，2008，29 (I) :364-368)。近年来，我国浓缩苹果汁行业取得了突飞猛进的进步，2010年我国 已经成为世界苹果浓缩汁的生产出口第一大国。2011年I 11月我国出口浓缩苹果汁数量为 54. 13 万吨，金额为 9. 36 亿美兀(http://www. 21food. cn/html/news/35/666252. htm(食品商务网))。目前，国际贸易中对果汁中耐热菌有严格要求，是苹果浓缩汁的必检项目，也是当前中国苹果浓缩汁出口中所遭遇的主要技术壁垒之一和苹果浓缩汁生产中急待解决的问题。目前，检测酸土环脂芽孢杆菌的方法主要有传统的微生物生理生化检测法和分子生物学的PCR法(孔德义，董佳，白小琼.脂环酸芽孢杆菌的研究进展[J].粮食与食品エ业，2011，18 (2):39-42),尚未见到用环介导等温扩增扩增技术检测酸土环脂芽孢杆菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种快速、特异性强且成本低的酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒。本发明的另ー目的是提供一种检测酸土环脂芽孢杆菌的方法。所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒包括I)环介导等温扩增反应液；所述环介导等温扩增反应液含有IOXThermopol反应缓冲液、10mmol/L dNTP、50mmol/L硫酸镁、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游外引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游外引物；酸土环脂芽孢杆菌上游外引物F3 :CGGGTAGGCATCTACTTGTG ；酸土环脂芽孢杆菌下游外引物B3 : GCGGAAGATTCCCTACTGC ；酸土环脂芽孢杆菌上游内引物FIP :GCCGTTACCTCACCAACTAGCTGAAAGATGCAACTGCATCGC ；
酸土环脂芽孢杆菌下游内引物BIP :GATGCGTAGCCGACCTGAGAGTGCCTCCCGTAGGAGTCT ；2) Bst DNA聚合酶含8个活性単位(U)/μ I ;3)显色剂SYBR GREEN I 突光染料，1000Χ ；所述检测酸土环脂芽孢杆菌的方法，使用所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒，所述方法包括以下步骤I)细菌DNA的提取2)环介导等温扩增；
3)显色检测。本发明的主要原理是利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA，在Ih内能达到IO9靶序列拷贝，可通过荧光染料来观察扩增效果。本发明的优点如下本发明米用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术建立了酸土环脂芽孢杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒和检测方法，此技术特异性強，与PCR方法有相同的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来检验，加入荧光染料目測观察即可，不用凝胶成像系统，简单快速，特别适合于基层食品检测机构和食品加工企业自检。米用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)方法检测酸土环脂芽孢杆菌，为食品安全监控提供新的科学依据。
具体实施例方式下列实施例是进一歩对本发明的说明，不应当作对本发明的限制。实施例I、制备酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒(I)环介导等温扩增反应液含有10 X Thermopol 反应缓冲液、10mmol/L dNTPs、50mmol/L硫酸续、5mol/L 甜菜碱，20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游外引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游外引物；(2)Bst DNA 聚合酶浓度 8υ/μ I;(3)显色剂SYBR GREEN I 荧光染料，1000X。如需要，制备后可将环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶和显色剂装入盒体内。实施例2、酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒的应用( I)被检样品的前处理——按常规方法提取DNA基因A取1.0 I. 5mL过夜培养的菌液，置于I. 5mL离心管中，用离心机IOOOOrpm离心5min,弃上清液；B加入I. OmL灭菌双蒸水,混勻，IOOOOrpm离心5min,弃上清液；C加入100 μ L灭菌双蒸水，混匀，100°C沸水浴IOmin ；D IOOOOrpm离心5min，取上清液至新的I. 5mL离心管中，此上清液即为待检细菌DNA。(2)用发明的试剂盒检测——环介导等温扩增A酸土环脂芽孢杆菌LAMP反应体系如表I所示。表I酸土环脂芽孢杆菌LAMP反应体系
权利要求
1.酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒，其特征在于包括 1)环介导等温扩增反应液； 所述环介导等温扩增反应液含有IOXThermopol反应缓冲液、10mmol/L dNTP、50mmol/L硫酸镁、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游内引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌上游外引物、20 μ mol/L酸土环脂芽孢杆菌下游外引物； 酸土环脂芽孢杆菌上游外引物F3 CGGGTAGGCATCTACTTGTG ； 酸土环脂芽孢杆菌下游外引物B3 GCGGAAGATTCCCTACTGC ； 酸土环脂芽孢杆菌上游内引物FIP GCCGTTACCTCACCAACTAGCTGAAAGATGCAACTGCATCGC ； 酸土环脂芽孢杆菌下游内引物BIP GATGCGTAGCCGACCTGAGAGTGCCTCCCGTAGGAGTCT ； 2)Bst DNA聚合酶含8个活性単位(U) / μ I ; 3)显色剂=SYBRGREEN I突光染料，1000Χ。
2.检测酸土环脂芽孢杆菌的方法，其特征在于使用如权利要求I所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒，所述方法包括以下步骤 1)细菌DNA的提取 2)环介导等温扩增； 3)显色检測。
全文摘要
酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法，涉及生物检测试剂盒。提供一种快速、特异性强且成本低的酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒以及检测酸土环脂芽孢杆菌的方法。所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂。检测酸土环脂芽孢杆菌的方法使用所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒，具体步骤细菌DNA的提取环介导等温扩增；显色检测。利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA，在1h内能达到109靶序列拷贝，可通过荧光染料来观察扩增效果。
文档编号C12Q1/68GK102732626SQ20121020685
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者周赞虎, 张海艳, 李可, 蔡开珍, 郑俊超 申请人:周赞虎