专利名称：芽孢杆菌制剂及其生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域。具体涉及一种用于治疗和预防动物细菌性肠道传染病的芽孢杆菌微生态制剂及其生产方法。
动物细菌性肠道疾病发生普遍而严重，是制约我国养殖业发展的重要因素。多年来，使用抗生素和化学药剂用于治疗和预防动物的细菌性肠道疾病十分广泛，造成耐药性病原微生物增加、防治效果下降，使治疗成本加大。同时，抗生素在环境和养殖产品中残留污染，造成了食物链的污染等副作用，进而直接影响人类的健康。
肠道微生物的生态平衡是发挥肠道微生物抵御细菌感染作用的关键之所在。由于过度的卫生管理和各种应激反应，使得动物肠道的微生物菌群失去生态平衡，一般的趋势是，乳酸杆菌类的数量下降，大肠菌群的数量上升。随着现代养殖条件下动物肠道微生态平衡失调问题的日益突出，导致幼龄家禽家畜生长缓慢及死亡的细菌性下痢在养殖业内普遍发生而且日趋加重。
活的微生物制剂又叫益生素，是用有益微生物的细胞和发酵产物制成的对宿主动物肠道微生态平衡具有调控作用的一类产品。该类产品可以使新生动物尽快形成其正常肠道微生物区系，可以使动物在使用抗生素或遭遇应激后尽快恢复肠道微生物平衡，从而达到预防疾病、治疗疾病、促进生长、提高产量的目的。常见的用于微生物制剂的菌种有嗜酸乳芽孢杆菌，保加利亚乳芽孢杆菌，干酪乳芽孢杆菌，瑞士乳芽孢杆菌，乳酸乳芽孢杆菌，唾液乳芽孢杆菌，植物乳芽孢杆菌，嗜热链球菌，粪肠球菌，屎肠球菌，双歧杆菌，大肠杆菌，芽孢杆菌等，它们大多是由动物肠道和动物体上分离获得的菌种，然后制成微生态制剂，用于动物有一定的效果，但作用动物种类范围有一定的专一性，受到一定的限制；而且多数微生物制剂是由两种以上的菌种制成的混合产品，构成了一种微生态体系，由于微生物生长特性的差异以及各种之间的相互作用，产品中各种微生物的数量会发生变化，造成其制剂的质量不稳定；许多益生细菌在产品中难以长期存活，对饲料加工中的高温等条件没有抵抗力，因此，其货架期较短，使用效果不稳定。据Pollamann(1986)统计，使用微生物添加剂效果不稳定，甚至无效，其原因是多方面的，除了制剂质量不稳定外，所使用的微生物菌株也是至关重要的。
自80年代以来，由于发现某些芽孢杆菌具有良好的益生作用，并且具有耐高温、耐酸碱和存活时间长的特点，因此，利用芽孢杆菌生产的微生态制剂用于饲料添加剂和医用微生物调节剂的研究日益增多，方兴未艾。例如，芽孢杆菌型微生态制剂已有含有一种或几种芽孢杆菌的复合微生物制剂(吕青专利公开号CN 1146865A1997)、两种或两种以上的复合芽孢杆菌微生物制剂(四川农业大学专利公开号CN 1089442A 1994)及单一芽孢杆菌微生物制剂，报道有穿刺芽孢杆菌制剂(厦门大学CN 1086663A 1994)、蜡样芽孢杆菌制剂(北京农业大学CN 1083862A 1994；康白1981)、地衣芽孢杆菌(中国人民解放军三零二医院CN 1087523A 1994)、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌制剂等，另外还有一些含有不明确菌种名称和菌株数量的芽孢杆菌制剂；而且在一些医用微生态制剂中，也含有芽孢杆菌，诸如整肠生(含地衣芽孢杆菌)、促菌生(需氧芽孢杆菌)、米雅BM(含芽孢杆菌)等。与该发明有关的，含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的制剂而言，有四川农业大学(专利公开号CN1089442A 1994)饲用微生物添加剂制造方法及用途，中山大学研制的枯草芽孢杆菌粉剂(郑勇力等，1998)和阎双强发明的枯草芽孢杆菌提取物微生态制剂(CN 1136437A 1996)。
四川农业大学(专利公开号CN 1089442A 1994)饲用微生物添加剂，由六种不同的芽孢杆菌制成的不同的微生态制剂，分别以一种到三种芽孢杆菌混合制成，其中单一的芽孢杆菌饲用微生态添加剂为蜡样芽孢杆菌制剂，其余由两种或以上组成，在某些品种中含有枯草芽孢杆菌，其菌种系中国菌种保藏中心商品菌种目录中公开的菌种，而使用牛肉膏、蛋白胨等动物性培养基，培养温度为32-37度，最适温度为37度，其用途主要用于微生物饲料添加剂；中山大学研制的枯草芽孢杆菌粉剂(郑勇力等，1998)，其菌株为BS964，特点是采用分子克隆技术获得的一株基因工程菌，具有卡那霉素抗性和外源的α-淀粉酶基因，采用肉汤培养基，培养温度为37度，其用途是主要用于促生长饲料添加剂；阎双强发明的枯草芽孢杆菌提取物微生态制剂(CN 1136437A 1996)，其菌株为KE930518，其特征是提取枯草芽孢杆菌有效成分，同时附加有枸杞等中草药成分等，主要用于人的防病保健。
综上所述，目前还未见到有专门用于动物细菌性肠道疾病的治疗和预防的达到现有抗生素效果的单一枯草芽孢杆菌活菌制剂。
本发明的目的在于提供一种由单一菌株生产的、生产成本低廉、用于治疗和预防动物细菌性肠道疾病效果显著的枯草芽孢杆菌制剂及其生产方法，以及该制剂的应用。
本发明提供的一种芽孢杆菌型微生物制剂，其特征是采用了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YK-1R菌株，其菌种保藏号为CGMCC 0420，以该菌株为菌种，采用单一菌株深层发酵的方法制备而成的含量为每毫升2亿-30亿的液体活菌制剂。
该菌种是从苜蓿植物上分离、纯化、经系统鉴定而得，菌种名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号为YK-1R，其特征为革兰氏染色阳性、在PDA培养基中培养，菌体短杆状至杆状、有时有几个菌体连接成链状，芽孢偏中生、孢囊不膨大或稍膨大，但不显著；pH值为7.5，产蛋白水解酶、淀粉酶、纤维素酶等、其菌体大小为0.6-0.8(微米)×0.2-0.4(微米)；在PMA培养基平板上生长，菌落扁平，边缘不整齐。其菌株的ERIC-PCR DNA指纹图谱见附图
中2泳道。
本发明提供的一种芽孢杆菌型微生物制剂的生产方法，采用芽胞杆菌为生产菌种，通过摇瓶菌种培养、种子罐、生产罐培养得产品，其特征在于采用如下步骤和方法摇瓶菌种培养取菌种保藏号为CGMCC 0420的枯草芽孢杆菌为菌种，采用马铃薯蔗糖培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，接种，摇床培养，温度为26-35℃，时间为10-28小时；种子罐培养培养基为植物性培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，接种量为1×106-100×106细胞/毫升培养基，气流搅拌，26-35℃培养18-24小时；
生产罐培养培养基为植物性培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，按培养基体积的1％-10％接种，通气，搅拌，26-35℃培养48-72小时，无菌条件下灌装即得到含量为每毫升2亿-30亿的液体活菌制剂。
在该制剂生产中，种子罐和生产罐的培养基组分及含量为玉米粉0.6-2.5％，豆饼粉0.8-2.4％，酵母粉0.1-0.3％，磷酸氢二钾0.5-1.5％，碳酸钙0.1-0.5％，水94-97.5％。
在该制剂的生产中，最佳培养温度为28-32℃；培养基的起始pH值最好为7.0-7.5。
为了保证生产菌种的纯度和产品的质量，本发明在生产过程中和产品检验中采用ERIC-PCR DNA指纹图分析方法，进行菌种纯度和产品质量的监控。
本发明的芽孢杆菌制剂，适用于动物细菌性肠道疾病的治疗和预防。特别适用于家禽家畜细菌性肠道疾病的治疗和预防。尤其对幼龄禽畜效果更好。
用于猪细菌性肠道疾病的治疗和预防治疗用量每头每次灌服该制剂10-15ml，日内给药1-2次，灌服1-3次；预防用量为每头每次3-8ml，1日给药1次，灌服1-2次，有效率可达95％以上。
用于鸡细菌性肠道疾病的治疗和预防治疗用量按1-3％添加量拌入该芽孢杆菌制剂到无抗生素雏鸡饲料中使用，2-3次；预防量为1-3％添加量拌入无抗生素饲料中使用，1-2次。有效率可达95％以上。
用于牛，尤其是牛犊细菌性肠道疾病的治疗每头每次灌服该微生态制剂为30-50ml，每日给药一次，2-3次；预防量为每头每次15-20ml，1-2次。有效率可达99％以上。
另外，本芽孢杆菌微生态制剂也可用作动物饲料添加剂。按千分之一至千分之十添加到无抗生素饲料中，促进动物生长，增产效果达2-12％。
附图，本发明芽孢杆菌与其它几种芽胞杆菌的ERIC-PCR DNA指纹图的比较。
图中1是1kb ladder；2是本发明枯草芽孢杆菌YK-1R；3是枯草芽孢杆菌1.1849；4是坚强芽孢杆菌1.2010；5是蜡质芽孢杆菌1.230；6是地衣芽孢杆菌1.105；7是巨大芽孢杆菌1.1741；8是环状芽孢杆菌1.2008；9是阴性对照。
与现有技术相比，本发明具有明显的特点和优良的效果。首先，本发明的菌种来源独特，它是从山西太原附近的植物上分离获得的，并采用ERIC-PCRDNA指纹图分析方法，与中科院微生物所菌种中心(北京)提供的芽孢杆菌属的六种芽孢杆菌进行了对比，本发明使用的枯草芽孢杆菌YK-1R菌株，其ERIC-PCR DNA指纹图与这六种芽孢杆菌有明显不同(参见附图)。第二，生产中所用培养基为植物性培养基，生长良好，成本低廉；第三，培养温度不同，该菌株的培养温度为28-32度，最适温度为30度；第四，产品的作用效果显著，不但对动物的细菌性肠道疾病具有预防作用，而且具有显著的治疗效果，总体预防和治疗率达95％以上，有时甚至可达99％以上，达到了现有抗生素和化学药物的治疗水平。
总之，本发明产品的特点1.菌种来源独特，适应范围广；2.菌种纯净，不易退化；3.单位菌量的效价高；4.治疗和预防效果显著，尤其对幼龄禽畜的细菌性下痢的治疗和预防有特效；5.有效期长，货架期长；6.产品采用DNA指纹图和分子探针等先进的质量控制体系，效果稳定；7.可替代抗生素和化学药物；8.使用安全，无毒副作用，无污染，无残留。
实施例1菌种培养按配方配制马铃薯蔗糖培养基，调整pH值为7.5，分装到20个500ml三角瓶中，每瓶100ml，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。取CGMCC 0420菌种，用接中环自斜面试管培养基菌种中挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上28℃培养，时间为16小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养容积为1.5吨，按配方配制培养基700立升，调整pH值为7.0，120-130℃活蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，空白镜检正常后，在火焰保护下，接种2L液体菌种，接种量约为3×106细胞/毫升，在28℃-30℃培养约20小时，进气罐压为0.09-0.10Mpa，出气罐压维持在0.03Mpa，取样，镜检菌体生长情况。菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
生产罐培养生产罐容积为5吨，按配方配制培养基3.5吨，调整pH值为7.0，120-130℃活蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，接种量为10％，自种子罐转接到生产罐中，生产罐在28℃-30℃培养60小时，进气罐压为0.09-0.10Mpa，出气罐压维持在0.03Mpa，机械搅拌速度为60-80RPM，待镜检发酵罐中培养菌体，有30％以上转成芽孢后，放罐。储存在储存罐中，在无菌状态下，分装，即得芽孢杆菌制剂，芽孢杆菌每毫升含量为2.3亿。
种子罐和生产罐发酵培养基配方玉米粉1.6％，豆饼粉1.8％，酵母粉0.3％，磷酸氢二钾1.0％，碳酸钙0.1％，余量为水。
实施例2菌种培养按配方配制马铃薯蔗糖培养基，调整pH值为7.0，分装到20个500ml三角瓶中，每瓶100ml，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。取CGMCC 0420菌种，用接中环自斜面试管培养基菌种中挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上30℃培养，时间为20小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养容积为1.5吨，按配方配制培养基700立升，调整pH值为7.4，120-130℃活蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，空白镜检正常后，在火焰保护下，接种4L液体菌种，接种量约为7×106细胞/毫升，在30℃-32℃培养约24小时，进气罐压为0.09-0.10Mpa，出气罐压维持在0.03Mpa，取样，镜检菌体生长情况。菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
生产罐培养生产罐容积为5吨，按配方配制培养基3.5吨，调整pH值为7.5，120-130℃活蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，接种量为5％，自种子罐转接到生产罐中，生产罐在30℃-33℃培养51小时，进气罐压为0.09-0.10Mpa，出气罐压维持在0.03Mpa，机械搅拌速度为60-80RPM，待镜检发酵罐中培养菌体，有30％以上转成芽孢后，放罐。储存在储存罐中，在无菌状态下，分装，即得芽孢杆菌制剂，芽孢杆菌每毫升含量为28.2亿。
种子罐和生产罐发酵培养基配方玉米粉0.9％，豆饼粉0.8％，酵母粉0.1％，磷酸氢二钾0.6％，碳酸钙0.4％，余量为水。
应用实施例3本发明芽孢杆菌制剂用于猪细菌性下痢的治疗和预防，治疗率和预防率达95％以上；用于促进生长，增长率为4.0-10％；本实验是在太原市种猪场完成的。一、实验材料动物大白猪，日龄1-2；下痢的大白猪仔猪药物实施例1、2生产的芽孢杆菌制剂二、实验方法1.对子猪黄白痢疾的预防将初生大白猪仔猪205头，1-2日龄，体重1.04±0.23kg，按生产母猪的编号随机分为两组，其中一组为试验组，一组为空白对照组。试验组仔猪104头，将芽孢杆菌制剂液体灌服每头仔猪，剂量5ml/头，给药1次。空白组为101头，未采用芽孢杆菌制剂预防。两组按常规的相同的管理方式进行管理，观察仔猪下痢情况，观察时间为35天。2.对仔猪细菌性下痢的治疗将下痢仔猪75头按母猪编号分为两组，其中一组为试验组，一组为对照组。试验组仔猪29头，将芽孢杆菌制剂灌服试验组下痢仔猪，剂量10毫升/头，一日一次，给药两次为1个疗程。对照组为46头，采取氟哌酸治疗，每头一日一次一粒，给药三次为一个疗程。各组按相同的方式进行饲养管理，观察记载仔猪下痢变化情况，观察从首次给药开始为7天。2.对仔猪促生长作用试验将1-2日龄仔猪205头，体重1.04±0.23kg，按母猪编号随机分为两组，一组为试验组，一组为空白对照组。试验组仔猪104头，将芽孢杆菌制剂液体灌服每头仔猪，剂量5ml/头，给药1次。空白组为101头，未灌服芽孢杆菌制剂。两组按常规的相同的方式进行管理，时间为35天，观察仔猪生长情况，在灌服益生素前后，分别称量仔猪体重。三、实验结果1.对仔猪黄白痢疾的预防对仔猪黄白痢疾的预防组别 数量剂量下痢数下痢率％试验组104 5ml 1 0.96对照组101 - 3433.66结果表明在给药后35天内，试验组104头仔猪，发现只有一头发生痢疾，下痢率为0.96％。对照组101头仔猪，中有34头下痢，下痢率达33.66％。3.对仔猪细菌性下痢的治疗对仔猪细菌性下痢的治疗组别 数量 止痢止痢率死亡死亡率(头) (头)％(头)％试验组2929 100 0 0对照组4642 91.3 3 6.5结果表明在给药后，试验一组29头下痢仔猪，全部止痢，止痢率为100％，其中给药一次后24小时内，止痢25头，止痢率为86％。对照组46头下痢仔猪，给药三次后，发现4头下痢，止痢率为91.3，然后再用庆大霉素治疗，4头下痢仔猪中有一头止痢，3头治疗无效死亡。3.对仔猪促生长作用试验对仔猪体重的影响组别 数量 使用前重量 试验后重量净增增长％(头) kg(X±SD)kg(X±SD) kg试验组1041.03±0.23 7.75±0.32*6.728.56对照组1011.04±0.24 7.23±±0.36 6.19结果表明试验组比对照组增0.53kg，与对照组比较增重8.56％。两组相比有显著性差异。
应用实施例4本发明芽孢杆菌制剂用于蛋鸡和雏鸡细菌性下痢的治疗和预防，治疗率和预防率达95％以上，蛋鸡产蛋增长率为2-12％，雏鸡体重增长率为4.0-10％；本实验是在山西忻州禽畜实业有限公司养殖场完成的。I、对雏鸡细菌性下痢的预防和促生长作用的实验一、实验材料动物雏鸡，日龄23，体重200±20g。
药物实施例1、2生产的芽孢杆菌制剂二、实验方法将800只23日龄的雏鸡，随机分为两组，每组400只，分别标记试验组和对照组。试验组，每只雏鸡分别在23、34日龄各灌服益生素1次，剂量为0.3ml/只，操作时轻拿轻放，轻轻掰开鸡嘴，以1ml注射器缓缓流出药液待其下咽后，放回育雏火炕上。对照组，未灌服益生素。试验组和对照组采用相同的管理，每天下午观察试验组和对照组雏鸡的活动、饮食情况，是否有鸡下痢，并观察试验组雏鸡对益生素是否过敏。23、42日龄时，称量雏鸡的重量，试验组和对照组分别随机取出10只雏鸡，称重，称重后放回鸡群，再随机取出10只雏鸡，分别进行5次，称量50只雏鸡，计算出每只雏鸡的重量并进行统计学处理。三、试验结果1.益生素对雏鸡下痢的预防作用组别 数量 剂量 下痢数下痢率只 (ml/只)(只) ％试验 4000.31 10.25对照组400- 4611.5试验组下痢率为0.25％，对照组为11.5％，说明本制剂对雏鸡具有下痢预防作用。2.益生素对雏鸡体重的影响益生素雏鸡体重的影响组别 数量 使用前重量试验后重量净增增长％只 g(X±SD) g(X±SD) g试验组400204±8.1 421±6.4*217 8.5对照组400205±7.9 405±10.5 200试验组比对照组增重17g，与对照组比较增重8.5％。说明益生素对雏鸡生长具有促进作用。3.对雏鸡应激反应的影响在整个实验过程中，雏鸡活动、饮食、毛色等均正常，且生长速度加快，说明本制剂应激作用较小。II、对蛋鸡细菌性下痢的治疗实验在同一鸡舍内，取患细菌性下痢的种蛋鸡40只，平均分为两组，一组为试验组，一组为对照组。试验组灌服实施例1、2生产的芽孢杆菌制剂，每只每次灌服0.5ml，一日一次，连续给药3天，对照组未进行任何方式的治疗，两组管理条件一致，观察时间为7天。结果表明试验组给药三天后，19只止痢，止痢率为95％，七天后产蛋率恢复到75％，一只治疗无效而死亡；对照组6只止痢，5只仍下痢，常卧不起，很少进食，9只死亡，自然止痢率为30％，死亡率为45％。
应用实施例5本发4明芽孢杆菌制剂用于牛，尤其是牛犊细菌性肠道疾病的治疗，有效率可达99％以上。
太原市小店奶牛厂，两头牛犊腹泻不止，经过庆大霉素、痢特灵止痢无效后，用该芽孢杆菌制剂治疗，第一次给药30ml，24小时后第二次给药，在第一次给药20小时，止泻，观察7天，无复发。
山西省山荫县奶牛养殖场，有一头连续7个月腹泻的奶牛，用该芽孢杆菌制剂治疗，一次50ml，给药两次，一天一次，给药两次后即止泻。另有两头消化不良的奶牛，饮食量少，产奶少，灌服该芽孢杆菌制剂，一次50ml，一天一次，给药两次后，饮食正常。
权利要求
1.一种芽孢杆菌制剂，其特征在于该制剂是采用菌种保藏号为CGMCC0420的枯草芽孢杆菌生产的活菌含量为每毫升2亿-30亿的液体活菌制剂。
2.按照权利要求1所述的芽孢杆菌制剂的生产方法，采用芽胞杆菌为生产菌种，通过摇瓶菌种培养、种子罐培养、生产罐培养得产品，其特征在于采用如下步骤和方法①、摇瓶菌种培养取菌种保藏号为CGMCC 0420的枯草芽孢杆菌为菌种，采用马铃薯蔗糖培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，接种，摇床培养，温度为26-35℃，时间为10-28小时；②、种子罐培养培养基为植物性培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，接种量为1×106-100×106细胞/毫升培养基，气流搅拌，30-32℃培养18-24小时；③、生产罐培养培养基为植物性培养基，pH值为6.5-7.5，灭菌，冷却至室温，按培养基体积的1％-10％接种，通气，搅拌，28-32℃培养48-72小时，无菌条件下灌装即得液体产品。
3.按照权利要求2所述的芽孢杆菌制剂的生产方法，其特征在于种子罐和生产罐的培养基组分及含量为玉米粉0.6-2.5％，豆饼粉0.8-2.4％，酵母粉0.1-0.3％，磷酸氢二钾0.5-1.5％，碳酸钙0.1-0.5％，水94-97.5％。
4.按照权利要求2所述的芽孢杆菌制剂的生产方法，其特征在于最佳培养温度为28-32℃。
5.按照权利要求2所述的芽孢杆菌制剂的生产方法，其特征在于最佳培养起始pH值为7.0-7.5。
6.按照权利要求1所述的芽孢杆菌制剂的用途，特征在于用于动物细菌性肠道疾病的治疗和预防。
7.按照权利要求6所述的芽孢杆菌制剂的用途，特征在于用于家禽家畜细菌性肠道疾病的治疗和预防。
全文摘要
本发明涉及一种芽孢杆菌制剂及其生产方法,以及该制剂的应用。其特征是采用从植物上分离、纯化的单一枯草芽孢杆菌菌株CGMCC 0420和深层发酵的方法制备而成的液体活菌制剂。该制剂系纯种发酵,其生产工艺简单,成本低,保存期长;采用DNA指纹图和分子探针等先进的质量控制体系使产品的纯度高,质量稳定;该制剂适用范围广泛,可用来替代抗生素和化学药物,对治疗和预防多种动物、尤其是幼龄动物的细菌性肠道疾病有特效。
文档编号A61K35/66GK1273097SQ0010512
公开日2000年11月15日 申请日期2000年3月29日 优先权日2000年3月29日
发明者赵立平, 赵艮贵, 李新峰, 李艳琴, 申泉 申请人:山西大学