一种诱变少动鞘脂单孢菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及冷结胶制备领域，具体而言，涉及一种诱变少动鞘脂单孢菌及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 结冷胶作为目前国际上性能最为优越的微生物多糖之一，具有动植物多糖不具备 的优良品质，其安全无毒、理化性质独特、生产周期短、不受气候和地理环境条件的限制，已 广泛用于食品、医药、化工、农业、陶瓷、石油等20多个行业。
[0003] 在食品工业中，结冷胶可作为优良胶凝剂，形成的凝胶透明度高，爽脆适度，风味 释放性好。另外，结冷胶与其它食品胶有良好相容性，通过调节混合比例可达到不同食品品 质要求。此外，结冷胶可与其它食品胶良好配伍，使食品能获得最佳感官、质构和稳定性。结 冷胶凝胶特性与卡拉胶、琼脂等相似，但其在使用量、透明度、热可逆性、风味释放、酸稳定 性等方面明显更优越。
[0004] 结冷胶于1978年由美国斯比?凯可（CP. Kelco)公司首次发现，并于1988年被日 本政府批准作为食品添加剂使用，1992年更是获得了 FDA安全认证，1994年被欧共体正式 列入食品安全代码表中，1996年我国也批准其作为食品添加剂使用。
[0005] 作为一种新型的食品添加剂，目前结冷胶年需求增长率在30%以上，具有极高的 商业利润和市场前景。但是，目前在结冷胶的大规模工业化生产中仍存在一些问题，其中在 结冷胶的生产中，随着产胶菌株传代次数的增加，菌种会产生极其明显的退化，导致产胶率 降低，并且最终产品指标也难以提高，严重限制了结冷胶的生产应用及发展；因此，寻找一 种改良的产胶菌株以提高产胶率和以及产胶指标是人们亟需解决的一个技术问题。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种诱变少动鞘脂单孢菌，所述的诱变少动鞘脂单孢 菌具有传代稳定、产胶率高的技术效果。本发明的第二目的在与提供一种诱变少动鞘脂单 孢菌的制备方法；通过该方法可实现稳定高产诱变少动鞘脂单孢菌的制备，且该方法操作 简单，易于实现。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种诱变少动鞘脂单孢菌，该诱变少动鞘脂单孢菌的分类命名为： 假单胞菌（Pseudomonas sp.)，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编为： 100101 ;保藏编号为CGMCC No. 10341 ;保藏日期为2015年01月12日。
[0010] 本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌，其以少动鞘脂单孢菌为出发菌株，通过 两次诱变而获得能够稳定传代的诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变少动鞘脂单孢菌能够稳定传 代，将其发酵培养（接种量为10% )后，其产胶率可达16. 25g/L，比相同条件下，没有经过 诱变的少动鞘脂单孢菌的产胶率提升了 25%以上。
[0011] 本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 1)、将少动鞘脂单孢菌（Sphingomonas Paucimobilis)菌株活化后接种到液体培 养基中振荡培养，得到培养后菌液；
[0013]2)、将所述培养后菌液离心，得到菌体；并将所述菌体以等体积的生理盐水制成菌 悬液；
[0014]3)、将所述菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80 秒，得到一次诱变菌液；
[0015]4)、将所述一次诱变菌液加入到体积分数为1. 5-2. 5%的DES溶液中，摇床震荡培 养35-45分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
[0016] 5)、将所述二次诱变菌液接种到琼脂培养基进行培养，并筛选菌落，得到诱变少动 鞘脂单孢菌。
[0017] 本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法，首先将少动鞘脂单孢菌活化 后利用等体积的生理盐水制成菌悬液；在进行第一次诱变的过程中，将菌悬液利用10-15 瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射60-80秒；紫外线辐射可以使少动鞘脂单孢菌 DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体，进而阻碍双链的解开，因 而影响了 DNA的复制和转录。另外，嘧啶二聚体的形成，还会减弱双键间氢键的作用，引起 双链结构扭曲变形，阻碍碱基正常配对；进一步的，将一次诱变菌液利用DES溶液诱变时， 由于硫酸二乙酯（DES)是一种单功能烷化剂，其活性烷基易取代少动鞘脂单孢菌DNA分子 中活泼的氢原子，并直接与DNA分子上的碱基及磷酸部分起烷化反应，进而使得菌株的DNA 在复制时，导致碱基配对错误而引起突变，最后通过琼脂培养基培养筛选，挑取菌落大，有 光泽，且菌落饱满的单菌落，从而得到诱变少动鞘脂单孢菌。该诱变方法操作方便、所需设 备简单、诱变频率高且不易回复突变。
[0018] 可选的，在步骤1)中：在所述活化的过程中，培养温度为28-32°C，培养时间为 22-26小时。
[0019] 可选的，在步骤1)中：所述振荡培养的过程中，培养温度为28-32 °C，培养时间为 16-20小时，摇床的转速为180-220转/分钟。
[0020] 可选的，在步骤2)中：所述离心的转速为3800-4200转/分钟，离心时间为18-22 分钟。
[0021] 可选的，在步骤4)中：所加入的一次诱变菌液与所述DES溶液的体积比为 (0? 4-0.8) :100。
[0022] 可选的，在步骤4)中：所述硫代硫酸钠溶液的质量浓度为22-27%。
[0023] 可选的，在步骤5)中，所述培养的时间为28h?48h，温度为29-31°C。
[0024] 可选的，在步骤5)中，所述琼脂培养基中含有氨苄青霉素。
[0025] 所述的诱变少动鞘脂单孢菌在生产冷结胶中的应用。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027] (1)、本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌，其传代稳定，具有更高的产胶率，而 且所产的结冷胶其粘度大，克服了现有技术中少动鞘脂单孢菌传代数次后出现菌种退化进 而导致产胶指标下降且产胶率不高的缺陷。
[0028] (2)、本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法采用紫外诱变加化学诱变两 种诱变方式制得制得诱变菌株，该两种诱变方式操作简单，所需的设备简易；而且诱变率 尚。
【附图说明】
[0029] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0030] 图1为本发明提供的诱变少动鞘脂单孢菌的制备流程图。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0032] 请参考图1，本发明提供的这种诱变少动鞘脂单孢菌的制备方法包括以下步骤：
[0033] 步骤101 :将少动鞘脂单孢菌（Sphingomonas Paucimobilis)菌株活化后接种到 液体培养基中振荡培养，得到培养后菌液；
[0034] 将少动鞘脂单孢菌活化后，接种到液体培养基中进行培养，保证菌种能够大量增 殖，为后续的诱变做好准备。
[0035] 步骤102 :将所述培养后菌液离心，得到菌体；并将所述菌体以等体积的生理盐水 制成菌悬液；
[0036] 利用液体培养基培养后的菌液，通过离心的方式收集菌体，再将该菌体利用等体 积的生理盐水制成菌悬液，生理盐水作为微生物的保护剂，通过稳定渗透压的作用防止菌 体细胞破裂，使得菌体免受损伤。
[0037] 步骤103 :将所述菌悬液利用10-15瓦且与菌悬液相距20-30厘米的紫外灯照射 60-80秒，得到一次诱变菌液；
[0038] 在一次诱变的过程中，需要控制紫外等的功率以及照射时间和距离；如果照射时 间太长，或者菌悬液与紫外灯的距离过近，则会造成菌种致死率上升；如果照射时间太短， 且紫外灯与菌悬液的距离太大，则会使得诱变效果不理想；因此，在本发明中，同时控制紫 外灯的功率、照射时间以及照射距离；进而实现最佳的诱变效果。
[0039] 步骤104 :将所述一次诱变菌液加入到体积分数为1. 5-2. 5%的DES溶液中，摇床 震荡培养35-45分钟后，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到二次诱变菌液；
[0040] 一次诱变结束后，将一次诱变菌液加入到体积分数为1. 5-2. 5 %的DES溶液，DES 溶液作为烷化剂，其活性烷基会取代菌体DNA分子中活泼的氢原子，直接与菌体DNA分子上 的碱基及磷酸部分起烷化反应，在菌体进行DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，从 而得到二次诱变菌液。
[0041] 需要指出的是，在该步骤中，体积分数为1. 5-2. 5%的DES溶液，其配置方法为：取 DES置于无菌试管中，加入少量乙醇使其溶解，再加入适量pH7. 0的磷酸缓冲液，以得到体 积分数为1. 5-2. 5%的DES溶液。
[0042] 步骤105 :将所述二次诱变菌液接种到琼脂培养基进行培养，并筛选菌落，得到诱 变少动鞘脂单孢菌。
[0043] 二次诱变菌液直接接种到琼脂培养基上进行培养，待其长出菌落后进行筛选，挑 取菌落大，有光泽且菌落饱满的单菌落，该菌则为诱变少动鞘脂单孢菌。
[0044]另外，该诱变少