专利名称：嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌株，尤其涉及一种嗜热脱氮芽孢杆菌G1788及其筛选和应用。
背景技术：
在微生物应用工程中微生物采油是一个新兴的具有重大应用前景和经济价值的领域。一个油田经过一次和二次采油后，仍有60-65％的原油采不出来。油田经过多年的注水开发后将进入高含水期，面临开采难度大，成本高，采收率低等难题(例如我国东部的主要油田)。常用来解决此问题的热力驱，化学驱和混相驱等三次采油法虽然有一定作用，但各有其严重的缺点。热力驱的热能利用率低；化学驱和混相驱所注入的化学物质残留地层时间长，破坏地层，污染环境，同时地上设备要求复杂。微生物采油是生物工程技术在油田开发领域的开拓性应用，具有成本低，适应性强，作业简单，对地层无伤害和没有污染等优势，在世界上引起广泛的重视，作为第四种独具优势的三次采油技术，成为石油开采技术中研究和实践的热点和前沿。
微生物采油是与微生物有关的提高采收率技术方法的总称，即利用微生物提高石油采收率的技术。其基本技术方法分为两大类一类是地面发酵法；另一类是地下发酵法，即将油藏作为巨大的生物反应器，让微生物在地下发酵。地下发酵法又分两类一类是针对油藏原有的微生物，选择合适的营养物质注入地层，激活原有的微生物；一类是针对油藏特点，筛选出合适的微生物菌种，经培养和发酵连同营养物一起注入地层，本发明即是这一类技术中筛选到的优良菌种。按照作业方式，注入微生物和营养物的微生物采油方法可分为四类(1)周期性注入微生物采油(又称单井吞吐)，(2)微生物驱油，(3)选择性封堵，(4)微生物清防蜡处理。其中微生物提高采油率技术主要指微生物驱油，即将细菌和营养物由注水井注入目的地层，经微生物的代谢作用于油层，使原油流动性提高，易于采出。
微生物采油的机理十分复杂，目前的研究普遍认为有几种机制可以解释微生物采油。(1)微生物可将重质油分解为轻质油或其它产物，从而降低原油粘度，增加其流动性。(2)微生物在油藏内代谢活动产生的CO2和CH4等气体可以提高油层内部的压力，促进原来不连续的原油区粘连成片，便于开采。(3)微生物能够产生多种表面活性剂(如脂肪酸，脂多糖和葡聚糖等)，降低石油与岩石之间的表面张力，改善石油的流动性能，提高水驱的效果。(4)微生物菌体及其分泌的高聚物可以有选择的堵塞渗透率较高的岩层，使液体转向渗透率较小的孔隙，提高水驱和气驱效果。(5)微生物产生的酸性物质能溶解岩石，增加地层渗透率，从而改善油层渗流。虽然采油机理还在不断的研究探索当中，微生物采油技术已经得到广泛的应用，并取得了很好的经济效果。
微生物采油获得成功的最关键环节是寻找和利用具有优良性能的菌株，该菌株必须能适应所用油藏的温度，压力和盐度等环境条件，其中最重要的是温度条件。因此在高温油藏进行采油，菌种的嗜热性就特别重要。本发明中的菌种是经过特殊方法筛选到的耐高温菌株，生长温度范围较大，并适合在高温的油藏环境中生长。降解原油中的烷烃从而提高原油的流动性是微生物采油的一个重要机制，本发明的菌株能利用石油为唯一碳源并有很好的降解烷烃的能力，对原油有很好的降解作用，具备微生物采油用菌的优秀品质。该菌种具有降解石油的性能，其在某些含有石油的物质中生长和进行代谢活动，可以对这些物质起到良好的去石油净化作用。目前，在人们生活的环境中，由于石油工业的发展，在开采、运输和生产中产生石油污染，有很多被石油污染的物质，对环境的污染非常严重，例如含有石油的污水，原油在环境中的泄露等。应用本发明筛选的菌株可以很好的将这些物质中的石油降解，起到净化污染物的效果，在环境保护中起到重要作用。
本发明的菌株属于嗜热细菌，而嗜热细菌的酶几乎全是热稳定性的。嗜热细菌酶的耐热性主要是由酶蛋白分子的内部结构所决定的。研究表明，酶本身的一级结构对其耐热性具有重要作用。酶的一级结构中某些关键区域的个别氨基酸改变，就会引起高级结构的变化，使酶蛋白结构中的氢键、离子键或疏水键稍有增加，从而提高整个分子的热稳定性。嗜热细菌可以随温度的改变而改变所合成酶的耐热性，也可通过已有酶蛋白的构型的改变而改变它的耐热性。从嗜热菌中分离的酶具有一些优良的生物学性质，如热稳定性，以及对化学和物理变性剂，有机溶剂，极端Ph等不利因素的抗性等。这些性质不仅可以作为设计和改造酶类的依据，而且在工业生产中极具应用价值。
本发明细菌具有降解石油，分泌表面活性剂等功能，这些作用导致石油粘度的下降，石油流动性增强，而石油流动性对石油工业具有极大的影响。首先在石油开采时，石油流动性强，就易于采出，对设备和采油作业的工程处理和要求降低，减少了采油的成本，提高了效益。其次，石油运输中无论是经管道或利用其他运输工具，高流动性都是一个极为有利的特性。例如用管道运输，如果石油流动性差，就必须采用升温、加压等手段，这样就耗费了大量的运输间接成本。本发明的细菌在增强石油流动性上有显著效果，因此本菌株的应用将极大地提高石油运输的效益。
综上所述，本发明筛选的菌株可以应用到石油开采业、石油运输业、环境保护业和其他相关工业生产中。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中存在的上述缺点，而提供一种嗜热脱氮芽孢杆菌G1788及其筛选和应用，其筛选的菌种属于土壤芽孢杆菌属，耐高温，具有很好的热稳定性能，可以在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中应用；其能利用原油作为唯一碳源，在油藏环境中生长良好，具有很好的降解烷烃的能力；该菌株在油藏中利用原油为营养来源的生长与代谢活动改善了原油的性质，具有降低原油黏度的性质，提高石油的流动性能，从而可以有效提高石油的采收率和石油运输的效率；利用其良好的降解石油的能力，可以处理净化被石油污染的污水等物质，在环境保护中起重要作用；该菌株还具有降低物质表面张力的功能，因此可在制备表面活性剂工业中应用。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株，其特征在于，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-1228。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，由油田地层水样中的菌种作为筛选的初始菌种，经初筛、复筛、接种、驯化扩增得到该菌株。
前述嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的筛选方法，其中所述初筛为在营养琼脂平板73℃培养筛选，再用以原油为碳源的无机盐培养基，73℃油浴震荡培养，进行乳化分散实验，取分散效果好的菌株；所述复筛为在乳化分散实验和降粘降凝实验中，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最优菌；将得到的最优菌反复接种液蜡无机盐培养基，73℃驯化扩增，得到该菌株。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的优化培养基，包括碳源、氮源、无机盐；其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖或淀粉；所述氮源为硝酸钠、硫酸铁、硫酸镁、磷酸氢钠和磷酸氢甲；所述培养基的PH为6.5至7.5。
前述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的优化培养基，其中所述碳源选用蔗糖，用量为0.1％；所述氮源选用硝酸钠，用量为0.1％至0.4％；酵母粉用量为0.05％；所述无机盐用量为基础培养基无机盐用量的1.5至2倍。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在石油开采业、降解石油烃、净化含石油物质、石油运输业中的应用。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在需要热稳定酶的工业生产中的应用。
本发明嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在制备表面活性剂中的应用。
前述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的应用，其中含石油物质为含石油的污水等。
前述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的应用，其中需要热稳定酶的工业生产是发酵工业生产。
四
图1为16SrDNA进化树示意图。
图2为持家基因araA进化树示意图。
图3为持家基因Mdh进化树示意图。
图4为持家基因recN进化树示意图。
图5为本发明筛选菌种以石油为唯一碳源生长曲线示意图。
图6为本发明筛选菌种对石油原样降解情况检测曲线示意图。
图7为本发明筛选菌种对发酵一天石油降解情况检测曲线示意图。
图8为本发明筛选菌种对发酵三天石油降解情况检测曲线示意图。
图9为本发明筛选菌种对发酵五天石油降解情况检测曲线示意图。
图10为本发明筛选菌种对发酵九天石油降解情况检测曲线示意图。
图11为本发明筛选菌种对发酵十四天石油降解情况检测曲线示意图。
图12为本发明筛选菌种对发酵二十一天石油降解情况检测曲线示意图。
图13为本发明筛选菌种对发酵二十八天石油降解情况检测曲线示意图。
图14为本发明筛选菌种对C12烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图15为本发明筛选菌种对C17烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图16为本发明筛选菌种对C19烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图17为本发明筛选菌种对C25烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图18为本发明筛选菌种对C35烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图19为本发明筛选菌种对C46烷烃不同发酵时期降解情况曲线示意图。
图20为本发明筛选菌种对石油成分降解情况曲线示意图。
图21为本发明表面活性剂提取方法工艺流程图。
图22为本发明表面张力结果示意图。
五具体实施例方式
(一)微生物名称和保藏情况。
嗜热脱氮芽孢杆菌G1788(Geobacillus thermodenitrificans G1788)，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)进行保藏，其保藏号为CGMCC-1228。
(二)菌株的特征与鉴定。
1、G1788菌株的形态和生理生化特征。
根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英等编著，北京科学出版社2001.2，ISBN7-03-008460-8)及《Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology》(Ninth Edit ion)对G1788菌进行了鉴定，其结果如下G1788菌株的细胞呈长杆状，大小为0.6～1.0×3.1～6.5μm，Gram氏染色阳性，周生鞭毛，能运动；有芽孢，芽孢端生或次端生，椭圆或稍膨大；菌落大而干燥，具皱折边缘。接触酶阳性，能水解明胶、淀粉；能还原硝酸盐和亚硝酸盐；不能水解酪朊；不能利用柠檬酸盐；其它特征如表1所示。
表1 G1788的形态及生理特征
2、G1788糖发酵实验。
采用API 50 CHB/E糖培养基和试验条(Bio+Mèrieux，Marcyl’ètoile，France)，接种G1788进行培养，在培养期间，若糖发酵产酸，致使pH下降，以指示剂的颜色变化予以表示。试验结果见表2所示。G1788能利用甘油、核糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、淀粉、D-松二糖发酵产酸；并能微弱利用肌醇、N-乙酰-葡糖胺产生少量的酸。G1788不能发酵D-阿拉伯糖、鼠李糖等其它糖类。David J等(FEMSMicrobiology Letters，1999，17285～90)、Manachini等(Int.J.Sys.Evol.Microbiol，2000，501331~1337)认为嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)能水解淀粉、核糖、三丁酸甘油酯(tributyrin)和木聚糖；能还原硝酸盐和亚硝酸盐产气；能发酵阿拉伯糖、纤维二糖、松叁糖、蜜二糖、海藻糖、产酸；但不能发酵半乳糖和鼠李糖产酸；菌落有羽毛状边缘。G1788具有与嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)相同的形态和生理生化特征，据此鉴定G1788属于嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)。
表2 G1788对API 50 CHB/E糖培养基实验结果
3、通过对16S rDNA和持家基因的进化分析，确定细菌分类。
16S rDNA广泛存在于真核和原核生物，功能稳定，由高度保守区和可变区组成，一般认为是研究系统进化关系的最好材料之一。16S rDNA分子大小为1500bp左右，所代表的信息量既能反应生物界的进化关系，又较容易进行操作。同样，持家基因也是细菌进化分析的好材料。16S rDNA和持家基因的进化分析是随着生物信息学发展起来的新方法，将这些保守的基因序列与现有的其他细菌的相应基因序列进行类比分析，可以清晰准确的确定所要分析菌株的种属关系。
对G1788的16S rDNA和持家基因araA、Mdh、recN做进化分析，将G1788的16S rDNA和持家基因araA、Mdh、recN测序，在GENEBANK等数据库中进行BLAST(序列联配分析)，得到与G1788种属相近的多种细菌的相应基因序列，然后利用生物信息学软件对这些基因序列进行对比，根据他们的进化关系绘制出进化树，取亲缘关系较近的结果，参阅图1至图4所示。
G1788的16SrDNA与Geobacillus thermodenitrificansT1660的核酸序列相同性为99％；araA基因与Geo thermodenitrificans的核酸序列相同性为95％；mdh基因与bacillus thermodenitrificans-m的核酸序列相同性为99％；recN基因与Geo-thermodenitrificans的核酸序列相同性为99％。G1788与以上比较的细菌都是Geobacil lus thermodenitrificans，结果都是在所有细菌中相同性最高的。以上结果表明G1788与Geobacillusthermodenitrificans的细菌菌株相似关系最密切，可以认定G1788属于Geobacillus thermodenitrificans(嗜热脱氮芽孢杆菌)。
(三)菌种的筛选。
1、菌种的筛选步骤。由本室菌种和大港油田地层水样中的菌种作为筛选的初始菌种。(1)初筛营养琼脂平板73℃培养筛选，再用以原油为碳源的无机盐培养基，73℃油浴震荡培养，作乳化分散实验，取分散效果好的菌株。(2)复筛做乳化分散实验和降粘降凝实验，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最优菌G1788。(3)将G1788反复接种液蜡无机盐培养基，73℃驯化扩增，得到该高温菌株。
乳化分散试验250mL三角瓶，每瓶装100mL无机盐培养基和2g脱水原油，121℃灭菌30min，接种量10％。73℃下密封，油浴振荡培养7天。室温静置冷却，肉眼观察乳化分散效果，分为“4-”到“4+”八个等级，以不挂壁，颗粒细小均匀，振荡能形成均匀悬浊液且呈墨汁状者为最佳(“4+”)，水相测PH值，表面张力，油相测原油降解率。(无机盐培养基Na2HPO40.06；KH2PO40.02；NaNO30.2；CaCl 20.001；FeSO40.001；MgSO40.03；酵母粉0.05；蔗糖0.1；pH为7.2。基础培养基无机盐培养基加入液蜡或原油，用于乳化分散实验等)降粘降凝实验250ml三角瓶，每瓶装30ml无机盐培养基和40g脱水原油，121℃灭菌30min，接种量每瓶30ml，73℃下密封油浴振荡培养7天。室温静置冷却后放4℃冰箱，油层彻底凝固后取出脱水，脱水三次，油相在50℃下测粘度，按《石油分析评价》(石油工业出版社2000第34-35页)中的方法测定凝固点。
经以上的实验步骤筛选到对降解石油效果最佳的G1788。
筛选得到的嗜热脱氮芽孢杆菌G1788已经保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center)进行保藏，其保藏号为CGMCC-1228。
2、菌种培养基的优化(培养基中的百分比含量的意义为每100毫升溶液中的溶质克数。例如，葡萄糖1％表示100毫升溶液中含有1克的葡萄糖)。
试剂肉汤培养基(％)牛肉膏0.4；蛋白胨1；NaCl 0.5。
营养琼脂培养基(％)肉汤培养基+1.8％琼脂粉方法使用营养琼脂平板菌落记数法。
(1)单因子试验。
表3为碳源、氮源、生长因子的选择
(培养基另外按2％的比例加入液腊；无机盐成分同基础培养基；葡萄糖或蔗糖、淀粉数量为0.1％，NaNO30.2％，其它氮源按与NaNO3相同的摩尔浓度加入。)结果表明，以蔗糖为碳源、以NaNO3为氮源、有生长因子的条件下生长最好。
(2)无机盐组成的选择如表4所示。
表4无机盐组成的选择
以上无机盐浓度同无机盐培养基，结果表明当表中5种无机盐成分完全时菌种生长最好。
(3)最佳pH的选择如表5所示。
表5最佳pH的选择。
结果表明pH7.2是最佳培养条件。
(4)最佳培养方案的确定，参阅表6所示。
将四个因素按两种不同水平进行正交实验。按L8(27)设计表头，以第1，2，4，7组成实验计划。
NaNO3(％) A1 0.2；A2 0.4蔗糖(％) B1 0.1；B2 0.2酵母粉(％)C1 0.05；C2 0.1无机盐D1(同无机盐培养基)；D2(为D1的两倍)表6正交实验结果
经统计分析表明，B因素，C因素为主要影响因素，根据以上实验，选择B1，C1，A2和D2为最佳培养基，即NaNO30.4％，蔗糖0.1％，酵母粉0.05％，无机盐为基础培养基的两倍。
(5)验证实验结果如表7所示。
表7验证实验结果
结果表明优化培养基明显好于液蜡基础培养基。
(四)本发明的有益使用效果。
1、适应地层环境。
(1)在73℃地层水中生长良好。
分别用地层水和蒸馏水配制液腊基础培养基，73℃培养4天，比较生长情况，如表8所示。
表8该菌种对地层水适应良好
地层水由大港油田提供，其离子类型和含量为(单位mg/L)Na+K+6075；Mg2+87；Ca2+298；Cl-9874；SO42-37；HCO-3419。地层水矿化度高，且含有内源微生物，与蒸馏水有很大差别。但以上结果表明地层水及其中的内源微生物并不影响菌种生长，该菌在地层水中生长正常，适应良好。
(2)地层水培养条件下的乳化分散试验。
原油降解率测定精确称量2.00g脱水原油做乳化分散试验，发酵液过滤，用一定量的正己烷收集全部未降解原油，适当稀释，254nm下测OD值，以未上摇床的空白对照为标准，计算残余油量，进而计算原油降解率，如表9所示。
表9原油降解率。
由上表可见地层水(不灭菌)培养条件下，G1788对原油的作用比地层水(灭菌)培养时效果好，表明地层水和其中的内源微生物并不抑制高温菌的生长，也不影响高温菌对原油的作用，地层水(不灭菌)培养条件下的原油降解率比蒸馏水培养条件下显著提高，表明G1788适应该油藏的水及与其他微生物的环境，可以在油藏中进行正常的生长，并能有效的降解原油。
2、耐高温。
(1)菌种生长的温度范围如表10所示(采用营养琼脂平板划线法接种，在不同温度下培养，观察生长情况)。
表10菌种生长的温度范围。
该菌种生长温度范围为45℃～78℃。
(2)不同温度下的生长情况如表11所示(使用营养琼脂平板菌落记数法，做60℃、65℃、73℃下的生长曲线)。
表11不同温度下的生长情况
在24小时菌浓可达到108个/ml，培养可选择优化培养基65℃培养24小时。
(3)生长温度曲线如表12所示(使用营养琼脂平板菌落记数法，分别在以下温度培养两天，测菌浓，作生长温度曲线)。
表12生长温度曲线 最佳生长温度范围在60℃到73℃。
(4)冻溶对细菌生长的影响，如表13所示的耐低温性能测定数据(使用营养琼脂平板菌落记数法，将原菌液置冰箱(-20℃)冷冻如下表中时间后，测菌浓)。
表13耐低温性能测定数据 G1788经受一定时间的冰冻后菌的浓度基本不变，耐低温性能良好。菌种良好的耐低温性对于冬季矿场应用有很大的意义。
3、能够以石油为唯一碳源生长，参阅图5所示。
在BSM培养基中添加2％的葡萄糖或石油，利用菌落记数法测定生长情况。
G1788能够在以石油为唯一碳源的培养基中生长良好，与在葡萄糖培养基中生长相比，其延迟期稍长，对数末期生长量稍低。(BSM培养基1000ml中含有KH2PO42.44g，Na2HPO15.57g，NH4CL 2g，MgCL20.2g，CaCl20.001g，FeCl3·6H2O 0.001g，MnCl2·4H2O 0.004g，PH＝7.2.)4、能够降解石油。
(1)菌株对原油的作用效果。
做乳化分散实验和降粘实验，以原油为唯一碳源，73℃油浴振荡培养时间分别为5，10，15，20天，设对照组(不加微生物，培养条件与实验组相同)和实验组(加入G1788)，A、发酵液的PH值变化情况如表14所示。
表14发酵液的PH变化数值 B、表面张力变化情况如表15所示。
表15表面张力变化数值 C、对原油的降解作用(降解率％)如表16所示。
表16原油的降解率 B、对原油的降粘作用(降粘率％)如表17所示。
表17原油的降粘率 (5)原油凝固点(℃)如表18所示。
表18原油凝固点(℃) 以上结果表明G1788显著提高了原油的降解率，并降低原油的表面张力和凝固点，使原油的粘度显著下降；经过G1788作用的原油降解率提高，流动性增加，易于开采，表明G1788的应用可以提高原油采收率。
(2)采用分光光度法测定菌株对石油的降解，结果如表19所示。
A、在高温无机盐培养基中添加2.00g石油，培养G1788并测定生长情况。G1788能在该培养基中生长良好。本试验中使用的高温无机盐培养基KH2PO40.34％，Na2HPO40.15％，(NH4)2SO40.4％，MgSO40.07％，酵母粉0.05％，pH为7.2。
B、做乳化分散实验分别发酵120h和168h，到时间后静止摇瓶30min观察石油乳化情况，发酵120h和168h的摇瓶与对照相比，大部分石油均匀分散在水相中，只有少量石油残渣漂浮在水相表面，发酵168h的残渣比120h少。
C、使用正己烷对石油进行稀释，测定全波长吸收，发现在250nm处有明显的吸收峰，石油含量与A250nm呈正相关关系，R2＝0.9975，y＝0.0137x。做1-5天的乳化分散实验，使用正己烷萃取发酵培养基中石油，适当稀释后测定A250nm，根据标准曲线计算石油含量。
表19石油的降解结果数值
经过G1788的生长代谢，培养基中的2.00g石油在五天内逐步下降，在第五天已经降解至0.38g，可见G1788促进石油降解的作用显著。(注分光光度法是较为粗略的方法，受较多因素影响，多作为定性的实验方法而不是定量方法，但在本实验中已经十分明显的表明G1788对降解石油有良好的作用)。
(3)采用气相色谱法分析石油降解情况。
A、仪器设备及试剂。
a、仪器与设备KS501数字化水平摇床Agilent Technologies 6890N气相色谱仪色谱柱varian cp7542
长10米内径0.53毫米膜厚0.17微米MaxTem450℃B、分析条件进样口温度为400℃，压力为3.6Kpa，冷柱头进样；炉温采用程序二阶升温法，起始温度60℃，速率5℃/min；终点温度250℃，速率4℃/min；终点温度380℃，恒温10min；检测器采用氢火焰检测器，检测条件温度400℃，辅助为N2(流速20ml/min)，H2流速为40.0ml/min，空气流速为450.0ml/min。
(4)细菌培养与样品处理。
A、使用的培养基。
a、LB培养基蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，NaCl为1％，pH为7.0；b、液蜡诱导培养基Na2HPO4为0.06％，KH2PO4为0.02％，NaNO3为0.4％，CaCl2为0.001％，FeSO4为0.001％，MgSO4为0.003％，酵母粉为0.1％，蔗糖为0.5％，pH为7.2，2％液蜡；c、高温无机盐培养基KH2PO4为0.34％，Na2HPO4为0.15％，(NH4)2SO4为0.4％，MgSO4为0.07％，酵母粉为0.05％，pH为7.2；d、普通琼脂斜面或平板培养基NaCl为0.5％，蛋白胨为1％，牛肉膏为0.4％，琼脂粉为3％，pH为7.2~7.5；以上培养基均在121℃灭菌30min后使用。
B、菌种培养。
a、将甘油冻存管中菌种接种挑取3环接到80mL LB摇瓶，在65℃，120rpm的条件下，振荡培养24h；b、转接到液蜡诱导培养基50mL中，振荡培养24h；c、再转接到100mL液蜡诱导培养基中，在同样条件下培养24h；
d、转接100mL高温无机盐培养基中，在同样条件下进行培养，在不同发酵时间取出，测定该菌体对石油的降解率；e、接种量均为10％。
C、样品处理。
将发酵液倒入250mL的分液漏斗中，再将100mL的正己烷分三次加入，每次都先倒入摇瓶中，用胶塞塞紧，在水平摇床上200r/min，振荡30～60min，再移入分液漏斗中，旋转振荡，静置过夜。
用微量取样器小心的将分液漏斗中的上层清液取出，12000r/min，离心两次，放入零下20度的冰箱保存备用。
石油原样的处理方法准确称取2克石油，用100mL正己烷稀释，振荡混匀，12000r/min离心两次，放入零下20度的冰箱保存备用。
D、气相色谱对不同发酵时期石油降解情况的测定，石油原样为2％，结果参阅图6至图13所示。
5、烷烃降解情况的比较，参阅图14至图20所示。
由以上的图可以看出，直链烷烃的降解主要集中在前三天，对于C12、C17、C19来说前五天的降解变化率最大，对于C25在前三天有明显的降解，可到了后几天，含量却逐渐增加，甚至比第一天还多(1.073倍)，这可能由于是高分子量的直链烷烃降解到了二十五个碳左右的烷烃，引起了该烷烃的增加；C35在第五天时的上升也是因为更高碳数的烷烃降解；C46的降解效果非常好。结果表明本发明筛选的菌种在石油降解中可以很好地降解长至46个碳的长链烷烃。本实验采用内标法测定不同发酵时间的石油降解情况，由于菌体乳化石油的现象很明显，为了减少实验的系统误差，决定以第一天降解情况为基础，与其比较得到降解率。如果以未降解的原始石油为基础那么降解效果会更明显。
综上，本发明提供的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株G1788，属于土壤芽孢杆菌属，其具有耐高温，能利用原油作为唯一碳源，而在油藏环境生长良好的性能，因此该菌株能够通过在油藏中利用原油为营养来源的生长与代谢活动改善原油的性质，从而很好的降解烷烃，提高石油的流动性能，有效达到提高石油采收率的效果。
本发明提供的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株G1788的又一有益的使用效果是，通过该菌种具有降解石油的性能，使其在某些含有石油的物质中生长和进行代谢活动，可以对这些物质起到良好的去石油净化作用。目前，在人们生活的环境中，由于石油工业的发展，在开采、运输和生产中产生石油污染，有很多被石油污染的物质，对环境的污染非常严重，例如含有石油的污水，原油在环境中的泄露等。应用本发明筛选的菌株可以很好的将这些物质中的石油降解，起到净化污染物的效果，在环境保护中起到重要作用，特别是石油污染处理技术领域中有重要的应用价值。
6、本发明筛选的菌种在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中的应用。
研究表明，嗜热菌中分离纯化出的酶具有很好的热稳定性，可应用于工业生产、科学研究等多个方面。
嗜热细菌的酶几乎全是热稳定性的。嗜热细菌酶的耐热性主要是由酶蛋白分子的内部结构所决定的。研究表明，酶本身的一级结构对其耐热性具有重要作用。酶的一级结构中某些关键区域的个别氨基酸改变，就会引起高级结构的变化，使酶蛋白结构中的氢键、离子键或疏水键稍有增加，从而提高整个分子的热稳定性。嗜热细菌可以随温度的改变而改变所合成酶的耐热性，也可通过已有酶蛋白的构型的改变而改变它的耐热性。
从嗜热菌中分离的酶具有一些优良的生物学性质，如热稳定性，以及对化学和物理变性剂，有机溶剂，极端Ph等不利因素的抗性等。这些性质不仅可以作为设计和改造酶类的依据，而且在工业生产中极具有应用价值。
利用嗜热菌产生的嗜热酶作为生物催化剂有许多优势(1)酶制剂的成本降低，稳定性提高，可在室温下分离提纯和包装运输，并能长久地保持活性。
(2)可以加快动力学反应的速度。
(3)对反应的冷却系统要求降低，从而可降低能耗，这样既可降低成本又可减少冷却过程对环境造成的污染。
(4)在嗜热酶催化反应的条件下，很少有杂菌污染，可减少对产品的污染，提高产物的纯度，简化其提纯过程。
(5)使生化过程可以在高温下进行，以增加难溶物质的溶解性和可利用性，降低有机化合物的黏度而有利于化合物的扩散和混合。
由于以上原因，本发明中的嗜热菌株及其产生的嗜热酶在食品、化工、制药工业及环保等方面有着广阔的应用前景。同样，与本菌株特性相关的酶，如降解长链烷烃的酶，分泌的表面活性物质等也具有广泛的应用前景。嗜热酶在嗜热菌中由相应的基因编码和被表达，为了降低酶的生产成本，现在通用的方法是用基因工程技术，将编码嗜热蛋白酶的基因提取出来，装载到质粒中，在将含该基因的质粒导入某种细菌中，建立一个高效的表达体系来大量生产这种嗜热酶。同样，降解石油烃的酶和合成表面活性物质也是由相应的基因编码和表达或合成的，也可以通过相同的基因工程技术进行大量生产。基因工程技术已经是生物以及相关产业中的常规方法，所有本发明菌株特性相关的基因和蛋白酶或其他有益的物质均可以利用基因工程技术大规模提取和应用。
7、本发明筛选的菌种具有分泌表面活性剂的特性。
本发明筛选的菌种中具有产生的降低表面张力相关物质或表面活性物质，用该菌做乳化分散实验，利用经乳化分散实验后的培养液做表面活性剂分析。
(1)表面活性剂提取方法的确定如图21所示。
(2)表面活性剂的分析粗产物的定量测定将旋转薄膜蒸发后的干产物用氯仿溶解，移至已称重的小瓶中，称重。
定性分析薄层层析法。采用两步展开法，先用石油醚∶乙醚∶醋酸(体积比80∶20∶1)展开，前沿离薄层顶端1cm左右处停止，再用氯仿∶甲醇∶水(体积比65∶15∶2)展开，前沿过薄板长度的一半距离时取出。UV下观察，在分别用碘蒸汽、苯酚-硫酸、0.5％茚三酮丙酮溶液、钼酸铵-高氯酸溶液显色。
(3)表面张力结果如图22所示。
有机溶剂提取后的有机相对表面张力的贡献最大，表明此表面活性剂主要是类脂化合物。
(4)定性定量结果，见表18所示。
表20表面活性剂产量
表面活性剂粗产物为多种不同极性物质的混合(1)展开剂前沿附近是非极性物质或中性物质，为磷酸脂(2)展开剂中部斑点对碘蒸汽、苯酚-硫酸显色剂匀成正反应，表明是糖脂类化合物；在第五天和第十五天时有对茚三酮显色反应的斑点，表明是脂肽类物质。还有一些极性较强的物质，对照组中不存在。据文献报道，原油的成分十分复杂，本身就含一些活性成分即具有表面活性的物质，主要是长链脂肪酸、醇或酚等含氧化合物和有机酸脂等其他含氧化合物；另外微生物对原油的作用途径多样，中间产物丰富，因此产生的表面活性剂种类很多。以上结果表明G1788可以显著的提高表面活性剂的含量，降低原油表面张力，从而加强了原油的流动性。
8、本发明筛选的菌种具有降低石油粘度的特性，可以在石油运输中的应用。
做乳化分散实验和降粘实验，以原油为唯一碳源，73℃油浴振荡培养时间分别为5，10，15，20天，设对照组(不加微生物，培养条件与实验组相同)和实验组(加入G1788)。如表21所示(同表17)原油的降粘率表21
由表中数据表明G1788可显著降低原油的粘度，可能的解释是该菌种代谢产生了很多物质(如表面活性剂等)，而且长链石油烃的降解也有效地改善了原油的流动性。
石油在开采和运输时，如果石油的粘度高不容易流动，就需要更多的生产过程和能量的消耗。因此，人们开发出多种方法减低原油的粘度，如放射波裂化减低粘度等。本发明筛选的菌株由于在降低原油的粘度方面具有非常好的效果，因此该菌株或从该菌株提取的有效物质可以减低原油的粘度，将其应用于石油开采业和石油的运输业中，可以有效提高开采率和运输效率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种嗜热脱氮芽孢杆菌菌株，其特征在于，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-1228。
2.一种如权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，由油田地层水样中的菌种作为筛选的初始菌种，经初筛、复筛、接种、驯化扩增得到该菌株。
3.根据权利要求3所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，所述初筛为在营养琼脂平板73℃培养筛选，再用以原油为碳源的无机盐培养基，73℃油浴震荡培养，进行乳化分散实验，取分散效果好的菌株；所述复筛为在乳化分散实验和降粘降凝实验中，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最优菌；将得到的最优菌反复接种液蜡无机盐培养基，73℃驯化扩增，得到该菌株。
4.一种如权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的优化培养基，包括碳源、氮源、无机盐；其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖或淀粉；所述氮源为硝酸钠、硫酸铁、硫酸镁、磷酸氢钠和磷酸氢甲；所述培养基的PH为6.5至7.5。
5.根据权利要求5所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的优化培养基，其特征在于，所述碳源选用蔗糖，用量为0.1％；所述氮源选用硝酸钠，用量为0.1％至0.4％；酵母粉用量为0.05％；所述无机盐用量为基础培养基无机盐用量的1.5至2倍。
6.权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在石油开采业、降解石油烃、净化含石油物质、石油运输业中的应用。
7.权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在需要热稳定酶的工业生产中的应用。
8.权利要求1所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株在制备表面活性剂中的应用。
9.根据权利要求6所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于，所述含石油物质为含石油的污水等。
10.根据权利要求7所述的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于，所述需要热稳定酶的工业是发酵工业。
全文摘要
本发明提供一种嗜热脱氮芽孢杆菌菌株及其筛选和应用，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC－1228；其由油田地层水样中的菌种作为筛选的初始菌种，经初筛、复筛、接种、驯化扩增得到；本发明筛选的菌株属于土壤芽孢杆菌属，耐高温，具有很好的热稳定性能，可应用在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中；其能在油藏环境中生长良好，具有降解烷烃的能力和降低原油黏度的性质，提高石油的流动性能，可有效提高石油的采收率和石油运输的效率；也可利用其良好的降解石油的能力，处理净化被石油污染的污水等物质，起到环境保护的作用；该菌株还具有降低物质表面张力的功能，可在制备表面活性剂工业中应用。
文档编号C10G32/00GK1614006SQ200410072759
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月17日 优先权日2004年11月17日
发明者王磊, 刘如林, 冯露, 梁凤来 申请人:南开大学