专利名称：嗜热脂肪芽孢杆菌dna聚合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA聚合酶，具体涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、基因、质粒、 融合蛋白、用途和嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的制备方法。
背景技术：
DNA是大多数生物物种的遗传物质。DNA聚合酶的功能主要是进行DNA复制和修 复。目前已经克隆了多种生物物种的DNA聚合酶，包括一些嗜热生物的DNA聚合酶。从嗜 热生物中分离的DNA聚合酶具有较高的热稳定性，例如从Thermus aquaticus中获得的Taq DNA聚合酶在95°C的半衰期为1. 6小时。环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称 LAMP)是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及 没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成 本高等缺点。而且，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不 需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。因此需要寻找一种DNA 聚合酶来适应LAMP检测方法。
发明内容
本发明的一个发明目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种嗜热脂肪芽孢 杆菌DNA聚合酶的基因。一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的基因，所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶 基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。本发明的另一个发明目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种质粒。一种含有上述嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的基因的质粒pMal-C5X/bst。pMal系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMal载体含有编码麦芽糖结 合蛋白(Maltose Binding Protein, MBP)的大肠杆菌mal E基因，其下游的多克隆位点便 于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白(1，2，3)。通过〃 Ptac"强启动子和mal E 翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并利用MBP对麦芽糖的特异性结合实现融合蛋白 的一步亲和纯化。此系统的pMal载体在邻近多克隆位点处含有一段编码特异性蛋白酶识别位点的 序列，从而便于纯化后将目的蛋白与MBP切割分离(5)。为了实现这个目的，多克隆位点中 有一个限制性内切酶识别位点正好位于特异性蛋白酶识别位点处，同时也是目的基因插入 的位点。pMal系列载体可从1升的培养液中表达出IOOmg的融合蛋白。大部分情况下，表 达出的融合蛋白是可溶的，因为MBP已经被证实可提高大肠杆菌中表达蛋白的可溶性(6)。 尽管没有一种表达系统适用于所有基因克隆，但PMal蛋白融合表达和纯化系统经证实在 被检测的已知蛋白中，有超过75%能表达出稳定产量。Current Protocols in Molecular
3Biology (3)中有一章对pMal载体的使用作了深入分析。本发明采用该表达系统可以表达麦芽糖结合蛋白与嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合 酶的融合蛋白。所表达的融合蛋白可以用直链淀粉亲和层析进行纯化，所得产物纯度很高。 另外，据报道麦芽糖结合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的纯化。本发明的另一个发明目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种DNA聚合酶。一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示。由于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的热稳定性较强，并且具有较高的链置换活性 因此能够用于高温测序和核酸等温扩增。本发明嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶在65°C的半 衰期为8分钟。本发明还提供了上述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶在核酸扩增反应的应用。本发明的另一个发明目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种融合蛋白。一种融合蛋白，其具有上述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，所述的融合蛋白还 具有麦芽糖结合蛋白。所表达的融合蛋白可以用直链淀粉亲和层析进行纯化，所得产物纯度很高。另外， 麦芽糖结合蛋白可以提高融合蛋白的可溶性，有利于融合蛋白的纯化。本发明还提供了上述的融合蛋白在嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶纯化的应用。本发明还提供了一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的制备方法，所述的纯化方法 包括如下步骤(1)扩增如SEQ ID NO 1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶基因的核苷酸编码 序列；(2)将步骤(1)得到的核苷酸编码序列克隆到pMal-C5x表达载体中，得到重组质 粒 pMal-c5x/bst ；(3)在大肠杆菌中表达重组质粒pMal-C5X/bst，获得麦芽糖结合蛋白和嗜热脂肪 芽孢杆菌DNA聚合酶大片段的融合蛋白；(4)采用直链淀粉亲和层析纯化步骤(3)得到的融合蛋白；(5)将纯化后的融合蛋白进行蛋白酶酶解，得到如SEQ ID NO 2所示的嗜热脂肪芽 孢杆菌DNA聚合酶。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。LAMP 环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification)DNA 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)EDTA 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)DTT 二硫苏糖醇(Dithiothreitol)ATCC 美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection)OD 光密度(Optical Density)dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)
嗜热脂肪芽孢杆菌菌株ATCC12980购自中国工业微生物菌种保藏中心。实施例1.用PCR方法扩增嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段基因根据NCBI数据库中的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶基因设计了引物，以嗜热脂肪 芽孢杆菌基因组DNA为模板进行扩增。所使用的条件为94°C 3分钟；30个循环的94°C 0. 5 分钟，50°C 0. 5分钟，72°C 3分钟；最后72°C 7分钟。经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了约 1.8kb的扩增片段。经测序，如SEQ ID NO 1所示，为1761bp。实施例2.克隆扩增片段到pMal-c5X表达载体中将实施例1的扩增片段用FspI和BamHI酶切，pMal_c5x载体(购自NEB公司) 用XmnI和BamHI酶切。片段和载体混合之后加入T4 DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌 DH5a菌株。经过酶切鉴定和测序，获得了所需的克隆pMal-C5X/bst。将质粒转化到TBI菌 株中进行蛋白表达。实施例3.嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段的表达将实施例2的含有表达质粒pMal-C5X/bst的大肠杆菌在生长至0D600为0. 5时 加入IPTG进行诱导，2小时之后离心收集菌体。实施例4.嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段的纯化将实施例3 收集得到的菌体在20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT, 0. 1体积％ Triton X100, lmg/ml溶菌酶缓冲液中裂解30分钟，12000rpm离心30分钟收集 上清液后与直链淀粉树脂混合，4°C吸附60分钟。直链淀粉树脂以20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl, 0. 3mM DTT缓冲液洗涤后，将重组蛋白用20mM Tris PH6. 8, IOOmM NaCl，IOmM麦芽糖 洗脱下来。洗脱的蛋白中加入ImMCaCl2及2呢蛋白酶Factor Xa，4°C切割20小时即获得 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段。所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段具有如 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。实施例5.核酸等温扩增(LAMP)反应条件为20mM Tris-HCl pH 8. 8, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl,8mMMgS04,0. 1 % Triton X-100,0. 8Μ甜菜碱，1. 6mM dNTP，引物BIP和FIP各 1. 6 μ M，引物B3和F3各0. 2 μ M， 33ng实施例4得到的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段以及模板DNA。65°C反应60分 钟之后加入2μ1 IOOOx Sybr Green I染料，反应液呈现绿色则为扩增阳性。结果显示实 施例4得到的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段与商品化的NEB公司生产的Bst聚合酶 (大片段)一样，都能够用于核酸等温扩增(LAMP)。但相比起商品化的产品，本发明中提及 的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶大片段，检测灵敏度高2个数量级。下面以检测沙门氏菌 为例。培养沙门氏菌，经菌落平板计数，选择第9个稀释度进行读数，平均菌落数为 126cfu,推算细菌原液浓度为1. 26 X IO11CfuAiL,用商品化的Bst聚合酶(大片段)，其它所 有条件不变，可检测到第5个稀释度，为1.26X 106cfU/mL。用本发明中提及的嗜热脂肪芽 孢杆菌DNA聚合酶大片段，检测灵敏度提高2个数量级，为1.26X 104cfU/mL。灵敏度改善 明显。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的基因，其特征在于，所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶基因的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种含有权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的基因的质粒pMal-C5x/bst ο
3.一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，其特征在于，所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合 酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.如权利要求3所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶在核酸等温扩增反应的应用。
5.一种融合蛋白，其具有权利要求3所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，所述的融合 蛋白还具有麦芽糖结合蛋白。
6.如权利要求5所述的融合蛋白在嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶纯化的应用。
7.一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述的纯化方法包括 如下步骤(1)扩增如SEQID NO 1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶基因的核苷酸编码序列；(2)将步骤(1)得到的核苷酸编码序列克隆到pMal-C5x表达载体中，得到重组质粒 pMal-c5x/bst ；(3)在大肠杆菌中表达重组质粒pMal-C5X/bst，获得麦芽糖结合蛋白和嗜热脂肪芽孢 杆菌DNA聚合酶大片段的融合蛋白；(4)采用直链淀粉亲和层析纯化步骤(3)得到的融合蛋白；(5)将纯化后的融合蛋白进行蛋白酶酶解，得到如SEQID NO 2所示的嗜热脂肪芽孢杆 菌DNA聚合酶。
全文摘要
本发明涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、基因、质粒、融合蛋白、用途和嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的制备方法。所述的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶能够进行核酸扩增反应，且令该反应更容易进行，检测灵敏度更高。所述的融合蛋白有利于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的纯化。
文档编号C12N15/10GK101948853SQ20101027605
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者周毅, 曹以诚, 杜正平 申请人:广州华峰生物科技有限公司