专利名称：疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
背景技术：
普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名为(S)-(+)_3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，是 Y -氨基丁酸的 3 位异丁基取代物(Angew. Chem.1nt. Ed. 2008，47:3500-3504)。普瑞巴林属钙离子通道调节剂，通过调节钙通道减少钙离子进入神经末梢，减少谷氨酸和去甲肾上腺素等兴奋性神经递质的过度释放(Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6:108-113.),对癫痫、神经病理性疼痛有良好的疗效。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强。自上市以来，普瑞巴林全球销售额快速增长，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，市场前景十分广阔。(3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(II)是制备普瑞巴林的关键手性中间体，经加热脱羧、碱性水解和加氢还原即可合成普瑞巴林(I )。美国Pfizer公司利用Novozymes公司固定化脂肪酶Upolase 选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成
(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸盐，底物浓度可达3. 0M,转化率42 48%( Org. ProcessRes.Dev.2008， 12:392-398 ；US2005/0283023)o
权利要求
1.一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如下的肽段经点突变获得RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的点突变为下列之一或其中两种以上(I)第88位的S突变为T ; (2)第99位的A突变为N ; (3)第116位的V突变为D。
2.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD。
4.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD 。
5.编码如权利要求1所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的基因。
6.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧こ基-3_氰基-5-甲基己酸こ酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧こ基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码序列及其应用。所述一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如SEQ ID No.1的肽段经点突变获得，所述的点突变为下列之一或其中两种以上(1)第88位的S突变为T；(2)第99位的A突变为N；(3)第116位的V突变为D。本发明提供的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体较亲本活力大幅提高，即使使用该酶的粗提物或者工程菌全细胞，反应也会以较高的速率进行；此外，本发明的突变体可以在常温和相对较高的温度例如40~60℃下用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴林。
文档编号C12N9/20GK103045559SQ20121040783
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者郑裕国, 黎小军, 郑仁朝, 沈寅初 申请人:浙江工业大学