专利名称：用于质谱法检测的底物和内标的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析试剂和基于质谱法的方法，所述方法使用这些试剂来同时量化样品中的蛋白质。更具体而言，本发明涉及使用质谱法量化溶酶体酶活性的多元分析和试剂。
背景技术：
溶酶体贮积病是一组遗传病症，其特征为身体内特定酶的缺乏，这导致身体不能分解代谢物质。作为一个实例，法布里病是每40，000人之一人中可见的溶酶体贮积病。其是由于α-半乳糖苷酶的缺乏，然后这导致身体不能分解被称为球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂质。第二个实例是高歇病，由于不能分解被称为葡糖神经酰胺(也称为葡糖脑苷脂)的脂物质(fatty substance)或脂质(lipids)引起的溶酶体贮积病。患有高歇病的个体不能制造葡糖脑苷脂酶，一种分解这些脂质所需要的酶。然后，这些脂质聚集在肝、脾和骨髓的细胞内。第三个实例是蓬珀病，由于被需要用来分解某些被称为糖原的糖的酶一酸性α-葡糖苷酶一的缺乏引起的溶酶体贮积病。当酶一酸性α -葡糖苷酶一缺少时，糖原在身体内的多种组织和器官中聚集。这些疾病大部分是儿科疾病。在大多数患者中，患者在出生时是正常的，在过后的一些时间里渐进地开始神经学上恶化。在一些患者中，该疾病在成年期表现。临床表型取决于生化缺陷的类型和严重性。这些溶酶体缺陷症的一些例如蓬珀病和克腊比病，主要表现在婴儿期。因此，已经正在努力开发在临床症状开始前检测这些病症的方法，以便可以开始治疗介入。 在过去的十年内，检测代谢性疾病的实验室已经将串联质谱法引入其新生儿筛查计划。串联质谱法在临床继续得到流行，因为该技术允许在单一样品中分析多种代谢物。例如，该技术已被作为检测在新生儿中遗传代谢性疾病的常规临床实践，在该技术中使用干血斑样品(Schulze A等，Pediatrics 2003; 111: 1399-406) 尽管溶酶体酶活性可使用串联质谱法量化(Gelb MH 等，Clinical Chemistry 50:10，1785-1796，2004)，但是发表的分析方法不容易适用于临床情况，这是因为麻烦的过程和苛刻的分析成分例如氯仿。因此，继续需要改进用于检测溶酶体缺陷症的方法和组合物。发明概述根据本发明的实施方式，提供使用质谱法检测酶反应的改进的组合物和方法。发明的底物(substrate)具有A — (B1-B2-B3)的通式，其中A是单糖或二糖，B1是C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2tl、含有N、O或S杂原子的C6-C2tl杂环；B2是
权利要求
1.用于酶的质谱分析的底物，具有下式 A— (B1-B2-B3)(I) 其中A是D-半乳糖或二糖，B1是C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2tl烷基、含有N、O或S杂原子的C6-C20杂环；B2是
2.权利要求I所述的底物，其中A和(B1—B2— B3)由于所述酶的作用分开。
3.权利要求I所述的底物，其中B1是具有从环延伸的取代基的C6芳基。
4.权利要求I所述的底物，其中B1是苯基、硝基苯基或苯酯。
5.权利要求4所述的底物，其中B2是肉碱基。
6.权利要求5所述的底物，其中B3是具有以羰基存在的O的取代基的C2-C2tl烷基。
7.权利要求I所述的底物，其中A和(B1— B2 — B3)部分每一个包括元素的稳定二级流行同位素。
8.权利要求7所述的底物，其中在每一情况中，所述稳定二级流行同位素选自2D、13C、15Ν、170、180、31Ρ 和 34So
9.用于酶的质谱分析的方法，包括 将所述酶与根据权利要求I的式IA — (B1-B2-B3)的所述底物接触，以在酶反应后产生具有切割产物分子量的切割产物(B1—B2 — B3)； 提供所述底物的内标(B1—B2 — B3)’，其中(B1—B2 — B3) ’具有与所述切割产物分子量不同的分子量的至少一种稳定二级流行同位素，并且(B1—B2 — B3) ’的B^B2和B3如在根据权利要求I的式I中所详述；和 使用质谱分析，量化所述切割产物和所述内标之间的质量/电荷比。
10.权利要求9所述的方法，其中所述酶选自酸性α—半乳糖苷酶A和半乳糖脑苷脂α 一半乳糖苷酶。
11.权利要求9所述的方法，其中所述(B1—B2— B3)的切割产物与所述(B1—B2 — B3) ’的内标结构上相同。
12.—种商业包装，其包括根据权利要求I的式IA-(B1—B2—B3)的底物作为活性成分；具有与(B1—B2 — B3)不同的稳定二级流行同位素分子量的(B1-B2-B3),的内标；和用于通过质谱分析检测样品中的酶活性的说明。
13.用于酶的质谱分析的方法，包括 用同位素标记物LI标记根据权利要求I的式IA-(B1—B2 — B3)的第一底物，以形成第一底物 L1(A)-lHB1 — B2 — B3)； 用同位素标记物L2标记根据权利要求I的式I A — (B1-B2-B3)的第二底物，以形成第二底物12㈧一12 (B1 — B2 — B3)，其中所述同位素标记物L2不同于所述同位素标记物LI ；在容器中使所述第一底物u (A)—L1 (B1-B2-B3)和所述第二底物12 (A)—L2 (B1-B2-B3)与所述酶结合，其中所述第一底物L1(A)-WB1—B2—B3)被所述酶切割形成U(A)和1HB1—B2 — B3)，其中所述第二底物12㈧一12 (B1 — B2 — B3)被所述酶切割形成12 (A)和12 (B1 — B2—B3);和 量化所述第一底物u (A)-L1 (B1-B2-B3)和所述第二底物12 (A)-L2 (B1-B2-B3)的减少，和所述u⑷、u (B1-B2-B3)、L2⑷和L2 (B1-B2-B3)的增加。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述容器是检测试管、检测小瓶或多孔微量培养板。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述测量通过质谱法完成。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶选自酸性α-半乳糖苷酶A和半乳糖脑苷脂α -半乳糖苷酶。
17.根据权利要求I所述的底物在制备用于检测从个体收集的样品中的溶酶体贮积病的试剂盒中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述检测包括同时检测第一和第二种溶酶体贮积病。
19.根据权利要求I所述的底物在制备用于检测从个体收集的样品中的溶酶体贮积病的分析试剂中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其中所述检测包括同时检测第一和第二种溶酶体贮积病。
全文摘要
本发明的名称是用于质谱法检测的底物和内标。提供发明的底物，其包括式A—B1—B2—B3的底物化合物其中A是糖部分；B1是使部分A和底物的剩余结构连接的连接部分；B2含有永久带电元素例如季铵基团，以便为质谱分析增加质子亲和力和离子化效率；和B3具有赋予靶酶特异性的不同碳长度。也提供的是检测溶酶体缺陷症的方法，这通过将样品与发明的底物连同内标接触来完成，所述内标是被该底物的靶酶切割的产物的同位素标记类似物。
文档编号C12Q1/34GK102943106SQ201210407558
公开日2013年2月27日 申请日期2007年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者B·赛达 申请人:珀金埃尔默健康科学股份有限公司