γ分泌酶的可溶性NOTCH－型底物和使用所述底物的方法和组合物的制作方法

专利名称：γ分泌酶的可溶性NOTCH－型底物和使用所述底物的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及γ-分泌酶的新型可溶性底物。更具体地讲，本发明提供了具有Notch片段的可溶性融合多肽，其中含有与NusA蛋白融合的γ-分泌酶依赖性切割位点(γ和ε)。还披露了制备和使用所述融合蛋白的方法和组合物。
背景阿尔茨海默病(AD)能导致渐进的痴呆，其后果是形成淀粉样斑，神经纤维缠结，神经胶质过多症和神经元减少。这种疾病有遗传学形式和偶发性形式两种，二者的临床过程和病理学特征是相当类似的。迄今为止业已发现了三个基因，在这些基因突变时导致AD的常染色体显性形式。这些突变基因编码淀粉样蛋白前体(APP)和两种蛋白—早老素-1(presenilin-1，PS1)和早老素-2(PS2)，它们在结构和功能上是相关的。业已观察到在这三种蛋白中任意一种中的突变会通过产生淀粉样β肽(Aβ肽，有时称之为Aβ)的细胞内途径增强APP的蛋白水解加工，该Aβ肽是具有40-42个氨基酸的肽，是AD淀粉样斑的主要成分(Younkin，Brain Pathol.1(4)253-62，1991；Haass，J.Neurosci.11(12)3783-93，1991)。
蛋白水解的细胞内途径的失调可能对AD的病理学起着重要作用。对于斑块形成来说，APP，PS1或PS2中的突变都能一致性地改变APP的蛋白水解加工，以便增强Aβ 1-42的形成(它是Aβ肽的一种形式，似乎特别是淀粉生成性的，并因此在AD中非常重要)。APP位于分泌膜结构上，包括细胞表面，并且靠近C-末端有跨膜结构域(

图1)。目前已知存在于人体内的APP的具体同种型的例子包括Kang等(1987)，Nature 325733-736披露的695个氨基酸的多肽，它被命名为“正常”APP；由Ponte等(1988)，Nature，331525-527(1988)和Tanzi等(1988)，Nature，331528-530中披露的751个氨基酸的多肽；和Kitaguchi等，Nature，331530-532(1988)中披露的770个氨基酸的多肽。
所述Aβ肽来自APP的靠近所述跨膜结构域并且包括它的一部分的区域(参见图1)。通常，在所述α-分泌酶位点上的APP加工能切割靠近所述膜的Aβ序列的中部，并且从所述细胞表面上释放APP的可溶性细胞外结构域。这种α-分泌酶APP加工产生了可溶性APP-α，它不被认为会导致AD。不过，在β-和γ-分泌酶位点(位于α-分泌酶位点的N-末端和C-末端)处的APP的病理学加工释放出所述Aβ肽。所述β-分泌酶切割位点位于距离所述质膜腔表面28个残基处，而所述APPγ-分泌酶切割位点位于所述跨膜区内。在β-和γ-分泌酶位点处的加工可以在内质网(在神经元中)和在细胞表面APP重新内在化之后在内涵体/溶酶体途径中进行(在所有细胞中)。
因此，β-和γ-分泌酶的酶促活性是药物开发的靶目标(Olson等，Curr.Opin.Drug Discovery & Develop.4390-401，2001)。这两种酶协调作用而切割APP，最初是通过β-分泌酶切割，产生被称为CT-100的膜结合型C-末端(CT)片段，该片段又被用作膜相关型γ-分泌酶的底物。早老素1(PS)依赖性γ-分泌酶对CT-100的膜内切割导致了Aβ1-40和1-42的产生。另外，存在另一种切割事件(被称为γ-样或ε-分泌酶切割)，它在细胞质膜边界内大约2-5个残基处切割APP的附近残基721，以便产生一系列稳定的C-末端APP片段(图1)。
Notch-1属于细胞表面受体的Notch家族，它在决定细胞命运方面起着广泛作用。近几年中，业已提出了APP加工与细胞表面受体Notch 1的加工类似(Wolfe等，J.Biol.Chem.2765413-5416，2001)。实际上，业已证实APP和Notch-1是推测的内源γ-分泌酶的竞争性底物。Notch-1是膜内在蛋白，在配体-介导的激活作用之后，它能在它的胞外结构域内进行蛋白水解加工。在配体结合之后，Notch-1会发生早老素依赖性膜内γ-分泌酶切割(Okochi，EMBO J.25408-5416，2002)。首先是在1731/1732位点(它与Aβ-样γ分泌酶切割类似)，其次是在1743/1744位点(它是与产生APP的ε切割类似，并且有时被称为Notch的S3-切割；在图1中被表示为″ε″切割)。正是在Notch的1743/1744接合部分处的ε-切割是朝向所述跨膜结构域的末端进行的，释放出Notch 1细胞内结构域(NICD)。释放的NICD转位到细胞核中，在这里它与被称为CSL的DNA结合蛋白相互作用(这种只取首字母的缩写词表示在不同系统中赋予该蛋白的三种独立的名称在哺乳动物中为CBF1/RBP-J；在果蝇和爪蟾中的无毛抑制剂[Su(H)]；和C.Elegans中的Lag-1)。NICD和CSL之间形成的混合物改变了靶基因的转录。NICD是在胚胎发育中起着关键作用的信号传导途径所必须的(Schroeter1998；Hupert 2000)。
早老素依赖性γ-分泌酶活性是将Notch受体加工成NICD所必须的(De Stropper等，Nature 398518-522，1999)。业已报道了，在细胞中，Notch 1和APP是PS1依赖性γ-分泌酶酶切割的竞争性底物(Berezovska等，J.Biol.Chem.27630018-30023，2001)。因此，被设计成抑制致病性Aβ产生的γ-分泌酶抑制剂还能抑制Notch信号传导。它在γ-分泌酶抑制剂用作治疗AD的药物的潜在用途方面具有重要价值。在成年人体内对Notch-1加工的抑制会导致免疫缺陷和贫血，因为Notch-1在造血中起着重要作用。因此，有必要鉴定能特异性抑制APP CT-100切割但不会抑制Notch切割的化合物。这种化合物可以起着干预AD、但又不产生抑制NICD产生的有害作用的治疗剂的作用。
发明概述本发明提供了用于鉴定不会抑制γ-分泌酶介导的Notch切割的化合物的方法和组合物。上述方法和组合物克服了NICD生产抑制的问题，这种抑制会导致对γ-分泌酶抑制作用的非特异性抑制。
因此，本发明能够鉴定用于干预AD而又不会引起抑制NICD产生的有害作用的治疗剂。
本发明的第一方面提供了可溶性融合蛋白，其中包括与NusA蛋白序列的C-末端融合的重组Notch蛋白。所述Notch蛋白优选包括Notch蛋白的跨膜结构域。不过，所述Notch蛋白可以包括全长Notch蛋白中比所述跨膜结构域更多或更少的部分，只要所述Notch蛋白包括Notch的S3切割位点就行。用于特定实施方案的所述Notch蛋白包括SEQ IDNO4的序列，并且是由SEQ ID NO3的核酸序列编码的。所述重组Notch蛋白应当是包括Notch的S3切割位点(即ε切割位点)的蛋白。所述重组Notch蛋白可以是脊椎动物Notch蛋白或无脊椎动物Notch蛋白。在某些实施方案中，所述重组Notch蛋白来自小鼠Notch蛋白，其具有SEQ ID NO5的序列[Gen Bank录入号Z11886]。更具体的实施方案涉及包括小鼠Notch蛋白的1703-1860位氨基酸的重组Notch蛋白的用途。本发明的任一种可溶性融合蛋白还可以包括C-末端His-标记和/或C-末端Flag-标记。当然，还可以使用人Notch序列的全部或一部分，例如，SEQ ID NO6的序列[Genbank录入号M73980]。
本发明还涉及包括编码本文所披露的融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。编码所述融合蛋白的一种代表性多核苷酸序列是包括SEQ IDNO1所示序列的序列。这种多核苷酸序列编码SEQ ID NO2的融合蛋白。本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的表达载体。所述表达载体优选是这样的表达载体，其中，所述多核苷酸可操作地与启动子连接，以便促进由所述多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。
本发明还涉及用本文所披露的多核苷酸或表达载体转化或转染的重组宿主细胞。本发明涉及生产用于γ-分泌酶测定的底物的方法，包括以允许所述融合蛋白表达的方式培养所述重组宿主细胞。该方法还可以包括纯化所述多肽。在所述方法中，所述宿主细胞可以是任何能够用于生产重组蛋白的宿主细胞，包括哺乳动物宿主细胞，细菌宿主细胞和酵母宿主细胞。在典型实施方案中，所述宿主细胞是Hela细胞，人胚肾细胞系，293细胞，成纤维细胞或CHO细胞。
本发明的另一方面提供了生产可溶性Notch蛋白的方法，该方法包括制备融合蛋白，其中所述Notch蛋白与NusA蛋白的C-末端融合。更具体地讲，该方法包括所述融合蛋白的重组生产，其中包括制备表达构建体，该构建体包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包括含有Notch的S3切割位点的氨基酸、与NusA蛋白的C-末端连接的Notch蛋白；在有利于所述融合蛋白表达的条件下用所述表达构建体转化宿主细胞；以及在培养基中培养所述转化的宿主细胞。该方法还可以包括从培养中的转化宿主细胞中分离所述融合蛋白。在某些实施方案中，所述方法包括通过化学蛋白合成生产所述融合蛋白。在这种方法中，所述Notch蛋白优选包括小鼠Notch蛋白的1703-1860号氨基酸。
本发明还涉及测定Notch蛋白的γ-分泌酶介导的切割(1743/1744)的体外方法，其中包括使含有哺乳动物γ-分泌酶复合物或其生物活性片段的第一种组合物与包括本发明融合蛋白的第二种组合物接触；和测定所述融合蛋白的切割。
上述方法的γ-分泌酶复合物可以包括从哺乳动物细胞或用包括编码γ-分泌酶复合物的核苷酸序列的表达构建体转化或转染过的细胞中纯化并且分离的膜级份。在上述方法中，所述融合蛋白是按照本文所披露的方法制备的可溶化Notch蛋白。
本发明具体涉及包括通过本发明所披露的筛选方法鉴定的γ-分泌酶调节剂的组合物。本发明还涉及在体内调节γ-分泌酶活性的方法，包括以能有效调节哺乳动物细胞内的γ-分泌酶活性的量给所述哺乳动物施用通过本文所披露的筛选方法鉴定的调节剂的步骤，所述调节剂是γ-分泌酶调节剂，与γ-分泌酶-介导的Notch蛋白的切割相比，它能选择性地抑制γ-分泌酶-介导的APP的切割。
本发明还涉及包含通过本发明鉴定的一种或多种调节剂和可以药用的载体的药物组合物。还涉及治疗以异常的γ-分泌酶活性为特征的疾病或症状的方法，包括给需要治疗的对象施用本发明的药物组合物。特别涉及将本发明鉴定的调节剂用于生产用来治疗阿尔茨海默病的药品的用途。
通过以下详细说明可以了解本发明的其他特征和优点。不过，应当理解的是，这些详细说明和具体实施例表示本发明的优选实施方案，它们仅仅是以说明形式提供的，因为在本发明构思和范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员来说在阅读该详细说明之后是显而易见的。
附图的简要说明以下附图构成了本说明书的一部分，并且包含在本发明内以便进一步说明本发明的各个方面。通过结合附图和本文所提供的具体实施方案的详细说明，可以更好地理解本发明。
图1.γ-分泌酶-样切割位点的比较。示出了位于APP(SEQ ID NO10)，Notch-1(SEQ ID NO12)，和E-cathedrin(SEQ ID NO11)的跨膜结构域周围的序列。还示出了APP中的γ-分泌酶切割位点，用于产生Aβ1-40和1-42，以及用于这三种底物的ε-切割(ε)或γ-分泌酶-样切割位点。
图2.Notch-1中的γ-分泌酶-样切割位点周围的氨基酸序列。选择该序列(1703-1860；SEQ ID NO13)以便在大肠杆菌中表达。所述跨膜结构域由下划线表示，用粗体和下划线符号表示1743/1744切割位点。该Notch序列的切割会产生包括1744-1860位氨基酸的NICD片段。
图3.a)克隆的、用于在大肠杆菌中表达Notch的构建体。示出了四种构建体，都包括Notch-1的1703-1860位氨基酸序列。当caspase前导序列，泛素，或tau的N-末端结构域被用作N-末端标记以便协助驱动表达时，没有观察到表达。当Notch(1703-1860)与NusA蛋白融合时，在大肠杆菌中观察到了可溶性表达。b)克隆到ET 43.1a.中的Notch F构建体的示意图。该构建体还包括C-末端Flag和8His标记。
图4.NusA-Notch融合体的IMAC分离。在上部示出了所述融合蛋白的示意图。NusA-Notch的表达和纯化的细节可以参见材料和方法部分。箭头表示在10％SDS-PAGE凝胶上的融合蛋白表达条带。泳道1，粗制大肠杆菌裂解物；泳道2，大肠杆菌上清液，泳道3，IMAC流过物；泳道4，50mM咪唑洗涤物；泳道5-9，300mM咪唑洗脱级份；泳道10，BenchMark分子量标记。
图5.表示用可溶化γ-分泌酶切割NusA-Notch融合体的Western印迹。该实验的细节披露于实施例1中。简单地讲，将可溶化γ-分泌酶与NusA-Notch融合体在有或没有各种浓度的DAPT(PHA-568638)的存在的条件下温育过夜。对所述样品进行电泳，印迹，并且用Val 1744抗体探测，该抗体对Val 1744处的切割是特异性的。
图6.通过ELISA检测特异性Notch切割。示出了将夹心ELISA用于检测可溶化γ-分泌酶对NusA-Notch融合体的切割的示意图。用Val1744抗体检测特异性切割。
图7.通过ELISA检测的γ-分泌酶对NusA-Notch融合蛋白的切割。在有或没有68μg/ml可溶化γ-分泌酶(酶)存在的条件下温育NusA-Notch(0.9μM)底物，并且按照材料和方法部分所述进行ELISA测定。数据表示六次实验的平均值。
图8.通过ELISA表征Notch切割。ELISA测定是按照材料和方法部分所披露的方案进行的。在改变Notch底物浓度时，将0.11-3.6μM的NusA-Notch与68μg/ml可溶化γ-分泌酶一起温育，并且用Michaelis-Menton曲线拟合法对所述数据进行作图。在改变所述酶浓度时，将2.1-68μg/ml可溶化γ-分泌酶与0.9μM Notch底物一起温育。数据表示三次实验的平均值，并且用GraFit 4.0作图。存在大约5倍的信号背景(仅使用酶的背景是可以忽略的)。
图9.通过已知能抑制γ-分泌酶对CT-100的体外切割的化合物抑制Notch切割。示出了用Notch切割ELISA测定的对DAPT(PHA-568638)和葑胺(PHA-512088)的抑制曲线。还示出了相对IC50值。
优选实施方案的详细说明AD是主要的与年龄相关的疾病，这种疾病与以皮层萎缩和衰老斑的沉积和神经纤维缠结为特征的渐进性痴呆和病理学相关。衰老斑的主要成分是长度为40-42个氨基酸的肽，Aβ，它来自APP的靠近全长APP的跨膜结构域并且包括其一部分的区域。这种致病性肽是由于β-和γ-分泌酶活性的顺序加工的结果产生的。因此，这两种分泌酶的酶促活性是药物开发的目标(Olson等，Curr.Opin.Drug Discovery & Develop.4390-401，2001)。
业已证实细胞表面受体Notch的加工与APP加工类似(Wolf等，J.Biol.Chem.2765413-5416，2001)。图1表示在APP和Notch中γ-分泌酶-样切割位点的比较。如图所示，APP中的切割位点位于所述跨膜结构域的中间，而Notch是在非常接近它的跨膜结构域的C-末端切割的。最近业已报导了存在于cathedrin E(图1)上的类似的ε-切割位点(Marambaud等，EMBO J.，211948-1956，2002)。图2表示Notch蛋白的从1703-1860的氨基酸序列，其中包括Notch上的S3切割位点(Steiner等，J.Mol.Neuro sci.17193-198，2001)。在1743/1744接合部分处的特异性切割会产生V1744-D1860 Notch细胞内结构域(NICD)，它是在用缺少S1和S2切割位点的mdE Notch构建体(1704-2183)转染的细胞中观察到的NICD片段(Kopan等，Proc.Natl.Acad.Sci.931683-1688，1996)。尽管业已报导了Notch构建体(Val 1711-Glu 1809)(Esler等Proc.Natl.Acad.Sci.99，2720-2725，2002)，但还没有γ-分泌酶在体外在1743/1744接合部位的特异性切割的报导。通过使用Val-1744抗体(Cell SignalingTechnology)可以方便地确定1743/1744接合部分处的特异性切割。这种抗体对于切割的Notch具有特异性，并且不会与未切割的Notch蛋白发生交叉反应。
因此，在细胞中，除了切割通过β-分泌酶的作用产生的CT-100片段之外，PSI依赖性γ-分泌酶还能切割ε位点1743/1744，产生NICD。这种切割的NICD转位至细胞核中，并且参与信号传导。被设计成缓解AD的γ-分泌酶活性的治疗性抑制作用还导致了NICD产生的抑制。本发明首次提供了用于鉴定不会抑制由Notch-1产生NICD的治疗剂的方法和组合物。
本发明的方法提供了对Notch切割的体外测定，以及将所述测定用于γ-分泌酶抑制剂的二级评估的用途。所述测定方法采用了γ-分泌酶的可溶性Notch底物，它包括含有与NusA蛋白序列的C-末端相融合的重组Notch蛋白的可溶性融合蛋白。本发明的测定方法可以通过直接体外ELISA测定进行和/或对由γ-分泌酶切割的Notch蛋白的Western印迹进行分析。本发明的方法提供了可溶性重组Notch蛋白(Asn 1703-Asp 1860)底物的生产和纯化，所述蛋白底物是以具有加工到Notch蛋白序列上的NusA的融合蛋白形式在合适的细胞系，例如大肠杆菌中表达的(参见图6)。
使用本发明的纯化的融合蛋白底物，本发明人证实了使用来自HeLa细胞的可溶化γ-分泌酶在Notch中的1743/1744位点处的特异性切割。正如在具体实施例中所披露的，切割的Notch蛋白可以用对Val-1744特异的抗体检测。本发明人证实了该测定法，并且显示出所述Notch的切割是以剂量依赖性方式由DAPT抑制的(DAPT是γ-分泌酶的众所周知的强抑制剂)。开发出了基于抗-Val-1744抗体的ELI SA。通过γ-分泌酶抑制剂抑制所述切割，进一步证实了体外Notch测定法。在实践中，将抑制剂或调节剂定义为能通过γ-分泌酶降低Aβ的化合物。
1.用于体外Notch测定的Notch底物用于本发明测定法的Notch底物是Notch多肽与Nus蛋白的可溶性融合蛋白。所述融合蛋白可以被标记，或者以其他方式修饰，以便有利于所述肽的纯化，Notch融合蛋白本身的检测，或在γ-分泌酶作用后检测所述Notch融合蛋白的切割产物。在本文的下面更详细地披露了所述融合蛋白的生产和代表性修饰。
在本发明的优选方面，包括小鼠notch-1蛋白的氨基酸N1703-D1860(DNA序列保藏号Z11886；参见图2)的所述Notch底物，在它的N-末端与NusA的C-末端连接。预计所述融合多肽可以通过重组蛋白生产产生，或实际上通过在本说明书其他地方所讨论的自动化肽合成法产生。在图2中的跨膜结构域跨越氨基酸1723-1744(参见图1)。γ-分泌酶能在氨基酸1743和1744之间的ε-切割位点处切割Notch。该切割位点又被称为S3-切割位点，并且产生NICD(即跨越V1744-D1860的肽)。
除了这种新型融合蛋白之外，本发明还涉及生成如上文所述或按照本发明方法鉴定的Notch/NusA融合蛋白底物的末端加成物，又被称为融合蛋白或融合多肽。另外，尽管本发明的优选实施方案示出了包括小鼠Notch-1的N1703-D1860的Notch/NusA融合肽，应当理解的是，所述Notch蛋白可来自任何来源。所述来源可以是哺乳动物，或非哺乳动物。因此，尽管优选的是Notch-1来自人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物来源，预计在某些实施方案中，Notch-1可来自例如C.elegans，非洲爪蟾属，果蝇，和其他无脊椎动物来源。
另外，预计包括γ-分泌酶切割位点1731/1732(γ位点)和1743/1744位点(ε-切割)的任何Notch-1衍生物都可用于本发明的融合蛋白底物中。在Notch-1中，能释放NICD的γ-分泌酶切割位点位于Notch中的1743/1744位点。预计所述切割位点和NusA的起始位点之间的距离为大约500个氨基酸，以便模拟Notch γ-分泌酶切割结构域的空间特性。该距离可以通过NusA蛋白产生，或者可以通过异源肽接头产生。优选的是，该区域来自NusA蛋白。Notch/NusA融合多肽的NusA蛋白结构域成分大体上可以是NusA蛋白的、可使得所述Notch/NusA融合体保留可溶性的任何部分，并因此可用于体外测定。
NusA以前业已被用于在大肠杆菌中可溶性表达蛋白质(例如，参见Wilkinson，等，Biol Technology 9，443-448，1991；Davis等，BiotechnolBioeng.，65(4)382-8，1999)。在这里，将包含SEQ IDNO17所示序列(由SEQ ID NO16的核酸序列编码)的NusA蛋白与Notch相融合。不过，本领域技术人员可以采用除了SEQ ID NO17所示序列之外的NusA序列，并且仍然能产生本发明的可溶性Notch/NusA融合蛋白。例如，技术人员可以使用包括与SEQ ID NO17的序列具有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或更高序列同源性的NusA蛋白。另外，技术人员可以采用来自SEQ ID NO17的更小的连续片段NusA，例如，所述片段可以是SEQ ID NO17中的50，100，150，200，250，300，350，400，425，450，475，500，510，520，530，540，550或更多个连续氨基酸。
设计和制备融合蛋白的一般原则为本领域技术人员所熟知。例如，融合通常采用来自其他物种的前导序列，以便能够在异源宿主中重组表达蛋白或肽。其他有用的融合包括添加免疫学活性结构域，如抗体表位，以便有利于所述融合多肽的纯化。在所述融合接合部位或靠近该部位的地方包括切割位点将有助于在纯化之后除去外源多肽。所述融合体的重组生产在本说明书的其他地方有更详细的说明。其他有用的融合包括连接功能性结构域，如来自酶的活性位点，糖基化结构域，细胞定向信号或跨膜区。
更具体地讲，本发明涉及融合多肽，其中存在包含含有1731/1732(γ切割)和1743/1744(ε-切割)切割位点的Notch蛋白的第一成分以及与之连接的含有NusA蛋白的全部或一部分的第二成分。在其他实施方案中，所述融合多肽还可以包括含有报导基因产物的第三成分。在其他实施方案中，所述融合多肽还可以包括标记的序列成分。涵盖的特定的融合多肽是这样的融合多肽，它包括位于NusA部分的一侧的报导基因产物，包括具有γ-分泌酶切割位点的Notch蛋白的一段序列，和位于所述Notch蛋白另一侧的被标记序列。用于本发明融合多肽的报导基因产物可以是本领域技术人员所常用的任何报导蛋白。
典型的报道蛋白包括，但不局限于荧光素酶；分泌的碱性磷酸酶(SEAP)；β半乳糖苷酶；β-葡糖醛酸酶；绿色荧光蛋白和氯霉素乙酰转移酶。
其他具体实施方案还涉及作为本发明融合多肽的第四种成分的被标记序列。存在多种可通过商业渠道获得的融合蛋白表达系统，这些系统可用于提供本发明范围内的被标记序列。特别有用的系统包括，但不局限于谷胱甘肽S-转移酶(GST)系统(Pharmacia，Piscataway，NJ)，麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，MA)，FLAG系统(IBI，New Haven，CT)，和6×His系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。以上系统能够生产仅具有少量额外氨基酸的重组多肽，它们不太可能影响所述重组融合蛋白的生物学相关活性。例如，FLAG系统和6×His系统都仅添加了短序列，已知二者的抗原性弱，并且不会对所述多肽折叠成它的天然构象产生负面影响。可能有用的其他N-末端融合是Met Lys二肽在所述蛋白或肽的N末端区的融合。这种融合可以使蛋白表达和/或活性得到有益的增加。可用于本发明的具体的被标记序列包括C-末端FLAG标记序列DYKDDDDK(SEQ ID NO14)。另外，所述被标记序列还可以包括8His标记，以便产生附着在所述融合蛋白上的FLAG/8his标记(DYKDDDDKHHHHHHHH，SEQ ID NO15)。
本发明优选的融合蛋白的例子是这样一种蛋白，其中，NusA与部分或完整长度的小鼠Notch-1蛋白融合，所述蛋白包括1731/1732和1743/1744γ-分泌酶切割位点以及短的C-末端FLAG/8His-标记的尾巴。典型融合多肽的序列包括与NusA蛋白融合的小鼠Notch氨基酸1703-1860(即，如SEQ ID NO13所示)。这种典型的融合多肽具有SEQ ID NO2的序列。为了监测γ-分泌酶对这种嵌合构建体的切割，可采用针对包括Val-1744残基的Notch切割产物的抗-Val 1744抗体，以便确定由于Notch切割产生的Val-1744片段的存在和浓度。可以采用抗-Flag抗体检测所述嵌合构建体的C-末端。不过，应当指出的是，所述嵌合构建体还可以采用报道蛋白，如碱性磷酸酶，例如位于所述C-末端，以便代替所述Flag标记。所述报道蛋白可因Notch切割释放，并且使用本领域技术人员所熟知的测定方法检测。
除了提供业已披露的融合多肽之外，本发明提供了进一步修饰以便引入例如标记或其他可检测部分的Notch融合蛋白。
例如，所述Notch/NusA融合蛋白底物可以包括内在淬灭标记，在切割所述Notch底物之后，它能导致可检测性增强。所述Notch/NusA融合蛋白底物可以修饰成附着配对荧光团和淬灭剂，包括但不局限于7-氨基，4-甲基香豆素和2，4-二硝基苯酚，以便γ-分泌酶对所述肽的切割导致荧光增强，这是由于分别附着在γ-分泌酶易切割键相反两侧的所述荧光团和淬灭剂的物理分离造成的。其他成对的荧光团和淬火剂包括bodipy-四甲基罗丹明和QSY-5(Molecular Probes，Inc.)。在本测定方法的变化形式中，可以将生物素或另一种合适的标记置于所述肽的一端，以便将所述肽锚定在底物测定平板上，并且可以将荧光团置于所述融合蛋白的另一端。有用的荧光团包括在上文所列举的，以及铕标记，如W8044(EG & g Wallac，Inc.)。可以使用的另一种优选标记是Oregon绿，它能够附着在Cys残基上。γ-分泌酶对所述融合蛋白的切割会从所述平板上释放出所述荧光团或其他标记，从而可以测定化合物对蛋白水解切割的抑制作用，这种作用是通过所保留荧光的增强证实的。γ-分泌酶蛋白分解活性的优选比色测定法采用了其他Notch/NusA融合蛋白，其中，包括用于切割的γ-分泌酶识别位点的氨基酸通过酰胺键与o-硝基苯酚连接，从而在将测定缓冲液改变成碱性pH之后，γ-分泌酶对所述融合蛋白的切割导致了光学密度的提高。
另外，所述Notch/NusA融合蛋白可以用本领域技术人员所熟知的标记物标记，例如，生物素标记是特别有用的。这种标记的使用为本领域技术人员所熟知，并且披露于例如以下文献中美国专利号3,817,837；美国专利号3,850,752；美国专利号3,996,345和美国专利号4,277,437。可以使用的其他标记包括，但不局限于放射性标记，荧光标记和化学发光标记。涉及这种标记的使用的美国专利包括例如美国专利号3,817,837；美国专利号3,850,752；美国专利号3,939,350和美国专利号3,996,345。本发明的任一种Notch/NusA融合蛋白组合物可以包括上述任何标记的一种、两种或两种以上。
II.γ-分泌酶组合物除了新型Notch融合蛋白之外，本发明涉及将所述Notch融合蛋白用于各种γ-分泌酶测定的方法。这一部分提供了对制备包括具有γ-分泌酶活性的蛋白的级份的说明。
尽管γ-分泌酶的确切身份尚有待揭示，有有力证据暗示γ-分泌酶可能是早老素1。尽管事实上γ-分泌酶的序列尚有待确定，本领域技术人员了解用于分离包含γ-分泌酶的细胞级份的方法和组合物。例如，Li等(Proc.Natl.Acad.Sci.976138-6143，2000)披露了用于生产包含增溶γ-分泌酶活性的膜制剂的方法和组合物。这样的方法可用于本发明中，用于提供含有γ-分泌酶的纯化的级份。一旦生产了所述级份，预计可将它用于本发明的测定。另外，本发明的新型融合蛋白还可用于从所述膜级份中进一步分离并且纯化所述γ-分泌酶，例如采用亲和层析分离技术。
γ-分泌酶级份通常可从任何能表达γ-分泌酶活性的细胞中分离。例如，可以使用HeLa3细胞。所述细胞可使用例如弗氏压碎器或其他细胞破碎技术破碎，这些技术包括、但不局限于冻溶技术(例如，让细胞在干冰和37℃水浴之间循环)；使用Hughes或弗氏压碎器的固态剪切方法；去污剂裂解(例如，on-ionic去污剂溶液，如Tween，Triton，NP-40等)；低渗溶液裂解(例如，水，柠檬酸缓冲液)；液态剪切方法(匀浆器；撞击-喷射微流化器)；超声波降解(超声波)。在细胞裂解之后，可以通过离心沉淀除掉细胞碎片和细胞核。所述膜级份可通过例如100,000g的速度离心60分钟而沉淀，并且所述膜级份可以用去污剂进一步溶解。例如，在由Li等在上文所披露的溶解方法中，将来自100,000g离心步骤的膜级份沉淀重悬浮在缓冲液中，并且在4℃下用1％CHAPSO处理60分钟，再离心60分钟。所述去污剂溶解方法可使得100,000g级份的上清液包括溶解化的γ-分泌酶。
将上述溶解化的级份用于在本文中所披露的γ-分泌酶测定。
III.蛋白或肽生产和纯化本发明提供了用于鉴定γ-分泌酶的调节剂的可溶性Notch蛋白底物，所述调节剂对APP切割是特异性的，但是不能抑制Notch切割。这样的底物可以通过常规自动化肽合成方法或重组表达生产。
A.合成肽生产本发明的所述肽或实际上完整长度的融合多肽可以按照常规技术在溶液或在固体支持物上合成。各种自动化合成仪可以通过商业渠道获得，并且可以按照已知方法使用。例如，参见Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.，(1984)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.，1056442，1983；Merrifield，Science，232341-347，1986；和Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer，eds，Academic Press，New York，1-284，1979，分别被收入本文作为参考。本发明的新型Notch融合蛋白底物包括能够被γ-分泌酶切割的γ-分泌酶切割位点1731/1732和1743/1744，所述底物可以方便地合成，然后在γ-分泌酶筛选测定中筛选。
在特别优选的方法中，本发明的融合蛋白是通过采用购自AppliedBiosystems Inc.的Model433A的固相技术合成的。可以采用反相HPLC分析测定通过自动化肽合成或通过重组方法制备的任何特定Notch融合蛋白的纯度。可以通过本领域技术人员所熟知的任何方法确定每一种肽的化学真实性。在优选实施方案中，所述真实性是通过质谱分析确定的。
另外，所述融合蛋白可以通过氨基酸分析定量，其中进行微波水解。所述分析可以使用微波炉，如CEM公司的MDS 2000微波炉。使所述肽(大约2mg蛋白)与6N HCl(Pierce Constant Boiling，例如大约4ml)和大约0.5％(体积比)苯酚(Mallinckrodt)接触。在水解之前，交替对所述样品进行抽真空和用N2冲洗。使用两阶段方法进行蛋白水解。在第一阶段，使所述融合蛋白处于大约100℃的反应温度，并且在该温度下保持1分钟。在该步骤之后，立即将温度提高到150℃，并且在该温度下保持大约25分钟。在冷却之后，使所述样品干燥，并且对来自所述水解的融合蛋白样品的氨基酸用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯衍生化，产生稳定的脲，它能产生395nm波长的荧光(WatersAccQ Tag Chemistry Package)。所述样品可以通过反相HPLC分析，并且可以用强化积分仪进行定量。
B.重组蛋白生产作为自动化肽合成的替代方案，可以采用重组DNA技术，其中，将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞中，并且在如下文所述的适合表达的条件下培养。重组方法特别优选用于生产包括本发明肽序列的较长多肽。根据本发明对新型Notch融合蛋白底物的说明，可以通过重组技术生产所述融合多肽。有多种表达载体/宿主系统可用于包含并且表达所述肽或融合多肽编码序列。其中包括，但不局限于微生物，如用重组噬菌体，质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括，但不局限于VERO细胞，HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，COS细胞(如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和293细胞。下面披露了用于在细菌，酵母和其他无脊椎动物中重组表达所述Notch融合体的示例性方法。
用于原核宿主的表达载体通常包含一个或多个表型选择标记基因。这种基因通常编码例如赋予抗生素抗性的蛋白或补充营养缺陷型需求的蛋白。有多种这样的载体可以通过商业渠道方便地获得。其例子包括pSPORT载体，pGEM载体(Promega)，pPROEX载体(LTI，Bethesda，MD)，Bluescript载体(Stratagene)，pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)。编码给定Notch融合蛋白的DNA序列可通过PCR扩增，并且克隆到所述载体中，例如设计成产生包含由所述载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入所述载体的克隆位点的DNA片段编码的蛋白质的融合蛋白的pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，NJ)。可以将用于所述PCR的引物制成包括例如合适的切割位点。预计用凝血酶或因子Xa(Pharmacia，Piscataway，NJ)处理所述重组融合蛋白能切割它，从GST部分上释放所述底物或包含底物的多肽。将pGEX-3X/融合肽构建体转化入大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，La Jolla CA)，并且分离和培养单个转化体。纯化来自单个转化体的质粒DNA，并且用自动化测序仪进行部分测序，以便证实处于正确方向的所需肽或多肽编码核酸插入片段的存在。
GST/底物融合蛋白的诱导是通过以下方式实现的在37℃下在LB培养基(补充了羧苄青霉素)中将转化的XL 1 Blue培养物生长到在600nm波长下的光学密度为0.4，然后在存在0.5mM异丙基*-D-硫代半乳吡喃糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)的条件下继续培养4小时。
所述GST融合蛋白预计以不溶性包涵体形式在所述细菌中生产，可以按以下方法进行纯化。通过离心收获细胞；用0.15M NaCl，10mMTris，pH 8，1mM EDTA洗涤；并且在室温下用0.1mg/ml溶菌酶(SigmaChemical Co.)处理15分钟。通过超声波处理清除所述裂解物，并且通过以12,000×g的速度离心10分钟使细胞碎片沉淀。将含有所述融合蛋白的沉淀物重新悬浮在50mM Tris(pH 8)和10mM EDTA中，铺放在50％甘油上，并且以6000×g的速度离心30分钟。将沉淀物重新悬浮在不含Mg++和Ca++的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离所述重新悬浮的沉淀物而进一步纯化所述融合蛋白(Sambrook等eds.Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。将所述凝胶浸泡在0.4M KCl中以便显现所述蛋白，将所述蛋白切下来，并且在不含SDS的凝胶电泳缓冲液中进行电洗脱。如果所述GST/Notch融合蛋白是以可溶性蛋白形式在细菌中生产的话，可以用GST Purification Module(PharmaciaBiotech)纯化。
所述融合蛋白可以进行凝血酶消化，以便从成熟的Notch融合多肽上切割所述GST。所述消化反应(20-40μg融合蛋白，20-30单位的人凝血酶(4000U/mg(Sigma)，存在于0.5ml PBS中)在室温下温育16-48小时，并且加样到变性SDS-PAGE凝胶上，以便分级分离所述反应产物。将所述凝胶浸泡在0.4M KCl中，以便显现所述蛋白质条带。相应于所述融合多肽预期分子量的蛋白质条带的身份可以通过使用自动化测序仪的部分氨基酸序列分析方法证实(Applied BiosystemsModel 473A，Foster City，CA)。
另外，可以将编码含有编码推测底物的融合多肽的DNA序列克隆到包括需要的启动子，并且可选地包括前导序列的质粒上(例如，参见Better等，Science，2401041-43，1988)。可以通过自动化测序证实该构建体的序列。然后采用CaCl2温育和细菌热休克处理经标准方法将所述质粒转入大肠杆菌(Sambrook等，同上)。让转化的细菌在补充了羧苄青霉素的LB培养基中生长，并且通过在合适培养基中生长诱导所述表达蛋白的产生。如果存在的话，所述前导序列会影响成熟的Notch-型融合蛋白的分泌，并且在分泌期间裂解。
所述分泌的重组蛋白是通过本文所披露的方法从细菌培养基中纯化的。类似的，可以将来自包括酵母属，毕赤酵母属，和克鲁维酵母属在内的生物属的酵母宿主细胞用于制备所述重组肽。优选的酵母宿主是酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。酵母载体通常包括来自2T酵母质粒的复制序列起点，自主复制序列(ARS)，启动子区，聚腺苷酸化序列，转录终止序列，以及选择标记基因。还可以使用能够在酵母和大肠杆菌二者中复制的载体(称之为穿梭载体)。除了上面所提到的酵母载体的特征之外，穿梭载体还可以包括用于在大肠杆菌中复制和选择的序列。在酵母宿主中表达的多肽的直接分泌可以通过在编码所述底物的核苷酸序列的5′末端添加编码酵母I-因子前导序列的核苷酸序列而实现。
一般地，给定底物可以在酵母中使用可通过商业渠道获得的表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，按照生产商的说明进行重组表达。该系统还取决于指导分泌的前原α序列，不过，所述插入片段的转录是在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动的。
所述分泌的重组底物是从酵母生长培养基中纯化的，例如，通过用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化底物的方法。
另外，可以将编码本发明新型底物的合成DNA克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，SanDiego，CA；Luckow和Summers，BiolTechnology 647(1988))上。然后按照生产商的说明(PharMingen)将这种含有底物的载体用于在s F9无蛋白培养基中感染草地夜蛾，并且生产重组蛋白。使用肝素-Sepharose柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)和系列分子大小分级柱(Amicon，Beverly，MA)从所述培养基中纯化和浓缩所述蛋白或肽，并且重新悬浮在PBS中。SDS-PAGE分析显示有一条带，证实了所述蛋白的大小，并且在Porton 2090肽测序仪上进行的Edman测序证实了它的N-末端序列。
另外，所述Notch融合蛋白底物可以在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的昆虫系统为本领域技术人员所熟知。在一种这样的系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体，用于在草地夜蛾细胞或Trichoplusia larvae中表达外源基因。将所述底物编码序列克隆到病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并且使它受所述多角体蛋白启动子的控制。底物的成功插入会使得多角体蛋白基因失活，并且产生缺少外壳蛋白外被的重组病毒。然后将这种重组病毒用于感染草地夜蛾细胞或Trichoplusia larvae，在其中表达所述底物(Smith等，J Tirol 46584，1983；Engelhard EK等，Proc.Nat.Acad.Sci.913224-7，1994)。
用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统同样为本领域技术人员所熟知。可以针对加工所表达的蛋白或产生某些可提供蛋白活性的翻译后修饰的能力选择宿主细胞株。所述多肽的这种修饰包括，但不局限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。裂解所述蛋白的“前原”形式的翻译后加工对于正确插入，折叠和/或功能来说可能同样是重要的。诸如CHO，HeLa，MDCK，293，WI38等的不同宿主细胞具有特殊细胞器和特征机制，可以实现所述翻译后活性。可以选择宿主细胞，以便确保所导入的外源蛋白的正确修饰和加工。
优选将转化过的细胞用于长期的高产量蛋白生产，并且这种稳定表达是理想的。一旦用包括选择标记和需要的表达盒的载体转化了所述细胞，就可以让所述细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们转移到选择培养基中。将所述选择标记设计成能产生对选择的抗性，并且它的存在使得成功地表达所导入序列的细胞可以生长和回收。可以使用适合所述细胞的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性团块。
有多种选择系统可用于回收业已转化用于重组蛋白生产的细胞。所述选择系统包括，但不局限于分别存在于tk-，hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。另外，可以将抗代谢物抗性用作选择以下基因的基因dhfr，它能产生对氨甲蝶呤的抗性；gpt，它能产生对霉酚酸的抗性；neo，它能产生对氨基糖苷G418的抗性；ALS，它能产生对chlorsulfuron的抗性；和hygro，它能产生对对潮霉素的抗性。可以使用的其他选择基因包括trpB，它允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允许细胞利用组胺醇代替组氨酸。能提供鉴别转化体的视觉标志的标记包括花色素苷，b-葡糖醛酸糖苷酶以及它的底物GUS，和萤光素酶以及它的底物萤光素。
C.位点特异性诱变位点特异性诱变是可用于制备单个γ-分泌酶底物肽、尤其是包含本发明的γ-分泌酶底物融合蛋白之一作为其成分的融合蛋白的另一种技术。这种技术采用了所述基本DNA(它编码作为修饰目标的氨基酸序列)的特殊诱变。考虑上述一种或多种因素，通过将一个或多个核苷酸变化导入所述DNA，所述技术还可以容易地用于制备并且检测序列变体。通过使用编码具有所需突变的DNA序列以及足够数量的相邻核苷酸的特殊寡核苷酸序列生产突变体，以便提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列，在要转变的缺失接合处两侧形成稳定的双链体，可以经位点特异性诱变生成突变体。通常，长度为大约17-25个核苷酸的引物是优选的，其中所述序列接合处两侧的大约5-10个残基得到改变。
所述技术通常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。可用于定位诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。所述噬菌体载体可以通过商业渠道获得，并且它们的应用为本领域技术人员所熟知。双链质粒通常也可常规用于定位诱变中，这种方法中不需要将感兴趣的基因从噬菌体转移到质粒中的步骤。
一般地，定位诱变是这样进行的首先获得单链载体，或者将双链载体的双链熔解，所述载体的序列上包括编码所需蛋白的DNA序列。通过合成制备具有需要的突变序列的寡核苷酸引物。然后让该引物与所述单链DNA制剂退火，在选择杂交(退火)条件时，要考虑错配程度。用诸如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的DNA聚合酶处理，以便完成所述具有突变的链的合成。因此，形成了异源双链体，其中一股链编码原始非突变序列，而第二股链具有需要的突变。然后将这种异源双链体用于转化诸如大肠杆菌细胞的合适细胞，并且选择包括具有所述突变序列排列的重组载体的克隆。
当然，上述用于定位诱变的方法不是制备潜在有用的突变肽类型的唯一方法，因此并非局限于此。本发明还涉及实现诱变的其他方法，例如，用诸如羟胺的诱变剂处理具有感兴趣基因的重组载体，以便获得序列变体。
D.蛋白质纯化比较理想的是纯化本发明的融合蛋白。蛋白纯化技术为本领域技术人员所熟知。这些技术在一种水平上涉及将细胞环境大致分级分离成多肽和非多肽级份。在将本发明的所述肽或多肽与其他蛋白分离之后，可以用层析和电泳技术进一步纯化感兴趣的融合多肽或肽，以便实现部分或完全纯化(或纯化到均一)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换层析，排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。特别有效的纯化融合蛋白的方法是快速蛋白液相层析(FPLC)或者甚至是高效液相层析(HPLC)。在特别优选的实施方案中，所述NusA-Notch融合体可通过固定化金属亲和层析(IMAC)分离。
IMAC主要被用于纯化多聚组氨酸标记的重组蛋白。在本发明中，所述融合蛋白的C-末端包括多聚组氨酸标记，可以通过这种有效的技术纯化。这种纯化取决于组氨酸螯合二价金属的天然倾向。将金属离子放在层析支持物上，可以纯化出所述组氨酸标记的蛋白。这是业已被本领域技术人员用于多种蛋白纯化方法的高度有效的方法。在实施例1中披露了分离本发明蛋白的优选实施方案的典型条件。不过，应当理解的是，本领域技术人员可以改变所述条件和培养基，并且仍然能按本发明实现纯化。为此，本领域技术人员可以参见美国专利号4,431,546，其中披露了从混合物中对生物学或相关物质进行金属亲和层析分离的详细方法。在上述专利中披露的层析介质包括结合材料，其中具有含有蒽醌、酞菁或芳香族偶氮中的至少一种基团的配体，并且在选自下列一组中的至少一种金属离子存在下进行Ca2+，Sr2+，Ba2+，Al3+，Co2+，Ni2+，Cu2+或Zn2+。其他培养基和条件披露于以下网站例如，http//www.affiland.com/imac/nta.Htm和http//www.affiland.com/imac/pdc.Htm。
本发明的某些方面涉及编码的多肽、蛋白或肽的纯化，并且在具体实施方案中涉及其实质性纯化。在本文中，术语″纯化的多肽、蛋白或肽″用于表示与其他成分分离的组合物，其中，所述多肽、蛋白或肽相对于用于产生所述蛋白的细胞或合成成分来说纯化到任意程度。因此，纯化的多肽、蛋白或肽还表示离开它天然存在的环境的多肽、蛋白或肽。
一般，″纯化的″指业已进行过分级分离、以便除去各种其他成分的多肽、蛋白或肽，并且，该组合物大体上保持了它的表达的生物学活性。其中，使用术语″大体上纯化的″时，该术语表示其中所述多肽、蛋白或肽构成主要成分的组合物，如占组合物中蛋白质的大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％，大约95％或更高。
本领域技术人员通过阅读本说明书可以了解对所述多肽、蛋白或肽的纯化程度进行定量的各种方法。其中包括例如确定活性级份的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级份内的多肽量。评估级份纯度的优选方法是计算所述级份的比活性，将该比活性与原始提取物的比活性进行比较，并因此计算纯度，在这里通过″纯化倍数″评估。当然，用于表示所述活性量的实际单位取决于选择用于所述纯化的特定测定技术，以及所述表达的多肽、蛋白或肽是否具有可检测活性。
各种适用于蛋白纯化的技术为本领域技术人员所熟知。其中包括，例如，用硫酸铵沉淀，PEG，抗体等或通过加热变性然后离心；层析步骤，如离子交换，凝胶过滤，反向，羟磷灰石和亲合层析；等电聚焦；凝胶电泳；和上述方法与其他技术的组合。正如本领域中所公知的，相信进行各个纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然能得到用于制备大体上纯化的多肽、蛋白或肽的合适方法。
没有普遍要求所述多肽、蛋白或肽总是以它们的最纯的状态提供。实际上，预计不太纯的产品在某些实施方案中可以使用。部分纯化可以通过总体使用较少纯化步骤来实现，或者通过使用同一普遍纯化方法的不同形式进行。例如，可以理解的是，使用HPLC装置进行的阳离子交换柱层析得到的纯化“-倍数”一般大于采用低压力层析系统的相同技术。在蛋白产物的总回收量方面，或在保持所表达蛋白的活性方面，具有较低相对纯化程度的方法可能是优选的。
已知多肽的迁移可能随着SDS/PAGE的不同条件而改变，有时候是显著改变(Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76425，1977)。因此，应当理解的是，在不同电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可以改变。
IV.用于生产本发明底物的表达构建体在本发明中，可能必须表达本发明的Notch融合蛋白。为了实现这种表达，本发明采用了包括编码本发明的Notch融合蛋白的多核苷酸分子的载体，以及用所述载体转化的宿主细胞。所述多核苷酸分子可以与载体连接，该载体通常包括选择标记和复制起点，以便在宿主中增殖。在本发明中使用的表达构建体的这些因子在下文进一步详细披露。
所述表达载体包括编码上文或下文所述给定肽或融合多肽γ-分泌酶底物的DNA，它选择性地与合适的转录或翻译调控序列连接，如来自哺乳动物，微生物，病毒，或昆虫基因的调控序列。调控序列的例子包括转录启动子，操纵子或增强子，mRNA核糖体结合位点，和控制转录和翻译的合适的序列。
术语″表达载体″，″表达构建体″或″表达盒″在本说明书中可以互换使用，它们表示包括包含编码基因产物的核酸的任何类型遗传构建体，其中，所述核酸编码序列的一部分或全部是能够转录的。
当然，用于表达本发明融合多肽的合适表达载体的选择取决于要使用的特定宿主细胞，并且属于普通技术人员的技能范围。合适的表达载体的例子包括pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(Pharmacia Biotech)。用于在本发明中表达的优选载体是pcDNA3.1-Hygro(Invitrogen)。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括来自病毒基因组的转录和翻译控制序列。可用于本发明的常用的启动子序列和增强子序列包括，但不局限于来自人巨细胞病毒(CMV)，腺病毒2，多瘤病毒，和猿猴病毒40(SV40)的序列。用于构建哺乳动物表达载体的方法，被披露在例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3280，1983)；Cosman等(Mol.Immunol.23935，1986)；Cosman等(Nature 312768，1984)；BP-A-0367566；和WO 91/18982中。
所述表达构建体包括编码本发明特定Notch融合蛋白的核酸区。用于构建所述表达载体的编码区应当至少编码本文所披露的所述融合蛋白的γ-分泌酶切割，当然，预计可以编码更大的多肽，只要所产生的肽之一包括可以通过γ-分泌酶切割的γ-分泌酶切割位点1731/1732和1743/1744就行。
在本发明的某些方面，所述表达构建体还可以包括它可用于检测所述肽或多肽表达的选择标记。通常，药物选择标记的使用有助于转化体的克隆和筛选。例如，新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，DHFR，zeocin和组胺醇。另外，可以采用诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)(真核的)，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，或氯霉素酰基转移酶(CAT)(原核的)之类的酶。还可以使用免疫学标记，例如，可以使用表位标记，如FLAG系统(IBI，New Haven，CT)，HA和6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。另外，还可以使用谷胱甘肽S-转移酶(GST)系统(Pharmacia，Piscataway，NJ)，或麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，MA)。相信所使用的选择标记并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达就行。选择标记的其他例子为本领域技术人员所熟知。可用于本发明的特别优选的选择标记是新霉素抗性或GFP标记。
表达要求在所述载体上提供合适的信号。本部分包括有关各种调控元件的讨论，如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，它们可用于驱动感兴趣的核酸在宿主细胞中表达。还对被设计成优化在宿主细胞中的信使RNA稳定性和翻译能力的元件作了说明。还提供了将多种显性药物选择标记用于建立永久性的、表达所述产物的稳定细胞克隆的条件，以及将所述药物选择标记与突变表型的表达联系在一起的因素。
在优选实施方案中，编码给定肽的核酸或编码选择标记的核酸受启动子的转录控制。“启动子”表示由细胞的合成器官，或导入的合成器官识别的DNA序列，它是启动基因的特异性转录所必需的。
当所述调控序列与编码所述Notch融合蛋白的DNA在功能上相关时，这些核苷酸序列就是可操作地连接的。因此，如果启动子核苷酸序列能指导给定DNA序列的转录，则所述启动子核苷酸序列就是与该DNA序列可操作地连接的。类似的，短语“受转录控制”表示所述启动子相对于所述核酸处于正确的位置和方向上，可以控制RNA聚合酶启动和所述基因的表达。
术语启动子在本文中被用于表示围绕在RNA聚合酶II的起始位点周围成簇的一组转录控制组件。有关启动子如何组织的大部分想法来自对若干病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的启动子。得到了最新研究工作支持的上述研究业已证实了启动子是由离散的功能性组件组成的，各组件各自由DNA的大约7-20bp组成，并且包括转录激活剂或抑制剂蛋白的一个或多个识别位点。
在每一个启动子上的至少一个组件起着定位RNA合成的起始位点的作用，其中最著名的例子是TATA框，不过在缺少TATA框的某些启动子中，如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，覆盖所述起始位点的离散因子本身有助于固定起始位置。
其他启动子因子能调节转录起始的频率。通常，这些因子位于起始位点上游30-110bp的区域内，不过，最近业已证实了多种启动子同样包括位于所述起始位点下游的功能性元件。启动子因子之间的距离通常是可变的，从而在所述启动子倒转或彼此相对移动时仍保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始减弱之前，启动子因子之间的距离可增加到50bp。根据所述启动子，似乎单个因子能够协同地或独立地起作用，以便激活转录。用于控制感兴趣的核酸序列表达的特定启动子据信是不重要的，只要它能指导所述核酸在靶细胞中的表达就行。因此，在靶定人细胞时，优选将所述核酸编码区定位在与能够在人类细胞中表达的启动子相邻之处并受该启动子的控制。一般来说，这样的启动子可能包括人或病毒启动子。
在各种实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子，SV40早期启动子，劳氏肉瘤病毒长末端重复，β-肌动蛋白，大鼠胰岛素启动子，磷酸甘油激酶启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，所有这些启动子都是本领域技术人员众所周知的并可以方便地获得的启动子，可将其用于感兴趣的编码序列的高水平表达。还涉及将本领域所公知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子用于实现感兴趣的编码序列的表达，只要表达水平对于特定目的来说是足够的即可。通过采用具有已知特性的启动子，可以优化转染或转化之后感兴趣的蛋白的表达水平和形式。
根据特殊生理学或合成信号调控的启动子的选择可以进行所述基因产物的诱导型表达。可以将若干诱导型启动子系统用于病毒载体的生产。一种这样的系统是蜕皮激素系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)，它被设计成能够实现感兴趣的基因在哺乳动物细胞中的受控制表达。它包括严格调控的表达机制，从而实际上没有转基因的基础水平表达，但是具有超过200倍的可诱导性。
另一种有用的诱导系统是Tet-OffTM或Tet-OnTM系统(Clontech，Palo Alto，CA)，它们最初是由Gossen和Bujard开发的(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.15；89(12)5547-51，1992；Gossen等，Science，268(5218)1766-9，1995)。
在哺乳动物细胞中，CMV立即早期启动子常常被用来实现强的转录激活。在需要转基因的较低水平的表达时，使用了CMV启动子的较弱的经修饰形式。诸如来自MLV或MMTV的LTRs之类的逆转录病毒启动子预计可用于本发明中。可以使用的其他病毒启动子包括SV40，RSV LTR；HIV-1和HIV-2LTR，腺病毒启动子，如来自E1A，E2A，或MLP区，AAVLTR，花椰菜花叶病毒，HSV-TK，和禽肉瘤病毒的启动子。
在某些实施方案中，可调控的启动子可能是有用的。例如，所述启动子包括激素或细胞因子可调控的启动子。激素可调控的启动子包括MMTV，MT-1，蜕皮激素和RuBisco，以及其他激素调控的启动子，如对甲状腺、脑垂体和肾上腺激素有响应的启动子。
可用于本发明的其他调控因子是增强子。增强子是能增强从位于同一DNA分子上的远处部位的启动子开始的转录的遗传学元件。增强子的组构更像启动子，即它由多个独立的因子组成，各自与一种或多种转录蛋白结合。增强子和启动子之间的根本差别是可操纵性。增强子区作为整体必须能够在远处刺激转录；对于启动子区或它的组成元件来说这一特征不是必须的。另一方面，启动子必须具有能够在特定位点并且沿特定方向指导RNA合成启动的一个或多个元件，而增强子缺少这样的特异性。启动子和增强子通常是重叠的并且是毗邻的，通常似乎具有非常类似的组件组构。可用于本发明的增强子为本领域技术人员所熟知，并且取决于所采用的特定的表达系统(Scharf D等，(1994)Results ProblCell Differ 20125-62；Bittner等，(1987)Methods in Enzymol.153516-544)。
当表达构建体采用cDNA插入片段时，人们通常希望采用聚腺苷酸化信号序列，以便实现所述基因转录物的正确聚腺苷酸化。由所选择的转基因动物物种的细胞识别的任何聚腺苷酸化信号序列都适合实施本发明，如人或牛生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。
可以作为所述表达盒元件的还有终止子。这些元件可以提高信息水平，并且使得从所述表达盒通读到其他序列中的可能性减至最小。主要使用的终止区可根据方便性而选择，因为用于诸如本发明的目的终止区似乎是相对可互换的。终止区可以是所述转录起始的天然区，可以是感兴趣的DNA序列的天然区，或者可以来自其他来源。
在本发明的某些实施方案中，可以将内部核糖体进入位点(I RES)因子用于产生多基因，或多顺反子信息。IRES因子能够绕过5′甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模式，并且在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，Nature，334320-325，1988)。业已披露了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎)的IRES因子(Pelletier和Sonenberg，1988同上)以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，Nature，35390-94，1991)。IRES因子可以与异源开放读框连接。多个开放读框可以一起转录，各自通过I RES隔开，产生多顺反子信息。通过IRES因子，每一个开放读框都是核糖体可以接触的，以便有效翻译。用一个启动子/增强子转录一种信息，能够有效表达多个基因。
任何异源开放读框都可以与IRES元件连接。其中包括分泌蛋白的基因，由独立基因编码的多亚基蛋白，细胞内或膜结合蛋白以及选择标记。这样，若干蛋白的表达可以用一种构建体和一种选择标记而同时通过工程方法在细胞中进行。
V.将所述底物用于γ-分泌酶测定在具体实施方案中，本发明涉及监测γ-分泌酶的活性和/或功能的测定法，更具体地讲是γ-分泌酶活性和/或γ-分泌酶功能。所述测定法涉及在溶液中温育γ-分泌酶复合物(或纯化的多肽)与本发明的合适的底物，利用所述Notch融合蛋白的切割作为γ-分泌酶蛋白水解活性的度量。
A.测定方案在具体实施方案中，本发明涉及用于鉴定能调节人γ-分泌酶活性的制剂的方法。所述测定的一个方面是在有和没有潜在的调节化合物或药剂的条件下监测γ-分泌酶在ε切割位点1743/1744上的Notch-切割活性。例如，用于测定Notch-切割的这种方法通常包括以下步骤(a)使本发明的任意的Notch/NusA融合蛋白在体外与包含γ-分泌酶活性的组合物接触；(b)测定所述γ-分泌酶对所述Notch/NusA融合蛋白在γ-分泌酶切割位点处的切割。
包含γ-分泌酶活性的组合物通常可以是包含γ-分泌酶活性的任何分离的组合物。因此，所述组合物可以是从细胞中分离的膜级份(具有γ-分泌酶活性的天然细胞，或业已工程改造成能表达所述活性的重组宿主细胞)。另外，组合物可以包括分离的和纯化的γ-分泌酶蛋白，其基本上不含其他蛋白。
为了鉴定γ-分泌酶的Notch切割活性的调节剂，在有和没有候选调节剂的条件下实施上述步骤(a)和(b)，并且通过将在有所述测试制剂存在时γ-分泌酶的Notch切割活性和在不存在所述测试制剂时的活性相比较，鉴定调节γ-分泌酶的这种切割的制剂，从而评估调节剂的调节活性。在存在所述候选调节剂的条件下Notch切割的量或程度的任何改变是在存在所述测试制剂的条件下γ-分泌酶活性改变的指征，鉴定出作为所述γ-分泌酶活性的调节剂的制剂。
能导致相对所述对照(非测试制剂)切割增强的制剂评判为γ-分泌酶蛋白质分解活性的激动剂或促进剂，而导致在Aβ1-40和/或Aβ1-42处的切割减弱的制剂评判为抑制剂。γ-分泌酶的抑制剂具有特殊价值，因为γ-分泌酶活性的抑制剂具有用于治疗和预防AD或它的症状或发展的治疗性和预防性作用。
由于需要发现与本发明的融合蛋白的切割相比能够优先抑制γ-分泌酶介导的APP或CT-100切割的测试化合物，可以在使用本发明的测定同时或之前对测试化合物进行评估，以便确定它们调节APP切割的能力。测定γ-分泌酶介导的APP或CT-100切割的方法为本领域所熟知。例如，WO/01/83811披露了可用于测定APP或CT-100切割的底物和体外测定方法。WO/01/83811披露了包含M末端Met(M)，APP597-695和FLAG标记的γ-分泌酶底物，以及用于它的切割和切割产物检测的方法和条件(M-Aβ40和M-Aβ40)。
能够抑制在Aβ1-40和/或Aβ1-42处的APP/CT-100切割活性、而不能抑制所测定的γ-分泌酶的Notch切割活性的抑制剂是最优选的。
所述γ-分泌酶可以是纯化的γ-分泌酶多肽或它的复合物或生物活性片段，类似物，或变体。在优选实施方案中，所述γ-分泌酶来自展示γ-分泌酶活性的细胞的膜级份。所述膜级份优选包括γ-分泌酶复合物所需要的所有成分。还可将人γ-分泌酶的非人直向同系物用于测定法中。
将本发明的测定法设计成用γ-分泌酶多肽在无细胞系统中进行。例如，在无细胞系统中，所述接触步骤可以通过将γ-分泌酶或含有所述酶的膜级份与本发明的肽或蛋白底物在有或没有测试制剂的条件下相混合而进行。为了获得最佳结果，所述酶和γ-分泌酶底物优选是实质上纯化的，以特定的和受控制的量混合，并且在能使酶促活性最优化和/或模拟生理学条件的合适的缓冲液中混合。
所述测定步骤可以涉及N-末端片段，C-末端片段或这两者的测定，或者可以涉及裂解的其他参数指标的测定。例如，所述Notch-型或其他γ-分泌酶底物可以包含淬灭标记，它只有在发生裂解而使所述标记与淬火部分分离开之后才变得更容易检测。另外，所述Notch-型或其他γ-分泌酶底物可以在N-末端或C-末端固定在固体支持物上。在这种方案中，可以通过从固体支持物上释放裂解片段而测定所述裂解。所述释放可以通过介质中标记的增加，或所述固体支持物上结合的标记的减少来衡量。另外，所述释放可以通过所释放肽的定量捕获来测定(例如，使用抗体)。
在本发明的优选实施方案中，所述切割的Notch蛋白是使用对Val-1744特异的抗体检测的。在更优选的实施方案中，所述切割的Notch蛋白是使用根据抗-Val 1744抗体和抗-Flag抗体开发的ELISA检测的。将抗-Val 1744抗体用于检测所述切割的一种片段，而将抗-Flag抗体用于检测所述Notch蛋白的片段(C-末端)，它是通过γ-分泌酶的作用产生的。这种测定方法在实施例中更详细地披露。
当然，上述测定只是说明性的，并且还可以使用其他测定方法。例如，上述测定可以以如下方式建立。用BSA封闭384孔微量滴定板，将要测定的γ-分泌酶和50μM的γ-分泌酶抑制剂化合物温育1小时，并且通过添加Notch/NusA融合蛋白底物启动所述反应。在最终的测定条件下，体积为30μl/孔；50μM化合物；15ng酶/孔；250nM底物；5％DMSO和0.001％TWEEN-20。所述测定在室温下培养过夜，并且通过添加Tris-HCl，pH 8.3终止反应。取出包含6.25皮摩尔底物的等分样品，并且将切割和/或未切割的底物俘获在包被了链霉抗生物素蛋白的平板上。洗涤所述平板3次，并且添加缓冲液。通过在LJL分析仪(Ex485/Em530)上读出由Oregon绿发出的荧光来监测所述俘获测定。
本发明可以使用的另一种测定方法是荧光偏振测定法。荧光偏振测定法是一种灵敏的，便捷的和非破坏性的方法，可用于监测候选制剂对本发明γ-分泌酶复合物的作用。可将它用于监测所述底物与γ-分泌酶的相互作用。在受控制的条件下，荧光偏振测定能够揭示荧光分子在溶液中的“分子抖动”程度，例如，预计具有紧凑分子空间的小分子会快速地抖动。如果用偏振光照射的话，所述分子在溶液中的快速运动会导致光线的充分去偏振化，并且会产生“低”偏振值的结果。在相同条件下，大分子或大复合物的大分子空间可以延缓分子旋转(抖动)过程。结果会导致平面偏振光的较低的偏振化，并且可以测定较高的偏振值。
通过用荧光探针标记小的配体，可以测定由于配体与另一种系统成分相互作用导致的荧光偏振的改变。这种方法可用于测定酶(γ-分泌酶)和荧光酶底物之间的相互作用强度。
在典型的荧光偏振测定中，在预先封闭的低亲和力黑色平板上，将酶和抑制/调节化合物温育30分钟，通过添加150nM底物(例如，本发明的荧光标记的Notch/NusA融合蛋白)使最终体积为30μl/孔而启动反应。然后在室温下温育所述平板15分钟，并且在LJL Acquest(Ex485/Em 530)上测定荧光偏振。
本发明的一个方面可用于分离并且表征本发明所涉及的γ-分泌酶。该方面涉及用于测定与所述酶的活性位点或变构位点相结合的化合物的结合测定方法。为了进行所述测定，可以使用本发明的Notch底物的不可水解衍生物。例如，在待切割键的接合处存在statine衍生物会使得本发明的Notch在所述切割位点处不能水解。还可以通过添加合适的荧光标记而进一步修饰所述底物，例如添加BODIPY FL，以便有利于检测。
本发明的底物可以用荧光标记进行标记，并且用于开发γ-分泌酶的荧光偏振结合测定方法。通过测定由于用所述酶滴定所述底物而导致的荧光偏振改变，测定所述酶和底物之间相互作用的平衡解离常数(KD)。
为了测定本发明的底物与γ-分泌酶的相互作用的KD，可以将各种量的γ-分泌酶与3.1nM的荧光底物合并，并且在室温下培养3小时。在培养之后，用LJL分析仪(96孔形式)或PanVera Beacon(单样品池形式)测定荧光偏振。一种例示性的测定是在25mM乙酸钠，20％甘油，pH 4.75中进行的。通过将偏振值标在纵轴上、并且将酶的浓度标在水平轴上而获得的数据的图解曲线为测定所述酶与底物的相互作用的KD提供了结合等温线。可以利用以下关系式分析所述数据Px＝PF+(PB-PF)*[E]/(KD+[E])，其中，P＝极化值，x＝样品，F＝游离的抑制剂，B＝结合的抑制剂，E＝γ-分泌酶(Fluorescence PolarizationApplications Guide，1998；PanVera，Madison，WI)，以便获得所述KD。可以将这种测定方法用于筛选能结合所述酶的活性位点或变构位点的化合物。
应当理解的是，在有或没有测试制剂的条件下进行的活性测定，可以平行或以任何顺序依次进行。另外，一旦获得了特定反应条件下的酶促活性的可靠基线水平，可能就没有必要针对每一种测试试剂平行地重复所述对照测定(即在没有测试制剂的条件下测定切割)。在没有抑制剂的条件下获得的有关γ-分泌酶对特定底物(例如，本发明的Notch组合物或来自APP的组合物)的酶促活性的知识可以用作实施所述比较步骤的基础。
B.候选物质在本文中，术语″候选物质″或″测试物质″表示能够调节γ-分泌酶活性优选人γ-分泌酶活性的任何分子。所述候选物质可以是蛋白或它的片段，小分子抑制剂或者甚至是核酸分子。很可能通过采用筛选测定方法鉴定的最有用的药用化合物是通过筛选大的化合物文库鉴定的或者在结构上与APP加工，Notch加工或这两者的其他已知调节剂在结构上相关的化合物。例如，被收作本文参考的美国专利号6,448,229披露了特定类型的化合物，它能抑制γ-分泌酶，而又不影响Notch信号传导，因此可用于治疗或预防AD。诸如披露于美国专利号6,448,229中的化合物可以采用本发明的测定方法验证。另外，所述化合物可以用作合理化药物设计的原材料，用于鉴定可用于本发明的其他候选调节剂。可用于这种合理化药物设计的其他抑制剂包括，但不局限于DAPT(PHA-568638)和葑胺(PHA-512088)。
所述候选物质可以包括天然化合物的片段或部分或者可以以原本无活性的已知化合物的活性组合形式出现。不过，在人体或动物模型中测试所述化合物之前，有必要测试多种候选物，以便测定哪一种更有潜力。
因此，所述候选物质可以包括天然存在的化合物的片段或部分，或者可以以原本无活性的已知化合物的活性组合形式出现。因此，本发明提供了用于鉴定能优先于对Notch进行刺激或抑制而刺激或抑制γ-分泌酶-介导的细胞APP加工的药剂的筛选测定方法。有人提出从天然来源，如动物，细菌，真菌，植物来源，包括树叶和树皮，以及海洋样品中分离的化合物可以作为候选物测定分析潜在有用的药用制剂的存在情况。
应当理解的是，要筛选的药用制剂还可以源于化学组合物或人造化合物或用所述物质合成。因此，可以理解的是，通过本发明鉴定的调节剂可以是多肽，多核苷酸，小分子抑制剂或任何其他无机或有机化合物，它们可以是通过合理化药物设计用γ-分泌酶活性和/或APP加工的已知刺激剂或抑制剂作原材料设计的。
所述候选筛选测定法可容易建立和实施。因此，在调节剂测定中，在获得包含功能性γ-分泌酶的细胞膜级份(例如，包括溶解化γ-分泌酶复合物的细胞膜级份)之后，可以将候选物质与这种γ-分泌酶组合物在存在本发明的新型底物的情况下，在允许可测定的γ-分泌酶活性(所述活性是因切割所述底物而产生的)发挥作用的条件下进行混合。这样，人们可以在缺乏所述候选物质时测定候选物质刺激γ-分泌酶的活性的能力。同样，在获得表达功能性γ-分泌酶的细胞膜级份之后进行的抑制剂测定中，将所述候选物质与所述级份混合。这样，可以检测所述候选性抑制物质减弱、消除或减轻由γ-分泌酶介导的生物学影响的能力。
在某些场合下，物质的“有效量”是能可再现地改变给定CT-100裂解性γ-分泌酶活性或APP加工的用量。所述有效量是，与在没有所述候选物质的情况下观察到的裂解进行比较，能改变APP CT-100的裂解程度或量，但不能改变本发明的Notch融合蛋白在γ-分泌酶裂解位点处的裂解的用量。特别适合用作治疗剂和/或用于其他表征的化合物是与Notch裂解相比能优先抑制γ-分泌酶对APP的裂解的化合物。“优先抑制”表示与Notch相比，所述制剂对APP的γ-分泌酶介导的裂解具有更高的抑制效果。尽管优选的是所述制剂是对所述Notch裂解没有抑制作用的制剂，但对Notch裂解的某些抑制可能是可以接受的，只要它弱于由野生型γ-分泌酶引起的APP裂解就行。
采用本发明的新型γ-分泌酶底物的测定方法适用于多种高处理量筛选(HTS)方法(有关综述参见Jayawickreme和Kost，Curr.Opin.Biotechnol.8629-634，1997)。还涉及自动化和小型化HTS测定，例如以下文献中所述的那些Houston和Banks，Curr.Opin.Biotechnol.8734-740，1997。
存在用于鉴定小分子调节剂的多种不同的文库，包括化学文库，天然产品文库和由随机的或设计的肽，寡核苷酸或有机分子组成的组合文库。化学文库由已知化合物的结构类似物或通过天然产品筛选或根据筛选潜在治疗目标鉴定为命中或前导体的化合物组成。天然产品文库是来自微生物，动物，植物，昆虫或海洋生物的产品的总称，可将其用于制备筛选混合物，例如，通过对来自土壤，植物或海洋生物的培养液的发酵和提取。天然产品文库包括多肽，非核糖体肽或它的非天然存在的变体。有关综述参见Science 28263-68，1998。
组合文库是以混合物形式由大量的肽，寡核苷酸或有机化合物组成。它们可以相对简单地通过传统自动化合成方法，PCR克隆或其他合成方法制备。特别感兴趣的是包括肽，蛋白，肽模拟物，多平行合成组合，重组和多肽文库的文库。有关组合文库和由它制备的文库的综述参见Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8701-707，1997。然后可以优化通过使用所披露的各种文库鉴定的调节剂，以便通过诸如合理化药物设计的方法调节γ-分泌酶活性。
当然，可以理解的是，本发明的所有筛选方法本身是可以使用的，尽管事实上可能不能发现有效的优选物。本发明提供了用于筛选所述候选物的方法，而不仅仅是发现它们的方法。
C.体内测定本发明还涉及各种动物模型的使用。一旦在上文所述的体外环境中筛选出了所述调节剂，则可以将APP加工和/或AD的任何非人模型用于确定所述调节剂的体内作用。这为在正常表达γ-分泌酶的完整动物系统中检查γ-分泌酶的功能提供了极好的机会。
用业已被鉴定为γ-分泌酶活性调节剂的测试化合物对动物进行的处理涉及以合适的形式给所述动物施用所述化合物。施用可以通过可用于临床或非临床目的的任何途径进行，包括，但不局限于口腔，鼻腔，面颊，直肠，阴道或局部施用。另外，施用还可以通过气管内滴注，支气管滴注，真皮内注射，皮下注射，肌内注射，腹膜内或静脉内注射进行。特别涉及到系统性静脉内注射，通过血液的区域性施用，脑脊液(CSF)或淋巴供应和肿瘤内注射。
在体内测定化合物的有效性可能涉及到多种不同的指标。这些指标包括，但不局限于，存活率，提高了的活性水平，以及改善了的食物摄取。其他评估方法包括病理学检查，特别是大脑组织的检查，以便寻求改变了的γ-分泌酶活性的迹象，如减弱了的淀粉样β或淀粉样β斑的产生和减轻了的大脑萎缩。
D.药品生产本发明的测定方法能鉴定代表了用于治疗以异常水平的γ-分泌酶活性为特征的疾病(包括AD在内)的候选治疗剂的γ-分泌酶调节剂。因此，在鉴定调节剂之后，本发明的方法可选地包括生产/合成所述制剂的其他步骤，以及使用可以药用的稀释剂，佐剂或载体将所述制剂制备成组合物的步骤。下面将更详细地披露药物组合物。
VI.药物组合物通过本发明鉴定的Notch加工、APP加工和/或γ-分泌酶切割的调节剂可最终制备成药物组合物，即适合体内使用的形式。一般地，必须制备基本上不含热源以及有可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
人们通常希望采用合适的盐和缓冲液使得所鉴定的调节剂组合物稳定，并且使得它们可以被靶细胞吸收。短语“药物学或药理学可接受的”表示在给动物或人施用时不会产生不利的，过敏的，或其他不良反应的分子实体和组合物。在本文中，″可以药用的载体″包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣剂，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。将所述介质和制剂用于药物学活性物质的用途为本领域所熟知。除非任何常规介质或制剂与通过本发明鉴定的调节剂不相容，否则的话都可将其用于治疗组合物中。还可以将补充性活性成分添加到所述组合物中。
本发明的调节剂组合物包括典型的药用制剂。本发明组合物的服用可以通过任何常规途径进行，只要目标组织可以通过所述途径获得该组合物就行。可以通过任何常规方法将所述药物组合物导入所述对象体内，例如通过静脉内，真皮内，肌内，乳房内，腹膜内，鞘内，眼内，眼球后，肺内(例如，期限释放)；通过口腔，舌下，鼻腔，肛门，阴道，或经真皮投递，或在特定部位通过外科手术植入，例如包埋在脾被膜，大脑，或角膜内。所述治疗可以包括在一定时间内的单一剂量或多个剂量。
用本发明鉴定的调节剂化合物可以制备成以游离碱或可以药用的盐的溶解在水中的溶液形式施用，并可以适当地与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂混合。还可以用甘油，液体聚乙二醇，以及它们的混合物和在油中制备分散液。在储存和使用的普通条件下，所述制剂包含用于抑制微生物生长的防腐剂。
适合注射使用的药用形式包括无菌水溶液或分散液，以及无菌粉末，用于无菌注射溶液或分散液的临时制备。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须流动性足够强，从而便于以可注射形式存在。在生产和储存条件下，它必须是稳定的，并且必须能防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，聚丙二醇，和液体聚乙二醇等)，它们的合适混合物，以及植物油。可以保持适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣剂，对于分散液来说保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂来实现。微生物作用的抑制可以通过各种抗细菌和抗真菌剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯酚，山梨酸，和硫柳汞等。在很多情形下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的长时间吸收可以通过在所述组合物中使用延缓吸收的试剂而实现，例如，单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液可通过以需要的用量将活性化合物掺入合适的溶剂中，同时根据需要掺入上面所列举的其他成分，然后进行过滤除菌而制备。一般地，分散体可通过将各种无菌的活性成分掺入含有碱性分散介质和需要的上文所列举的其他成分的无菌媒介物中而制备。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由此产生了活性成分和来自以前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
在本文中，″可以药用的载体″包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣剂，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延缓剂等。将所述介质和药剂用作药用活性物质的用途为本领域所熟知。除非任何常规介质或药剂与所述活性成分不相容，否则的话预计都可将其用于治疗组合物中。还可以将补充性活性成分掺入所述组合物中。
为了口服，可以将通过本发明鉴定的调节剂与赋形剂混合在一起，并且以不可摄取的漱口水和牙粉形式使用。漱口水可以通过将活性成分以需要的量掺入诸如硼酸纳溶液(Dobell′s溶液)等的合适溶剂中制备。或者，可以将所述活性成分掺入防腐洗液中，其中包括硼酸钠，甘油和碳酸氢钾。所述活性成分还可以分散在牙粉中，包括凝胶，糊剂，粉末和浆体。所述活性成分能够以治疗有效量添加到糊状牙粉中，其中可以包括水，黏合剂，摩擦剂，芳香剂，起泡剂，和湿润剂。
本发明的组合物能够以中性或盐的形式制备。可以药用的盐包括酸加成盐(由所述蛋白质的游离氨基形成)，它可以是与无机酸一起形成，例如，盐酸或磷酸，或与诸如乙酸，草酸，酒石酸，和扁桃酸等的有机酸一起形成的。由游离的羧基形成的盐也可以用无机碱，例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸，和普鲁卡因等的有机碱衍生得到。
本发明的组合物能够以中性或盐的形式制备。可以药用的盐包括酸加成盐(由所述蛋白质的游离氨基形成)，它可以是与无机酸一起形成的，例如盐酸或磷酸，或与诸如乙酸，草酸，酒石酸，和扁桃酸等的有机酸一起形成的。由游离的羧基形成的盐也可以自无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸，和普鲁卡因等的有机碱衍生得到。
在制备时，溶液以与所述剂量配方兼容的形式服用，并且其用量是治疗有效的。所述制剂便于以多种剂型施用，如可注射溶液，和药物释放胶囊等。对于以水溶液形式肠胃外服用，例如，如果必要的话，所述溶液应当是适当缓冲过的，并且首先用足够的盐溶液或葡萄糖使所述液体稀释剂等渗。所述特定水溶液特别适合静脉内，肌内，皮下和腹膜内施用。
″单位剂量″被定义为分散在合适载体中的治疗组合物的离散量。例如，肠胃外服用可以通过起始药团进行，然后连续输液，以便保持药物制品的治疗性循环水平。本领域普通技术人员可以方便地优化有效剂量和服用方案，可通过良好的医学实践和具体患者的临床症状确定。更具体地讲，应当选择所述剂量，以便减弱，抑制，减轻或消除Aβ-肽的形成，尤其是表现AD的对象的大脑中的噬斑形成。为实现这种效果，本领域技术人员能够采用AD的动物模型(例如，正如在美国专利号5,877,399；美国专利号5,387,742；美国专利号5,811,633中所披露的)，以便优化剂量给药方案，并且预测干预人类对象中的AD所需要的药用制剂的相关用量。
用药频率取决于所述药剂的药物动力学参数以及服用途径。最佳药用制剂可由本领域技术人员根据服用途径和需要的剂量确定。例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，MackPubl.Co，Easton PA 18042)pp 1435-1712，被收作本文作为参考。所述制剂可能影响所服用药剂的物理状态，稳定性，体内释放速度和体内清除速度。根据服用途径，可以根据体重，身体表面积或器官大小计算合适的剂量。确定合适治疗剂量所需要的计算的进一步微调通常可由本领域普通技术人员在不进行过多实验的情况下完成，特别可以参照本文所披露的剂量信息和测定方法，以及在动物或人类临床试验中所观察到的药物动力学数据。
合适的剂量可以通过使用已建立的用于结合相关剂量响应数据确定血液含量的测定来确定。最终剂量方案将由主治医生确定，其中考虑了能改变药物作用的因素，例如药物的比活性，损伤的严重程度以及患者的反应性，患者的年龄，状态，体重，性别和饮食，任何感染的严重性，给药时间和其他临床因素。随着研究的进行，将会得到有关对于特定疾病和症状的合适剂量水平和治疗时间的进一步信息。
应当理解的是，本发明的药物组合物和治疗方法可用于人类医学和兽医学领域。因此，要治疗的对象可以是哺乳动物，优选人或其他动物。对于兽用目的来说，对象包括例如农场动物，包括牛，绵羊，猪，马和山羊，宠物，如狗和猫，外来的和/或动物园动物，实验室动物，包括小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和仓鼠，以及家禽，如鸡，火鸡，鸭和鹅。
VI.实施例采用以下实施例，是为了说明本发明的优选实施方案。不过，在本说明书的教导下，本领域技术人员完全能够领会可以在不超出本发明构思和范围的前提下对所披露的具体实施方案进行多种改变，并且仍然能获得相同或相似的结果。
实施例1材料和方法本实施例提供了有关用于获得本文所披露的结果的一般技术，试剂和测定法的说明。一般性实验化合物是从Sigma Chemical Co(St.Louis，Mo)购买的。pET 43.1a载体来自Novagen(Madison，WI)，限制酶来自Invitrogen(Carlsbad，Ca)。寡核苷酸得自Sigma Genosys(The Woodlands，Tx)。Val-1744抗体得自Cell Signaling Technology(Beverly，Ma)购买的。PHA/PNU化合物是从Pharmacia compoundcollection(New Jersey，USA)获得的。
克隆Notch底物将包含小鼠notch-1蛋白的氨基酸N1703-D1860的Notch底物(DNA序列登记号Z11886)以EcoRI/HindIII插入片段形式克隆到pET 43.1a载体中，与编码NusA的核酸读框一致。编码所述NusA/Notch融合蛋白的表达构建体具有SEQ ID NOSEQ ID NO1的序列。该构建体包含通过PCR制备的C-末端标记和8His标记，以便在Notch的氨基酸1860包含延长部分(DYKDDDDKHHHHHHHH，SEQ ID NO15)。将所述DNA转化入BL21(DE3)感受态大肠杆菌(Stratagene)，并且用DNA Concert微量制备试剂盒(Gibco/BRL)筛选克隆中正确插入片段的存在。发现克隆Notch-F6包括SEQ ID NO 1的正确DNA序列。
Notch/NusA融合蛋白的表达和纯化。将用克隆Notch-F6转化的大肠杆菌接种到LB/Amp中，并且在37℃下在振荡培养箱中生长过夜。次日，将35ml的过夜培养物用于接种2升的LB/Amp。让所述大肠杆菌在37℃下在振荡培养箱中生长到A600达到0.4，然后用1mM IPTG诱导3小时，并且离心。将来自2升培养物的沉淀以5ml/g沉淀物的用量重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl中，并且用弗氏压碎器处理3次，以便得到粗制提取物。用2M Tris将所述提取物的pH调整到8.0，并且以11,000g的速度离心45分钟。将上清液加样到4ml用50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，和蛋白酶抑制剂平衡的4ml镍IMAC层析柱上，并用相同的缓冲液洗涤柱，然后用含有50mM咪唑的缓冲液洗涤。用含有300mM咪唑的缓冲液洗脱NusA-Notch融合蛋白，并且收集0.8ml的级份，通过A280和SDS-PAGE进行分析。合并含有NusA-Notch的级份，并且透析到50mM Pipes，pH 7.0，100mM NaCl中。
通过Western印迹确定Notch的切割。将NusA-Notch融合体(1.7μM)与70μg/ml溶解化的γ-分泌酶一起在37℃下，以总体积为50μl在50mM Pipes，pH 7.0，0.25％CHAPSO中培养过夜。以不同的浓度添加DAPT(PHA-568638)。通过添加12.5μl的5×Laemmli缓冲液(Laemmli 1970)终止该反应，并且将30μl的混合物在15％SDS-PAGE上电泳。用半干燥印迹装置(Millipore)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并且用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA封闭2小时。将Val-1744抗体以1∶1000的稀释度添加到封闭溶液中，并且温育1小时。用PBS/0.5％Tween-20洗涤所述膜3次，然后用抗兔I gG-HRP温育(以1∶5000的比例稀释在PBS/0.5％Tween-20中的4％BSA中)。再将所述膜洗涤3次，并且用ECL制剂(Amersham，Piscataway，NewJersey)显影。
体外Notch切割ELISA。还采用ELISA技术评估Notch切割。在建立反应之前，用50μl以1∶200的比例稀释在0.1M NaHCO3，pH 8.2中的Val-1744抗体对96孔平板的(Costar)一半面积上所需数量的孔进行包被。在4℃下温育平板过夜。按以下方式建立所述Notch切割反应。将NusA-Notch(0.9μM)与溶解在50mM Pipes，pH 7.0，0.25％CHAPSO中的70μg/ml溶解化γ-分泌酶在37℃下一起温育过夜，总体积为25μl。次日，用PBS/0.05％Tween-20洗涤用Val-1744抗体包被的平板3次，并且用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA封闭1小时。用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA将所述切割反应混合物稀释14倍，并且将50μl的样品一式三份铺平板，并且在室温下培养3-4小时。用PBS/0.05％Tween-20洗涤平板3次，并且添加50μl以1∶60000的稀释比例存在于4％BSA/PBS/0.5％Tween-20中的抗-FLAG-HRP抗体(Sigma，St.Louis，Mo)。将该抗体培养45分钟，并且用PBS/0.5％Tween-20洗涤所述平板3次。将TMB制剂(Kirkegaard & Perry)以1∶1的比例混合，并且将50μl添加到所述孔中。用1小时时间显色，并且添加50μl 1M H3PO4，在SpectraMax Plus平板读数仪上在450nm波长下对所述平板进行读数。在改变Notch底物浓度时，使用了0.11-3.6μM的NusA-Notch。当所述酶浓度改变时，使用了2.1-68μg/ml溶解化γ-分泌酶。
Notch切割的抑制。在添加所述酶之前将抑制剂(1μl)以存在于50％DMSO中的25倍的浓缩液形式添加到所述切割反应物中。将空白和无抑制剂对照调整到包括相同的最终DMSO浓度。用GraFit 4.0程序中的4-参数逻辑模型计算抑制剂的IC50′s。
实施例2结果和讨论为了生产可溶性Notch底物，本发明人在大肠杆菌中制备了多种构建体(图3a)。其中包括caspase前导序列，泛素，N-末端tau，和Nus标记的使用。只有用Nus融合体观察到了可溶性表达(Wilkinson等，Biol Technology 9443-448，1991)。图3b表示用于该构建体的克隆细节。为了便于纯化和测定的进行，通过工程方法将His和FLAG标记添加到Notch的C-末端。
当所述Nus-标记的Notch融合蛋白在大肠杆菌中表达时，在SDS-PAGE上观察到了相当于90kDa条带的所述融合蛋白的高水平表达(图4，泳道1)，这是所述融合蛋白的预期大小。在对总的裂解液进行离心时，所述融合蛋白保留在可溶性级份中(图4，泳道2)。利用镍作为固定化金属离子，通过IMAC从可溶性级份中纯化含有Notch的融合蛋白。图4(泳道5-9)表示用300mM咪唑从IMAC柱上洗脱的各种级份。合并这些级份，透析，然后用作γ-分泌酶切割的底物的来源。
在所述Notch蛋白上进行特异性切割的技术基于的是Val-1744抗体的特异性(Cell Signaling Technology)。它对切割的Notch是特异的，并且不会与未切割的Notch蛋白发生交叉反应。如图5所示(泳道3)，用对Val-1744特异的抗体在Western印迹上检测切割的Notch蛋白。如泳道1所示，没有观察到与未切割的Notch融合蛋白的交叉反应性。另外，Notch蛋白中的这种特异性切割被DAPT(DAPT是γ-分泌酶的众所周知的强抑制剂)以剂量依赖性方式抑制(Dovey等，J.Neurochem.76173-181，2001)(泳道4-8，图5)。
为了确定在Notch蛋白上是否存在其他切割，还通过Western印迹，使用所述C-末端Hag抗体监测了所述切割反应。在以上三条免疫反应条带中，只有一种切割产物可以被DAPT抑制。总之，以上结果表明了γ-分泌酶-介导的体外切割似乎导致了在1743/1744位点处的特异性切割，与基于细胞的研究相吻合，所述研究证实了由Notch产生了NICD(Kopan等，Proc.Natl.Acad.Sci.931683-1688，1996；Schroeter等，Nature，393382-386，1998)。
以上结果表明，Notch融合蛋白容易受到γ-分泌酶-介导的特异性切割，这种切割可以通过高度特异性的Val-1744单克隆抗体在Western印迹上检测到。由于Western印迹不是定量的，故难于评估用于Notch抑制的化合物和比较对AβELISA的抑制效力。
图6表示用于开发Notch切割的定量ELISA的策略，以便用基于CT-100的ELISA比较化合物的抑制效力。它是基于采用高度特异性的抗-Val 1744和抗Flag抗体的夹心ELISA的，以便在存在γ-分泌酶的条件下捕获来自所述Notch融合蛋白的NICD片段的N-和C-末端。该测定方法是按照在实施例1中标题为“体外Notch切割ELISA”的部分所披露的方法进行的。基本上，在这种夹心ELISA中，用Val-1744抗体对所述微量滴定板进行包被。同时，进行所述NusA-Notch切割反应，其中，将NusA-Notch与γ-分泌酶一起温育。用缓冲液洗涤用Val-1744抗体包被的平板，并且用BSA封闭。然后将所述切割反应混合物添加到微量滴定平板中，并且在室温下温育适当的时间。洗涤平板，并且添加抗-FLAG-HRP抗体(Sigma，St.Louis，Mo)，并且再次温育适当的时间。添加HRP的生色底物TMB制剂(Kirkegaard & Perry)，并且一旦产生了颜色，即在SpectraMax Plus平板读数仪上在450nm波长下读数。图7表示通过ELISA检测的NusA-Notch融合蛋白的切割。在所述ELISA中观察到了5倍的信噪比。
通过ELISA，在特定实验条件下，进一步表征了溶解化γ-分泌酶对Notch切割的酶促活性。图8A中显示了底物依赖性产物形成。所述反应遵循Michaelis-Menten动力学，并且在特定条件下溶解化γ-分泌酶活性对Notch融合蛋白底物的水解的表观Km为大约0.7μM。所观察到的Notch切割活性还与含有γ-分泌酶活性的溶解化膜制剂的蛋白质浓度成线性关系(图8B)。
通过利用在文献中报道的这种酶的特异性抑制剂进行抑制研究，进一步证实了ELISA中γ-分泌酶-介导的Notch切割。
业已报道了被称为DAPT的γ-分泌酶的有效抑制剂(Dovey等，J.Neurochem.76173-181，2001)。正如在图9中所示出的，DAPT(PHA-568638)能以剂量依赖性方式抑制Notch切割，IC50＝2.4nM。另一方面，业已报道了葑胺磺酰胺(PHA-512088)(Rishton等，J.Med.Chez.432297-2299，2000)能够在CT-100体外测定中在低的μM范围内抑制γ-分泌酶活性。如图9所示，PHA-512088抑制了γ-分泌酶-介导的Notch切割，在特定条件下，在ELISA中IC50为0.7μM。正如所证实的，在所述测定中，抑制剂(PHA-568638；PHA-512088)在低的nM至低的μM范围内作用非常良好。总之，以上结果证实了由Notch融合蛋白底物产生NICD片段的体外酶促活性是由于γ-分泌酶造成的。
最近，业已报道了平行监测APP和Notch切割的基于细胞的测定方法(Karlstrom等，J.Biol.Chem.2776763-6766，2002)。不过，本发明首次证实了监测γ-分泌酶的特异性Notch切割(G1743-V1744)的体外定量ELISA。本发明首次证实了来自HeLa细胞的γ-分泌酶活性能在1743-1744接合处特异性地切割所述Notch蛋白。
在本说明书公开基础上，无须进行过多的实验就可以制备并且实施本文所披露并且要求保护的所有组合物和/或方法。尽管业已通过优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了说明，本领域技术人员可以理解的是，在不超出本发明概念，构思和范围的前提下可以对所述组合物和/或方法进行改变，并且可以对本文所披露方法的步骤或步骤的顺序加以改变。更具体地讲，应当理解的是，在化学和生理学上相关的某些药剂可以取代本文所披露的药剂，同时可以获得相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这样的类似取代和修饰都被视为属于由所附权利要求书确定的本发明的构思、范围和概念之内。
在本文所引用的参考文献以补充本文所披露方法的例示性方法或其他细节的程度都被专门收入本文作为参考。
序列表<110>Sharma et al.
<120>分泌酶的NOTCH型底物及其使用方法和用途<130>28341/01130<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2190<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码notch和nus的合成融合蛋白的DNA<400>1atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa 120caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt 180cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca 240cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt 300acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa 360gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc 420gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc 480gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt 540ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc 600aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg 660attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc 720aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag 780gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt 960aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc1020gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc1080aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg1140ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag1200ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc1260caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta1320gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc1380gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca1440ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgacg aagcgactag tggttctggt1500catcaccatc accatcactc cgcgggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag1560cacatggact cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg1620attgatgacg acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattcaatat tccttacaag1680attgaggccg tgaagagtga gccggtggag cctccgctgc cctcgcagct gcacctcatg1740tacgtggcag cggccgcctt cgtgctcctg ttctttgtgg gctgtggggt gctgctgtcc1800
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<223>notch和nus的合成融合蛋白序列<400>2Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Va1 Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys1 5 10 15Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala20 25 30Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln35 40 45Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val50 55 60Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala65 70 75 80Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln85 90 95Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln100 105 110Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp115 120 125Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys130 135 140Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala145 150 155 160Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly165 170 175Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly180 185 190Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu195 200 205Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys210 215 220Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr
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<223>野生型notch DNA序列<400>3aatattcctt acaagattga ggccgtgaag agtgagccgg tggagcctcc gctgccctcg 60cagctgcacc tcatgtacgt ggcagcggcc gccttcgtgc tcctgttctt tgtgggctgt120ggggtgctgc tgtcccgcaa gcgccggcgg cagcatggcc agctctggtt ccctgagggt180ttcaaagtgt cagaggccag caagaagaag cggagagagc ccctcggcga ggactcagtc240ggcctcaagc ccctgaagaa tgcctcagat ggtgctctga tggacgacaa tcagaacgag300tggggagacg aagacctgga gaccaagaag ttccggtttg aggagccagt agttctccct360gacctgagtg atcagactga ccacagacag tggacccagc agcacctgga cgctgctgac420ctgcgcatgt ctgccatggc cccaacaccg cctcaggggg aggtggatgc tgacgattat480aaagacgatg acgataaaca ccatcaccat caccatcacc attga525<210>4<211>174<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>野生型notch蛋白序列<400>4
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Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys995 10001005Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln His Val Val101010151020Asn Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu Leu Gly Gly Thr Cys Gln102510301035Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr104010451050Gly Pro Asn Cys Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp Ser Ser Pro105510601065Cys Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr Gln Tyr Arg107010751080Cys Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys Asp Val Pro108510901095Ser Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Arg Gln Gly Val Asp Val110011051110Ala Arg Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Ala Gly Asn111511201125Thr His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys113011351140Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys Gln Asn Gly114511501155Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys Lys Cys Val116011651170Ala Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asp Glu Cys117511801185Leu Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Asp Leu Pro119011951200Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His120512101215Cys Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys Asn Pro Pro Val Asp Pro Val122012251230Ser Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln123512401245Val Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu125012551260Arg Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp126512701275Ala Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His128012851290Cys Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val
129513001305Ile Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Thr Cys131013151320Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Lys Cys Pro132513301335Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys134013451350Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro135513601365Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr Gly Pro Glu137013751380Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly Asn Pro Cys138513901395Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser Pro Phe Tyr140014051410Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile141514201425Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro143014351440Pro Leu Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp144514501455Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys146014651470Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp147514801485Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp149014951500Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp150515101515Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr152015251530Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln153515401545Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala155015551560Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Val Val156515701575Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe158015851590Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys159516001605
Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg161016151620Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu Gly162516301635Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys Ala Ser Leu164016451650Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Leu Asp165516601665Pro Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn167016751680Arg Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr168516901695Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu170017051710Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu171517201725Pro Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala173017351740Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser174517501755Arg Lys Arg Arg Xaa Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly176017651770Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Xaa Leu177517801785Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp179017951800Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp180518101815Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro182018251830Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr Gln Gln His183518401845Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro185018551860Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg186518701875Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala Ser Cys Ser Gly188018851890Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu Asp Ala Pro189519001905Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser Leu His Asn
191019151920Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg192519301935Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala194019451950Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala195519601965Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg197019751980Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr198519901995Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu Glu200020052010Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu201520202025Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp203020352040Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln204520502055Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly206020652070Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg207520802085Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Ile Ala Gln209020952100Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn210521102115Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr212021252130Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly213521402145Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg Lys Pro Ser215021552160Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu Lys216521702175Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys Leu Leu Asp218021852190Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His219522002205Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro221022152220
Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met222522302235Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys224022452250Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu225522602265Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr227022752280Ser Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr228522902295Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser230023052310Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg231523202325Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala Pro Ser Leu233023352340Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser234523502355Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu Pro Ser Thr Arg236023652370Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln Val Gln Pro237523802385Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala Asn Ile239023952400Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro240524102415His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser242024252430Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val24352440<210>7<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>7deleted<210>8<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>8deleted
<210>9<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>9deleted<210>10<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>APP跨膜结构域周围的氨基酸序列<400>10Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile1 5 10 15Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys20 25 30<210>11<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>E-cathedrin跨膜结构域周围的序列<400>11Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg Arg20 25 30<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Notch-1跨膜结构域周围的序列<400>12Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu1 5 10 15Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg20 25 30<210>13<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Notch-1跨膜结构域周围的序列<400>13Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser Glu Pro Val Glu Pro1 5 10 15Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30
Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg35 40 45Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser50 55 60Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val65 70 75 80Gly Leu Lys pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp85 90 95Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg100 105 110Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Ser Asp Gln Thr Asp His115 120 125Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser130 135 140Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp145 150 155<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端flag序列<400>14Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>15<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Flag/8his标记<400>15Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His His His1 5 10 15<210>16<211>1665<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码NusA的核酸<400>16atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa120caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt180cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca240cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt300acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa360
gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc 420gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc 480gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt 540ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc 600aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg 660attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc 720aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag 780gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt 960aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc1020gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc1080aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg1140ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag1200ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc1260caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta1320gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc1380gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca1440ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgccg aagcgactag tggttctggt1500catcaccatc accatcactc cgcgggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag1560cacatggact cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg1620attgatgacg acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattc1665<210>17<211>555<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>编码NusA的蛋白质序列<400>17Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys1 5 10 15Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala20 25 30Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln35 40 45Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val50 55 60Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala65 70 75 80Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln85 90 95Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln100 105 110
Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp115 120 125Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys130 135 140Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala145 150 155 160Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly165 170 175Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly180 185 190Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu195 200 205Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys210 215 220Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr225 230 235 240Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly245 250 255Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp260 265 270Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met275 280 285Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr290 295 300Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg305 310 315 320Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu325 330 335Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala340 345 350His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp355 360 365Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu370 375 380Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu385 390 395 400Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr405 410 415Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp420 425 430Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu
435 440 445Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile450 455 460Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala465 470 475 480Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala Thr485 490 495Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Lys Glu Thr500 505 510Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Pro Pro Thr515 520 525Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Gly Ser Gly Thr Ile Asp Asp Asp530 535 540Asp Lys Ser Pro Gly Ala Arg Gly Ser Glu Phe545 550 55权利要求
1.一种可溶性融合蛋白，其中包含与NusA蛋白序列的C-末端相融合的重组Notch蛋白。
2.如权利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重组Notch蛋白包含Notch的S3切割位点。
3.如权利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重组Notch蛋白是脊椎动物Notch蛋白。
4.如权利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重组Notch蛋白是无脊椎动物Notch蛋白。
5.如权利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重组Notch蛋白来自具有SEQ ID NO5所示序列的小鼠Notch蛋白。
6.如权利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重组Notch蛋白包含小鼠Notch蛋白的氨基酸1703-1860。
7.如权利要求1-6中任意一项的可溶性融合蛋白，其中还包含C-末端His-标记。
8.如权利要求1-6中任意一项的可溶性融合蛋白，其中还包含C-末端Flag-标记。
9.一种多核苷酸，其中包含编码权利要求1-8中任意一项的融合蛋白的核苷酸序列。
10.编码权利要求1的融合蛋白的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包含如SEQ ID NO1所示的序列。
11.一种分析γ-分泌酶所介导的Notch蛋白的ε切割(1743/1744)的体外方法，其中包括a.使包含哺乳动物γ-分泌酶复合物或其生物学活性片段的第一组合物与包含如权利要求1-8中任意一项的融合蛋白的第二组合物相接触；和b.测定所述融合蛋白的切割。
12.一种筛选γ-分泌酶所介导的Notch蛋白的ε切割(1743/1744)的调节剂的体外方法，其中包括以下步骤(a)在有和没有推测的调节剂化合物存在的情况下，使包含哺乳动物γ-分泌酶复合物或其生物学活性片段的第一组合物与包含如权利要求1-8中任意一项的融合蛋白的第二组合物相接触；和(b)在有和没有推测的调节剂化合物存在的情况下测定所述融合蛋白的切割；和(c)鉴定能调节γ-分泌酶介导的所述融合蛋白的切割的调节剂；其中，推测的调节剂化合物在步骤(b)中引起了γ-分泌酶切割的不同。
13.一种包含γ-分泌酶底物的用于进行γ-分泌酶测定的试剂盒，所述底物包含如权利要求1-8中任意一项的融合蛋白。
14.一种融合蛋白，其中包含与Notch多肽融合的NusA多肽，该多肽与SEQ ID NO17所示NusA序列有90-95％序列相同性，其中，所述Notch多肽包含Notch的跨膜结构域，并且，其中所述融合蛋白在水溶液中是可溶的。
15.一种用于筛选淀粉样前体蛋白(APP)的γ-分泌酶加工的选择性抑制剂的方法，包括a)提供能抑制γ-分泌酶介导的对包含APPγ分泌酶位点之多肽的切割的测试化合物；和b)在有和没有所述测试化合物存在的情况下测定权利要求1的融合蛋白的γ分泌酶切割；其中，与所述融合蛋白的切割相比能优先抑制所述多肽的γ分泌酶切割的测试化合物是APP的γ分泌酶加工的选择性抑制剂。
全文摘要
本发明涉及γ－分泌酶的新型可溶性底物。更具体地讲，本发明提供了具有Notch片段的可溶性融合多肽，其中含有与NusA蛋白融合的γ－分泌酶依赖性切割位点(γ和ε)。还披露了制备和使用所述融合蛋白的方法和组合物。
文档编号C07K14/195GK1717485SQ200380104233
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月17日 优先权日2002年11月26日
发明者K·B·兰克, S·K·沙玛 申请人:法玛西雅厄普约翰有限责任公司