一种亲和lb膜定向固定化辣根过氧化物酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，属于蛋白质固定化领 域。
【背景技术】
[0002] 辣根过氧化物酶化orseradish Peroxidase，HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶 容易制备，所W最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和栋色 的铁化嘟结合而成的糖蛋白，糖含量18% dHRP由多个同功酶组成，分子量为40，000，等电点 为PH3~9,酶催化的最适PH因供氨体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58% W 下饱和度硫酸锭溶液。辣根过氧化物酶通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床 检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类 化LISA)试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要 影响。
[0003] 将具有生物活性的辣根过氧化物酶定向固定化，可W充分利用辣根过氧化物酶的 催化活性，在生物传感器等领域有着重要的应用价值。但是，传统的酶固定化方法所获得的 固定化酶结构，酶是在任意位点和载体相连接，运种方法主要不足之处在于常常导致固定 化酶的活性出现大幅度下降。二径苯丙氨酸(多己)在过氧化氨存在下可W被辣根过氧化物 酶催化氧化，利用运一特性，可W使在无过氧化氨的条件下使二径苯丙氨酸与辣根过氧化 物酶形成稳定的亲和作用。辣根过氧化物酶定向共固定化，是利用酶底物分子与酶的亲和 作用，将辣根过氧化物酶W有序的方向在载体上固定化，天然构象基本保持不变，运有助于 高效实现辣根过氧化物酶的生物功能，具有更重要的研究与应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的课题在于提供了一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，目的是 克服传统酶固定化方法的种种不足，实现酶的定向固定化的条件优化。
[0005] 为了解决上述课题，本发明采用如下技术：
[0006] -种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶的方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0007] 步骤一，步骤一，先将载体浸入缓冲溶液的液面下，注入改性底物分子，在溶液表 面形成单分子层膜，再将辣根过氧化物酶化RP)溶液注入液面下，使改性底物分子与辣根过 氧化物酶形成亲和作用；
[000引步骤二，选择合适表面压，控制挡板W恒定速度压至该表面压并维持恒定，垂直向 上提拉载体出液面，将酶转移至载体上。
[0009] 作为优选，步骤一中所述的载体材料为氧化石墨締、石墨締、碳纳米管、石墨、聚苯 乙締、聚丙締、聚乙締、或聚丙締腊中的至少一种。
[0010] 作为优选，步骤一中所述的改性底物分子为二径苯丙氨酸十八烷基醋、二径苯丙 氨酸十六烷基醋、或二径苯丙氨酸二十烷基醋的至少一种。
[0011] 作为优选，步骤二中所述的液面表面压为25-35mN/m，挡板恒定速度为5-15mm/ min,垂直向上提拉载体速度为l-5mm/min。
[0012] 作为优选，步骤一中所述的缓冲溶液为憐酸、憐酸二氨钟、憐酸氨二钢、巧樣酸、巧 樣酸钢、巧樣酸钟、碳酸、醋酸、己比妥酸、或Ξ径甲基氨基甲烧中的至少一种所配制的水溶 液，浓度范围5-50mM/L。
[OOU] 有益效果：
[0014] 本发明同现有技术相比具有W下优点及效果:采用将辣根过氧化物酶通过亲和LB 膜定向固定化，可W高效保留固定化后辣根过氧化物酶的生物活性。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，W下实施例是对本发明的解释而 本发明并不局限于W下实施例。
[0016] 实施例1
[0017] 步骤一，先将聚苯乙締浸入憐酸溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸十八烷基 醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根过氧化物 酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[001引步骤二，液面表面压为30mN/m，控制挡板WlOmm/min恒定速度压至该表面压并维 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[0019] 对比例
[0020] 皿P的吸附法固定:取HRP0.45mg/mL皿P 5mL，将聚苯乙締浸入液面下，静置吸附 化后取出，用二次去离子水清洗3遍，除去未吸附疏松蛋白质，自然干燥后用于活性测试。 [0021 ] HRP活性测试反应如下：
[0022]
[0023] 过氧化氨存在下，HRP催化邻苯二胺(0PD)得栋黄色产物二氨基酪嗦，该物质在波 长450nm处有最大紫外吸收峰。通过检查该吸光度值来反应酶的催化活性。本实验将一定量 自由HRP或固定化HRP加入10血5mM0PD，再加入0.2血30 %出化开始反应，溫度控制30°C，反应 15min，用可见紫外分光光度计测450nm处吸光度。空白样品为不加自由酶或固定化酶。
[0024] HRP催化邻苯二胺反应，如下表：
[0025]
[00%] 实施例2
[0027]步骤一，先将氧化石墨締浸入憐酸二氨钟溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸 十八烷基醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根 过氧化物酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[002引步骤二，液面表面压为28mN/m，控制挡板W8mm/min恒定速度压至该表面压并维持 恒定，W2mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[0029] 实施例3
[0030] 步骤一，先将碳纳米管浸入憐酸氨二钢溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸二 十烷基醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根过 氧化物酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[0031] 步骤二，液面表面压为35mN/m，控制挡板Wl2mm/min恒定速度压至该表面压并维 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[0032] 实施例4
[0033] 步骤一，先将聚丙締浸入己比妥酸溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸十六烧 基醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根过氧化 物酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[0034] 步骤二，液面表面压为32mN/m，控制挡板Wllmm/min恒定速度压至该表面压并维 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[0035] 实施例5
[0036] 步骤一，先将聚丙締腊浸入巧樣酸钟溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸十八 烷基醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根过氧 化物酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[0037] 步骤二，液面表面压为32mN/m，控制挡板Wllmm/min恒定速度压至该表面压并维 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[003引实施例6
[0039] 步骤一，先将聚苯乙締浸入巧樣酸钢溶液液面下，注入50化ImM二径苯丙氨酸十六 烷基醋，在溶液表面形成单分子层膜，待溶剂自然挥发lOmin后，再将50化Img/mL辣根过氧 化物酶化RP)溶液注入液面下，静置化，使底物分子与酶形成亲和作用；
[0040] 步骤二，液面表面压为30mN/m，控制挡板WlOmm/min恒定速度压至该表面压并维 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉转载体，将酶移至聚苯乙締。
[0041] 上述实施例2-6所得到的结果也具有良好的效果。
【主权项】
1. 一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一，先将载体浸入缓冲溶液的液面下，注入改性底物分子，在溶液表面形成单分子 层膜，再将辣根过氧化物酶溶液注入液面下，使改性底物分子与辣根过氧化物酶形成亲和 作用； 步骤二，选择合适表面压，控制挡板以恒定速度压至该表面压并维持恒定，垂直向上提 拉载体出液面，将辣根过氧化物酶转移至载体上。2. 根据权利要求1中所述的一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，其特征在 于，步骤一中所述的载体材料为氧化石墨稀、石墨稀、碳纳米管、石墨、聚苯乙稀、聚丙稀、聚 乙烯、或聚丙烯腈中的至少一种。3. 根据权利要求1中所述的一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，其特征在 于，步骤一中所述的改性底物分子为二羟苯丙氨酸十八烷基酯、二羟苯丙氨酸十六烷基酯、 或二羟苯丙氨酸二十烷基酯中的至少一种。4. 根据权利要求1中所述的一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，其特征在 于，步骤二中所述的液面表面压为25-35mN/m，挡板恒定速度为5-15mm/min，垂直向上提拉 载体速度为l-5mm/min。5. 根据权利要求1中所述的一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶方法，其特征在 于，步骤一中所述的缓冲溶液为磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸 钾、碳酸、醋酸、巴比妥酸、或三羟甲基氨基甲烷中的至少一种所配制的水溶液，浓度范围5-50mM/L〇
【专利摘要】本发明公开了一种亲和LB膜定向固定化辣根过氧化物酶的方法。本发明首先对辣根过氧化物酶(HRP)的底物分子进行改性，接入疏水性分子链，使其具有两亲性。再利用辣根过氧化物酶的底物分子与酶分子活性中心间的生物亲和作用，通过亲和LB膜法将酶分子转移固定化在载体上。本发明所具有的优点主要在于：定向亲和作用有利于保持酶的自然构象，固定化酶比普通吸附法固定化酶活性显著提高，极大地提高了催化效率，为进一步构建高效率、低成本的生物催化体系提供了一种可行的方法。
【IPC分类】C12N11/14, C12N11/08
【公开号】CN105543209
【申请号】CN201610011617
【发明人】叶鹏, 韩祝平, 许永娟
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月8日