一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种伊维菌素的检测试剂盒，特别是一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒。包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。使用上述试剂盒，采用加样、洗涤、加酶标二抗、洗涤、加发光液、检测、结果判定的步骤，所制备试剂盒具有高的灵敏度，其灵敏度可达0.01-5ng/ml，而且具有宽的线性动力学范围，分析方法简便快速结果稳定、误差小，分析结果灵敏稳定可靠，安全性好及使用期长。
【专利说明】一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种伊维菌素的检测试剂盒，具体的说是一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]20世纪90年代以后，绝大多数测定食品中伊维菌素类药物残留的理化检测法主要依靠液相色谱技术进行分离，其次是色/质谱联用技术，气相色谱法、高效薄层色谱法等检测法，因其各自特有的性能，在抗生素残留检测方面稍有应用。色谱法检测牛乳中的药物残留要经过样品处理(包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤)、残留药物的分离和残留药物的检测。理化检测法利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，能进行定性、定量分析和药物鉴定，可作为乳中抗生素检测的确证方法。该法检测敏感性较高，但仪器及检测费用高、检测程序复杂、较耗时间等，这些不利因素使该法仅限于实验室乳样测定。
[0003]免疫学分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，目前药物残留免疫分析技术主要分三大类:相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。1973年荷兰van weeman、sch μ rrs及瑞典Engvall、Perlmann分别提出酶联免疫吸附法，30多年来国内外学者对免疫学方法检测食品中抗生素进行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原构建技术难度大、免疫特异性强、检测成本高，目前IDEXX实验室公司、Cha瑚Sciences等公司在免分析法方面的研究较为成熟，国内该技术仍处于研究发展中。当前主要是用酶联免疫吸附试验、放射性免疫发光法、荧光免疫法、化学发光法等，对比现有的几种标记免疫技术灵敏度的可知酶免与发光相比较，其酶免灵敏度较低。
【发明内容】
[0004]为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、无毒无污染且所用仪器简单经济的检测伊维菌素的化学发光酶联免疫分析测定试剂盒，同时提供了其制备方法，以及检测样品中伊维菌素抗生素类的方法。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为:伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括:伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。
[0006]所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔X 12条的96孔化学发光酶标板。
[0007]所述包被抗原浓度为5 μ g/ml。
[0008]所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000。
[0009]所述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒:所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDa飞.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到。
[0010]一种使用上述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒检测残余伊维菌素的方法，包括以下步骤:
1)加样:向酶标板中加入50μ L/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50 μ L/孔，室温(25°C )恒温孵育2.5h ；
2)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入200μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3)加酶标二抗:每孔加入酶标二抗工作液100μ L，室温恒温孵育1.5h ；
4)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入280μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5)加发光液:每孔加入发光液100μ L ;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；
7)结果判定:以所测得的标准品发光值，除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0011]有益效果:本发明所制备的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有作为化学发光免疫分析最关键灵的优越的高灵敏度，其灵敏度可达0.01-5ng/ml，而且具有宽的线性动力学范围，光信号持续时间长，其产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天，分析方法简便快速结果稳定、误差小，样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素(光源稳定性、光散射、光波选择器等)给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠，安全性好及使用期长。
【具体实施方式】
[0012]一种伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括:伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。
[0013]所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔X 12条的96孔化学发光酶标板。
[0014]所述包被抗原浓度为5 μ g/ml。
[0015]所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000。
[0016]所述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒:所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDa飞.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到。
[0017]利用上述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒检测残余伊维菌素的方法，包括以下步骤:
1)加样:向酶标板中加入50μ L/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50 μ L/孔，室温(25°C )恒温孵育2.5h ；
2)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入200μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3)加酶标二抗:每孔加入酶标二抗工作液100μ L，室温恒温孵育1.5h ；
4)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入280μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5)加发光液:每孔加入发光液100μ L ;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；
7)结果判定:以所测得的标准品发光值，除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0018]1.制备所需试剂 制备浓缩洗涤液:
含有体积分数0.05%吐温20mmol/L，pH 8.0的磷酸缓冲液。
[0019]制备校准液:
所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体的工作浓度优选1:15000。所述伊维菌素系列标准溶液浓度分别为:0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
[0020]所述包被抗原浓度优选5 μ g/mL，所述包被抗原制备具体由3_氨基_2_唑酮(AOZ)按照戊二醛法与活化的分子量范围是6.7KDeT6.8KDa的卵清蛋(cOVA)偶联完成。[0021 ] 本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.lng/ml，线性检测范围在0.l_20ng/ml，板内变异系数在10%以内，水样品中回收率在78%_81%之间。
[0022]制备发光底物液
发光液是0.0lM鲁米诺与pH=8.8 0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液和体积比浓度为3/10000 H2O2的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
[0023]1.2伊维菌素化学发光酶联免疫检测法的建立 ①抗体与包被抗原浓度的优选:
酶标板纵向用IOOmL/孔的，浓度梯度按80.0 μ g/ml>40.0 μ g/ml、20.0 μ g/ml、
9.0 μ g/ml、5.0 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml 和 0.625 μ g/ml 的包被抗原溶液包被，4°C放置过夜，用280 μ L/孔的洗漆液洗板三次,再用250 μ L/孔封闭液封闭，室温放置2.5小时，洗涤三次；横向加入100 μ L/孔，稀释梯度按1:10(Tl:500的抗体溶液，室温放置2小时,洗涤三次；加入100 μ L/孔的1: 15000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体，室温放置I小时，洗涤三次；加入IOOyL/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
[0024]②抗体灵敏度的测定
经上述方阵法优选， 申请人:选择包被抗原浓度为5 μ g/mL，抗体浓度为1:15000，进行抗体的灵敏度的测定:
(1)包被过程:用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，将伊维菌素的包被抗原配成5 μ g/ml的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100yL，4°C反应12h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，200 μ L/孔，每次5分钟，拍干；
(2)封闭过程:用250μ L/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板,室温孵育2.5小时，洗漆;(3)竞争过程:加稀释抗体(1:1000)100 μ L/孔与不同浓度的药物50 μ L/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗涤；
(4)酶标过程:于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体(1:15000) 100 μ L/孔，室温孵育1.5小时，洗涤；
(5)发光过程:于各反应孔中加入100μ L/孔即时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测；
(6)计算过程:检测结果以抑制率计算，抑制率=BX100/Β0，Β是加入竞争者的发光值，BO是没有竞争者的发光值，计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
[0025]2.3本发明的检测伊维菌素的化学发光酶联免疫试剂盒的组装
(I)检测伊维菌素的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
a、包被有包被抗原(Α0Ζ与卵清蛋白的偶联物)的固相载体(不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板);
b、伊维菌素抗体工作液(体积比浓度为1:1000)；
C、伊维菌素标准溶液6瓶,浓度分别为0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL 和 lOng/mL ；
d、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液(工作浓度为1:15000)；
e、浓缩磷酸盐缓冲溶 液:80g的 NaCl, 2.0g 的 KH2PO4, 229.0g 的 Na2HPO4.12H20，2.0g的KCl溶于1000mL蒸馏水中；
f、浓缩洗涤液:上述浓缩磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0.05mol/L的吐温20(Tween20)；
g、发光液:0.01M鲁米诺十0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液(pH8.8)+体积比浓度为3/10000的H2O2。
[0026]2.4酶标板的制备
将包被抗原溶于包被液中，配成0.1ng/mL的溶液，酶标板的每孔加入10 μ L，4°C孵育12h，倾去包被液，每孔加入200 μ L洗涤液洗涤3次，拍干，然后加入250 μ L/孔的封闭液，37°C孵育2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封在4°C下保存。
[0027]2.5本发明的伊维菌素的酶联免疫试剂盒的测定程序 试剂的准备
1)样品稀释液:将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用；
2)洗涤液:将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用；
3)发光液:0.01M鲁米诺+0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(PH8.8)3/10000 (体积比)。
[0028]4.2样品前处理
(1)水样将水样经过0.45 μ m的滤膜抽滤，然后加入体积比浓度为0.05%的吐温-20。得到待测样品；
(2)牛奶将牛奶样品在4°C、10000转/分钟离心10分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶按1:10洗涤液稀释，得到待测样品；
(3)尿样将尿样品在4°C，10000转/分钟离心10分钟，去掉沉淀，将剩余的尿液用洗涤液按1: 10稀释，得到待测样品； (4)动物组织取样品与4 mL0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波处理20 min，然后10000转/分钟离心20 min，取上清液用10 M NaOH调pH至8.0±0.5，旋涡振荡5 min,然后10000转/分钟离心15 min ;取上清液加5 mL异丁醇振荡2 min,混合物室温下静止15 min,然后3000转/分钟离心10 min,分出有机相,水相再用异丁醇(每次10 mL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在起，水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成1: 10的溶液，得到待测样品。
[0029]4.3检测步骤
1)加样:向酶标板中加入50μ L/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50 μ L/孔，室温(25°C )恒温孵育2.5h ；
2)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入280μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3)加酶标二抗:每孔加入酶标二抗工作液100μ L，室温恒温孵育1.5h ；
4)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入200μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5)加发光液:每孔加入发光液100μ L ;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。
[0030]4.4结果判断
以所测得的标准品发光值，除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
[0031]抑制率=标准品发光值(或样品)X 100/0标准品发光值。
【权利要求】
1.一种伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括:伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。
2.如权利要求1所述的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔X 12条的96孔化学发光酶标板。
3.如权利要求1所述的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述包被抗原浓度为5 μ g/ml。
4.如权利要求1所述的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000。
5.如权利要求1所述的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDeT6.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到。
6.一种利用权利要求1所述的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒检测残余伊维菌素的方法,,使用伊维菌素系列标准溶液浓度分别为:0.1ng/mL (O标准)、0.5ng/mL、.0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL,其特征在于,包括以下步骤: . 1)加样:向酶标板中加入50μ L/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50 μ L/孔，室温(25°C )恒温孵育2.5h ； . 2)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入200μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次； .3)加酶标二抗:每孔加入酶标二抗工作液100μ L，室温恒温孵育1.5h; 4)洗涤:倾出孔中液体，向酶标板中加入280μ L/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次； . 5)加发光液:每孔加入发光液100μ L ; . 6)检测:用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度； . 7)结果判定:以所测得的伊维菌素系列标准浓度溶液对应的孔的发光值，除以第一个标准(O标准)的发光值再乘以100，得到抑制率Β/Β0%，以抑制率为纵坐标，各伊维菌素系列标准浓度溶液浓度的对数为横坐标作标准曲线，根据样品溶液所对应的孔的发光值和所得标准曲线，计算得到样品溶液的浓度。
【文档编号】G01N21/76GK103675287SQ201310673734
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】王善普, 郑鸣, 郭宏伟, 靳婉霞, 吴庭才 申请人:洛阳莱普生信息科技有限公司