一种用于莫能霉素快速检测的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药残留分析和免疫分析检测技术领域，具体涉及一种莫能霉素的单克隆抗体制备及其酶联免疫检测试剂盒。本发明的单克隆抗体是由申请人建立的杂交瘤细胞株C2F3C2所分泌。本发明公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法。与现有技术相比，本发明拓宽了现有技术的检测对象，本发明的试剂盒和方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，能同时检测动物源食品，尤其是肉类产品中莫能霉素的残留量。
【背景技术】
[0002]莫能菌素属于抗生素类药物，用于鸡球虫病和肉牛促生长，具有良好的抗球虫活性。对阴性菌无作用；但对葡萄球菌、杆菌、梭菌、链球菌、霉菌(青霉菌、念珠菌)有一定的抑制作用。莫能霉素主要作用于球虫早期。正常球虫孢子体和裂殖体细胞内钾离子浓度高、钠离子浓度低(细胞外相反)，细胞通过储备能量进行离子渗透压平衡(外泵钠，内泵钾)，以稳定菌体内环境。莫能菌素以干扰球虫细胞内钠钾离子的正常交换，使大量的钠离子进入细胞内，造成钠离子在胞内浓度高，渗透压上升，更多的水分进入球虫内。为了排除细胞内多余的钠，球虫必须动用能量将多余的钠外泵排出，最终造成有限的能量被用完；而后钠钾离子交换中断停止，细胞膨胀、变形、破裂、崩解。莫能菌素可以影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵，提高丙酸与乙酸的产出比例，降低挥发性脂肪酸，减少甲烷生成，提高蛋白质利用效率。因此能够显著提高反刍动物的饲料利用率和促进生长的作用。但是该类药物在动物源性食品的残留会引起人体的不良反应，它们的长期大量使用会使病菌产生耐药性，还有潜在的致癌作用。因此它们在动物源性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。由于以上危害美国、欧盟和我国都严格规定了该类药物的使用以及最大残留限量。
[0003]目前，HPLC和LC/MS/MS是测定动物源性食品中残留的主要手段，由于这类方法存在分析时间长、检测所需样品量大、及繁琐的前处理步骤等不足，不适宜于测定大量样品。与此相比，免疫学方法具有低成本、快速、无需复杂样品前处理等特点，可作为一种高效的检测方法。
【发明内容】
[0004](一)本发明要解决的技术问题
本发明目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带、灵敏度高的用于动物源食品中莫能霉素残留快速检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、灵敏、适合大量筛选的定量检测方法。
[0005](二)本发明的技术方案
为解决所述问题，本发明综合采用蛋白质偶联和生物化学制备等技术制备了单克隆抗体。将莫能霉素与载体蛋白偶联制备成人工免疫抗原和包被抗原；用此人工免疫抗原免疫动物制备抗莫能霉素的单克隆抗体；将莫能霉素包被抗原包被吸附于固相载体上；将检测用的试剂配置成可直接使用的试剂。使用时，将莫能霉素标准品或待测样品加入莫能霉素抗体工作液，待测样品中残留的莫能霉素与固相载体上包被的莫能霉素抗原竞争莫能霉素单克隆抗体，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中莫能霉素残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中莫能霉素的含量。
[0006]本酶联免疫检测试剂盒由下列成分组成:
(1)包被了莫能霉素抗原的酶标板
(2)莫能霉素抗体
(3)莫能霉素标准品
(4)标准品稀释液
(5)酶标二抗
(6)底物显色液
(7)洗涤缓冲液
(8)终止液
其中包被了莫能霉素抗原的酶标板有24孔、或48孔、或96孔。
[0007]其中，莫能霉素抗原及莫能霉素单克隆抗体的制备方法为:
(O莫能霉素抗原的合成
将载体蛋白(BSA)的羧基用乙二胺活化，再通过水溶性碳化二亚胺法(EDC)将莫能霉素与活化载体蛋白(BSA)的氨基相偶联制备莫能霉素抗原。具体步骤见下图。本发明合成的免疫原采用免疫电泳测定其纯度为98.6%。
[0008](2)莫能霉素单克隆抗体制备
动物免疫程序:采用莫能霉素抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50 μ g，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有莫能霉素抗原特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。
[0009]细胞融合与克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合,制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌莫能霉素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0010]单克隆抗体的制备与纯化:采用体内诱生法，将BALB/C小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用，-20°C保存。
[0011]其中，本发明的试剂盒所用试剂的配制方法如下:
(1)莫能霉素标准溶液配制:准确称取标准莫能霉素Img，精确到0.00001 g，配成Iμ g/mL标准品溶液母液；使用时，用标准品稀释液稀释成所需的浓度(10-1000 ng/mL)；
(2)标准品稀释液为0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9%NaCl 的缓冲液；
(3)包被缓冲液为0.1 mol/L 碳酸缓冲液，ρΗ7.8，含 0.05% NaN3,0.9% NaCl ；
(4)封闭液为0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，ρΗ8.0，含0.5% BSA, 0.9% NaCl, 0.04% NaN3 ；
(5)洗涤缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20 ；
(6)莫能霉素单克隆抗体工作液:将抗体用pH7.4,0.02 mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸盐缓冲液稀释成蛋白浓度为0.1-1 ug/L使用； (7)酶标二抗工作液:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；
(8)底物显色液A液:过氧化氢或过氧化脲；
(9)底物显色液B液:邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)；
(10)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液:pH8.1，含有MgCl2 0.01% 100 mmol/LTris-HCl ；
(11)终止液:2mol/L硫酸。
[0012]其中，酶标板的包被方法为:包被抗原以合适浓度与包被缓冲液混合，添加于酶标板中且置于室温下反应14 h。用洗涤缓冲液洗涤3次后，用封闭缓冲液在37°C进行封闭(约I h)，去除孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0013]本发明试剂盒的检测原理和检测方法:
将莫能霉素抗原偶联物包被吸附于固相载体上，加入莫能霉素标准品或待测样品，并加入莫能霉素抗体工作液，待测样品中残留的莫能霉素与固相载体上包被的莫能霉素抗原竞争莫能霉素单克隆抗体，洗涤去除游离的抗原抗体复合物，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中莫能霉素残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中莫能霉素的含量。
[0014](三)本发明的有益效果
本发明所制备的莫能霉素的酶联免疫试剂盒，具有简便、快速、灵敏、准确等特点，可用于定性或定量检测动物组织等样品中莫能霉素的残留量；其最低检测限为0.01 ng/g，检测时间仅需3小时。本方法平均回收率为97-121%,批内误差小于8%,批间误差小于13%。
[0015]本发明的试剂盒采用高特异性的莫能霉素单克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少操作步骤，节省时间。
【具体实施方式】
[0016]实施例1试剂盒组分的制备 1、抗原的合成
a、取载体牛血清白蛋白(BSA)10 g溶于35 mL pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入1g乙二胺进行活化；
b、取莫能霉素Ig溶于10 ml 0.5 M的氢氧化钠溶液中；
C、取I g碳化二亚胺溶于5 ml纯水,然后加到莫能霉素溶液中室温搅拌反应3小时；
d、将活化的载体蛋白BSA滴加到莫能霉素溶液中4°C搅拌反应过夜；
e、将反应完所获得的人工抗原对0.1 M的PBS缓冲液透析5天，每天更换缓冲液4次；将获得的纯化的人工抗原经超滤浓缩或冻干保存。
[0017]2、莫能霉素类药物单克隆抗体制备
a、动物免疫程序:采用莫能霉素人工抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫