一种检测氟苯尼考胺残留的方法及应用与流程

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种检测氟苯尼考胺残留的方法及应用。
背景技术：
：目前，针对动物源食品检测氟苯尼考胺大多采用的方法为：酶联免疫法或者高效液相色谱法，这些方法检出限为1mg/kg或者更高，有的采用液质法进行分析，前处理用C18柱或者液液分配净化，杂质净化不彻底且只针对单一基质：鸡蛋，基体覆盖不全面，不能适应实际应用需求。技术实现要素：针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种针对多种基质、操作简便、灵敏度高、重复性好、检测限低的检测氟苯尼考胺残留的方法。为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种检测氟苯尼考胺残留的方法，利用乙腈乙酸乙酯提取样品中氟苯尼考胺残留物，之后使用高效液相色谱质谱联用仪检测氟苯尼考胺残留；所述乙腈乙酸乙酯为乙腈和乙酸乙酯按1∶1的体积比混合而成。在上述方案的基础上，所述检测氟苯尼考胺残留的方法步骤如下：1)提取纯化称量2.00g样品，加入15mL乙腈乙酸乙酯，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液，重复操作两次合并上清液于鸡心瓶中，在合并后的上清液中加入3mL5％乙酸溶液，旋蒸至无回流；将剩余液体倒入离心管，再用4mL5％乙酸溶液清洗鸡心瓶后倒入离心管中；加入10mL正己烷，涡旋振荡1min，4000r/min离心5min，除去正己烷层，提取液备用；2)净化柱净化用2mL甲醇和2mL水平衡活化PCX净化柱后，上样，用3mL5％甲酸甲醇溶液淋洗2次，抽干；然后用6mL20％氨水甲醇溶液洗脱，接收洗脱液，旋蒸至干；加入2mL甲醇水溶液涡旋定容；过0.22μm滤膜，待测；3)利用高效液相色谱质谱联用仪检测氟苯尼考胺残留色谱参数为：色谱柱：XDB-C181.8μm，4.6mm*50mm；柱温：40度；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；流动相为：A：0.1％甲酸水，B：甲醇；质谱参数为：离子源：ESI源+；GasTemp：300℃；GasFlow：10L/min；Nebulizer：45psi；SheathGasTem：375℃：SheathGasflow：11L/min。在上述方案的基础上，所述检测氟苯尼考胺残留方法的应用于检测动物源性食品中氟苯尼考胺的残留。在上述方案的基础上，所述动物源性食品为肌肉、肝脏、牛奶和蛋类。本发明的有益效果：本发明所要检测的氟苯尼考胺属于极性化合物，乙腈极性也很大，根据相似相溶的原理，用纯乙腈提取的样品极性杂质多，从而干扰氟苯尼考胺的净化，而乙酸乙酯属于偏弱极性的物质，利用两者混合作为提取溶剂，既能提高目标化合物的提取效率，又能减少极性杂质的干扰；旋蒸时加入5％乙酸水溶液可使氟苯尼考胺成离子状态，溶解在水溶液中，为下一步过PCX净化柱做准备；正己烷为非极性溶剂，提取中加入正己烷可将基质中的非极性杂质进一步提取出来；PCX净化柱具有苯磺酸型官能团，可吸附离子化的氟苯尼考胺，用5％甲酸甲醇溶液淋洗，可进一步除去基质中的极性杂质；氨水甲醇溶液具有较高的离子强度，洗脱时可将氟苯尼考胺从PCX净化柱上替换下来。本方法采用UPLC-MSMS进行仪器分析，基体覆盖肌肉、肝脏、牛奶、蛋类等动物源食品，检出限低为1μg/kg；本发明中使用乙腈乙酸乙酯进行提取，正己烷除杂，相比于其他方法，操作简便；使用PCX固相萃取柱，选择性强，回收率高，有效去除杂质；使用高效液相色谱质谱联用仪，并采用多反应监测(MRM)采集方法，相比于单一的高效液相色谱，具有灵敏度高、重复性好、检测限低的优势，并且大大减少杂质干扰，这对仪器及色谱柱保护性大，使仪器的维护及重现性得到很大的提高。附图说明图1氟苯尼考胺的高效液相质谱图，其中纵坐标为响应，横坐标为m/z；图2氟苯尼考胺保留时间的测定，其中纵坐标为响应，横坐标为保留时间；图3氟苯尼考胺的定量限测定，其中纵坐标为响应，横坐标为保留时间，3个图上、中、下分别代表3个子离子的S/N。图4氟苯尼考胺的标准曲线，其中纵坐标为峰面积响应，横坐标为氟苯尼考胺浓度。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1.标准溶液的配制1.1储备液的配制准确称量10.00mg氟苯尼考胺，溶解到甲醇中，定容到10mL，作为1000μg/mL的储备液(实际浓度应乘以氟苯尼考胺的纯度)，置于4℃冷藏保存；1.2标准中间液的配制准确量取1mL氟苯尼考胺，溶解到甲醇中，定容到10mL，作为100μg/mL的储备液，置于4℃冷藏保存；1.3标准工作曲线的配制用标准中间液配制成1、2、5、10、20ng/mL的标液(用甲醇+水(v/v＝1:1)定容)，作为工作曲线用的标准溶液。2.样品处理2.1提取纯化精确称量2.00g±0.01g样品于50mL离心管，加入15mL乙腈乙酸乙酯(v/v＝1:1)，超声20min，4000r/min离心5min，取上清液于100mL鸡心瓶中，重复操作两次合并上清液，加入3mL5％乙酸溶液，旋蒸至无回流。将剩余液体倒入新50mL离心管，再用4mL5％乙酸溶液清洗该鸡心瓶，并倒入新50mL离心管中。加入10mL正己烷，涡旋振荡1min，4000r/min离心5min，除去正己烷层，提取液备用。2.2净化柱净化用2mL甲醇和2mL水平衡活化PCX净化柱后，将上述提取液加入PCX净化柱中净化，并用3mL5％甲酸甲醇溶液淋洗2次，抽干。然后用6mL20％氨水甲醇溶液洗脱，接收洗脱液，旋蒸至干。加入2mL甲醇水溶液(v/v＝1:1)涡旋定容。过0.22μm滤膜，待测。3.高效液相色谱质谱联用仪检测氟苯尼考胺残留量使用的高效液相色谱质谱联用仪为AgilentLC-MSMS1290/6460，色谱参数为：色谱柱：XDB-C181.8μm，4.6mm*50mm；柱温：40度；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；流动相为：A：0.1％甲酸水，B：甲醇；流动相的梯度如表1所示：表1流动相梯度Time(min)B％0.00201.00203.00904.00904.01205.5020质谱参数为：离子源：ESI源+；GasTemp：300℃；GasFlow：10L/min；Nebulizer：45psi；SheathGasTem：375℃：SheathGasflow：11L/min。4.结果及分析4.1专属性如图1所示，1ppm氟苯尼考胺上机，通过质谱优化各得到3个离子对，其中纵坐标为响应，横坐标为m/z。质谱结果如表2所示：表2质谱结果50ppb氟苯尼考胺通过C18色谱柱分离，确定保留时间。如图2所示，保留时间约为1.5min，且色谱的峰形较佳，无干扰峰出现。4.2定量限在基质中添加相当于样品含有1.0μg/kg的标准品，经前处理上机检测，计算其信噪比(S/N)＞10，如图3所示。测得该方法的定量限：1.0μg/kg。4.3标准曲线精密吸取氟苯尼考胺标准品，用50％甲醇水溶液稀释成系列浓度为2，5，10，20，50ng/mL标准溶液，分别进样测定，以峰面积响应为纵坐标，氟苯尼考胺浓度为横坐标，绘制标准曲线如图4所示：得到氟苯尼考胺的回归方程为Y＝2970.653983*X-2691.191137，R2＝0.9996，由相关系数可见，在2ng/mL～50ng/mL标准曲线线性范围内，UPLC-MSMS法测定线性关系良好，此标准曲线可以用于准确定量。4.4空白样品添加回收空白样品添加回收如表3所示：表3空白样品添加回收添加回收选取市场上脂肪含量高的猪肉、低的牛肉、鸡蛋、超市购买的鸭肝、牛奶做质控实验，回收率均在70％-95％之间，说明本方法稳定性良好。5.结论通过运用UPLC-LCMSMS法对动物源基体中的氟苯尼考胺进行测定，确定用乙腈：乙酸乙酯＝1:1的体积比进行提取，PCX小柱进行净化，可使氟苯尼考胺色谱峰达到基线分离，峰形良好，检测限低，灵敏度高，回收稳定，本发明为动物源基质中的氟苯尼考胺残留量的测定建立了一种可靠地分析方法。当前第1页1 2 3