专利名称：氟苯尼考及其代谢物检测装置的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测领域，具体而言，本发明涉及一种检测动物源性食品中氟苯尼考及其代谢物残留量的检测装置。
技术背景氟苯尼考是一类专门用于动物保健市场的新型抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及甲砜霉素耐药菌的广谱抗生素。由于其抗菌作用明显，且价格低廉，被广泛应用于各类家禽、家畜、水产养殖业及蜂产品的各种传染性疾病的治疗。氟苯尼考能通过胎盘屏障，有胚胎毒性，氟苯尼考的代谢物氟苯尼考胺，在食品中的残留易导致潜在再生障碍性贫血。氟苯尼考(Florfenicol)，又称氟甲砜霉素，其化学名称为D(+)_苏-I-对甲砜基苯基-2- 二氯乙酰氨基-5氟丙醇，是氯霉素类广谱抗菌药物中甲砜霉素的3位氟衍生物，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等作用明显。繁殖毒性试验证实，氟苯尼考能通过胎盘屏障，有胚胎毒性，使F1代雄鼠附睾重量明显减轻，F2幼子的哺乳指标降低，存活率降低，所以哺乳期、怀孕期禁用。氟苯尼考的代谢物氟苯尼考胺在食品中的残留易导致潜在再生障碍性贫血。目前对氟苯尼考的检测主要有高效液相色谱法、电位法、HPLC法、旋光法、紫外分光光度法、极普法等，而对于氟苯尼考残留检测未见有相关的单克隆抗体(McAb)试剂盒的报道，单克隆抗体易于生产、高度均质和易于标准化，且特异性高、灵敏度高，使低残留量也能检出，具有无与伦比的优点，非常适宜对药物残留的筛选分析。因此氟苯尼考的单克隆抗体、组装ELISA试剂盒的研制，开发出具有我国自主知识产权的试剂盒，建立快速检测氟苯尼考残留的检测法和试剂盒是十分必要的，这一研究将有助于提高我国对动物源性食品安全性的检测技术水平，使我国在兽药领域的检测水平与国际同步，从而能更好地保障人们的健康，推进农副产品的绿色化进程。
实用新型内容本发明的目的在于提供一种成本低、快速、操作简便、灵敏度高的氟苯尼考及其代谢物检测试剂盒。本发明的技术方案是包括一个双层试剂盒盒体，盒体内上层装有包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶标板、一张盖板膜、一个自封袋、一份说明书、一份质检报告、下层有固定泡沫模具形成的放置试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，其特征在于酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了氟苯尼考-卵清蛋白抗原，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空；所述试剂瓶包括有6瓶2mL从(Γ7. 2ppb梯度浓度的氟苯尼考标准品、I瓶2mL lmg/L的高浓度氟苯尼考标准品、7mL氟苯尼考抗体工作液、30mL样品稀释液、12mL酶标II抗工作液、40mL浓缩洗涤液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL终止液；试剂瓶的大小、瓶盖的颜色各不相同，固定在具有下凹瓶位的泡沫塑料模具中盖板膜、自封袋、说明书和质检报告一同装在一个自封袋中置于酶标板的下方。试剂盒可以一次连续测定多份样品，也可将板孔拆开多次检测。本试剂盒检测的原理是样品中的氟苯尼考和与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标II抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中氟苯尼考的含量。如果样品中的游离氟苯尼考量少，显色深，反之，则显色浅。本试剂盒具有很高的灵敏度和很高的特异性,可检测的样本包括猪肉、鸡肉、牛肉、虾肉、鱼肉(去皮)，最低检测限为20ppb，样本的回收率为90%±30%。与氟苯尼考胺的交叉反应率为54%，甲砜霉素约2. 9%，氯霉素、琥珀氯霉素〈O. 01%。本试剂盒检测简便，所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、离心机等简单的实验室仪器，所需检测成本低。可满足食品生产企业的自我质量控制、也可作为食品安全监督和检测机构的常规筛查手段，也能用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。
图I是本实用新型的上层示意图图2是本实用新型下层示意图；图3是本实用新型打开上层后的俯视图
具体实施方式
参见附图1-3，展现了本实施例所述的一种可快速检测氟苯尼考试剂盒的结构，所述盒体I上层装有所述的96孔酶标板2，所述盖板膜、自封袋、说明书、质检报告共同装在一个自封袋中放置于所述酶标板2下面；所述试剂盒下层内具有固定泡沫模具3形成的下凹瓶位，共有14个下凹瓶位2mL lmg/L的高浓度氟苯尼考标准品瓶位4，7mL氟苯尼考抗体工作液瓶位5，40mL浓缩洗涤液瓶位6，12mL酶标II抗工作液瓶位7，7mL底物A液瓶位8，7mL底物B液瓶位9，7mL终止液瓶位10，2mL O μ g/L浓度氟苯尼考标准品11，2mL O. 05 μ g/L浓度氟苯尼考标准品12，2mL O. 15 μ g/L浓度氟苯尼考标准品13，2mL O. 45 μ g/L浓度氟苯尼考标准品14，2mL I. 8 μ g/L浓度氟苯尼考标准品15，2mL 7. 2 μ g/L浓度氟苯尼考标准品16，30mL样品稀释液瓶位17。所述下凹瓶位用于放置装有相应溶液的试剂瓶(14瓶)。本实用新型的实施例一、工作液的准备洗涤工作液用去离子水按1:20 (I份浓缩液+19份去离子水)稀释。样品稀释液用去离子水按1:10 (I份浓缩样品稀释液+9份去离子水)稀释。组织提取液A (含5%甲醇和O. 5%三氯乙酸的O. 02M PB)O. 2M Na2HP04 :称取 35. 8g Na2HP04 · 12H20，溶于 500mL 水。O. 2M NaH2P04 :称取 15. 6g NaH2P04 · 2H20，溶于 500mL 水。O. 2M PB :取 19mL O. 2M NaH2P04，81mL O. 2M Na2HP04，充分混匀。O. 02M PB :取 50mL0. 2M PB,加 450mL 水充分混匀。去掉25mL O. 02M PB,依次加入25mL甲醇，2. 5g三氯乙酸，充分混匀，既得组织提取液A。组织提取液B :在500mL组织提取液A中加入22. 5g NaCl，充分混匀。二、样品前处理[0026]准确称取2±0. Ig均质后的组织样品于50mL离心管中；猪肉、鸡肉、牛肉样品力口入IOmL组织提取液A，虾肉、鱼肉样品加入IOmL组织提取液B (切勿将不同样品的提取液加错)；室温(25±2°C)下，高速润动Imin ; 4000g以上,离心IOmin ;取100 μ L于新的离心管中，加入I. 5mL样品稀释液，充分涡动30s ;取50 μ L进行检测。三、操作步骤I.将所需的酶标板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做平行实验，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8°C环境中；2.将50 μ L各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；3.在每个板孔中加入50 μ L抗体工作液；·4.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温(25±2°C)，避光反应30min ；5.揭开盖板膜；6.倒掉板孔中液体，每孔加入260 μ L洗涤工作液，浸泡15 30s ；7.再重复上一步骤3次；8.倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；9.立即在各板孔中加入100 μ L酶标II抗工作液；10.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温(25±2°C)，避光反应30min ；11.重复步骤 9. 5 9. 8 ;12.立即在每孔中加入100 μ LA、B混合液；(底物A液、底物B液按体积I : I混合，必须充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂)；13.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2°C)，避光反应
15 20min ；14.揭开盖板膜，在各板孔中加入50 μ L终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；15.用酶标仪在双波长450nm、630nm下检测吸光度,在5min内读取。四、计算各标准品(或样品)的平均吸光度值，除以零标(浓度为Oppb的标准品)吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比将各标准品所得值输入半对数系统中，对应各标准品浓度可以拟合标
*—.....Xi00=吸光度比值紫 零标的吸光度
准曲线，请参见质检报告。将样品吸光度的百分比代入标准曲线，可得出样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得样品中实际药物含量。按照本说明书的前处理方法，各样品稀释系数如下猪肉、鸡肉、牛肉、虾肉、鱼肉(去皮).......................................80五、测定注意事项I.试剂盒使用前，仔细阅读说明书。2.请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。[0052]3.试剂盒使用前，将试剂盒内各组份置于实验台上，待其恢复至室温(25±2°C)(提示约2h)，方可使用。4.应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。5.各试剂在使用前请摇匀。6.检测时,应尽量减少酶标板上方空气流动。7.若底物A液、底物B液在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已变质。8.终止液中含有2M硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。9.不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。 10.混合试剂时应避免出现气泡。11.使用后请立即将试剂放回2 8°C保存。六、试剂盒参数本试剂盒灵敏度O. 05ppb，标准曲线范围为O. 05ppb 7. 2ppb ；BO吸光度最佳值应大于O. 8 ；试剂盒吸光度板内误差小于5%，板间误差小于10% ；用本说明书提供的样品提取方法回收率范围90% ±30% ；样品最低检测限猪肉、鸡肉、牛肉、虾肉、鱼肉(去皮)....................................
约 20ppb注ppb=ng/mL或 ng/g七、交叉反应率氟苯尼考酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的，结果如下氟苯尼考...........................100. 0%氟苯尼考胺........................约54%甲砜霉素...........................约2. 9%氯霉素、琥珀氯霉素............〈0.01%。
权利要求1.氟苯尼考及其代谢物检测装置，其特征在于一个双层试剂盒盒体，盒体内上层装有，包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶标板、一张盖板膜、一个自封袋、一份说明书、一份质检报告；下层有固定泡沫模具形成的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，所述试剂瓶包括有6瓶2mL从(Γ7. 2ppb梯度浓度的氟苯尼考标准品、I瓶2mL lmg/L的高浓度氟苯尼考标准品、7mL氟苯尼考抗体工作液、30mL样品稀释液、12mL酶标II抗工作液、40mL浓缩洗涤液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL终止液。
2.根据权利要求I所述的氟苯尼考及其代谢物检测装置，其特征在于所述的包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的96孔酶标板酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了氟苯尼考-卵清蛋白抗原，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中氟苯尼考及其代谢物的检测装置。该检测试剂盒包括上、下两层，上层装有包被氟苯尼考-卵清蛋白抗原的酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告；下层有6瓶不同梯度浓度的氟苯尼考标准品、1瓶高浓度氟苯尼考标准品、氟苯尼考抗体工作液、样品稀释液、酶标Ⅱ抗工作液、浓缩洗涤液、底物A液、B液和终止液。采用间接竞争法，待测样品中氟苯尼考残留与酶标板上固定抗原竞争抗体，再加入酶标结合物，通过酶催化显色，利用样本吸光度值计算出样本中氟苯尼考的含量。本试剂盒具有检测简便，快速，灵敏度高，检测费用低廉等优点，可满足多种检需求。
文档编号G01N33/543GK202693588SQ20122025304
公开日2013年1月23日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者徐飞, 王世恩, 牛兰兰, 苏丽芳 申请人:北京维德维康生物技术有限公司