一种用于四溴联苯醚快速检测的酶联免疫吸附分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种2，2’，4，4’-四溴联苯醚(BDE-47)的酶联免疫检测方法，改造BDE-47分子结构，设计合成半抗原C15H9Br3O3和C11H13Br2O3N，分别与牛血清白蛋白、卵清白蛋白偶联得到免疫原和包被原。对新西兰大白兔进行7次免疫后取得特异性抗血清。ELISA法测定抗体效价为1∶400000，检出限为0.01mg/L，定量限为0.023mg/L，IC50为0.108mg/L。所建立的对BDE-47的间接竞争抑制ELISA方法，具有灵敏、快速、特异性强等优点，在对大量环境样品的进行初期筛选时很有优势，可大幅提高监测工作效率，降低监测成本，为仪器检测提供有效依据。
【专利说明】
一种用于四溴联苯醚快速检测的酶联免疫吸附分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种可用于BDE-47的快速检测的ELISA方法，属于免疫化学和残留分 析的检验技术领域，建立的间接竞争抑制ELISA检测方法可以用于研制BDE-47免疫速测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 多溴联苯謎（polybrominateddiphenyl ethers，PBDEs)，是一类含溴原子的芳香 族化合物，属于溴系阻燃剂，其化学通式为C12H^ 9)Bru ~ 1(])0,依据苯环上溴原子取代数目 和取代位置的不同，可分为10个不同组分，共有209种同系物。BDE-47全称2, 2'，4,4'-四 溴联苯醚，为多溴联苯醚中使用和环境分布最为广泛的同系物质。分子式为C12H 6Br40,分子 量为485. 79,熔点-107°C，沸点98-99°C。化学结构和化学性质稳定，亲脂疏水性极强，具有 生物积累性。
[0003] 多溴联苯醚多用于阻燃剂的生产，属于溴代阻燃剂的一种，被广泛应用于电子、电 器、纺织、家居建材等多个工业领域中。市场上现行使用的PBDEs商用阻燃剂主要可分为三 种：五溴联苯醚混合物、八溴联苯醚混合物以及十溴联苯醚，BDE-47主要应用于五溴联苯 醚，另外高溴代化合物也可脱溴成为低溴代化合物。在多溴联苯醚的生产、使用和处置过 程中都会对环境造成不同程度的污染，根据目前已有的相关研究，PBDEs会对人体产生肝脏 毒性，甲状腺激素毒性，神经毒性，生殖系统毒性等方面的危害。多溴联苯醚的严重危害问 题已经引起人们的高度重视，美国、加拿大等国已开始限制其生产和使用，因此必须建立快 速、灵敏的检测分析方法，以确保环境安全和人类健康。
[0004] BDE-47测定最常采用的是气相色谱-质谱联用法。但是这些仪器方法前处理费 事、成本高、不适合现场检测，而ELISA具有灵敏度高、选择性好等优点，避免了经典仪器测 试手段的不足，能够用于现场快速监测和大量样品的快速筛查。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于BDE-47间接竞争抑制ELISA快速检测。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] -种用于BDE-47快速检测的间接竞争抑制ELISA方法，具体步骤如下：
[0008] 1.半抗原的合成
[0009] 半抗原C15H903Br 3的合成：称取1201. 2mg(5mmol)的磷酰基乙酸三乙酯于250ml锥 形瓶，加入lOmlTHF，另加入280mg氢化钠，在冰浴器中搅动反应20min ;称取3-溴-4-氟苯 甲酸3. 24g(16mmol),再称取2,4-二溴苯酉分4g，（16mmol)溶于20ml二甲基乙酰胺中，反应 2h ;称取已制得的3-溴_4_(2,4-二溴苯氧基）苯甲酸2000mg(4. 6mmol)，与上步骤冷却过 后的混合物进行反应3-4h ;秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4_二氧六环与水 的混合液50ml (体积比1 : 1)中，将合成物质水解24h;分离纯化后得到白色晶体态半抗 原 C15H903Br3为 573mg，产率为 61 %。
[0010] 半抗原 CnH1303NBr2的合成：称取 3,5_ 二溴-2-羟基吡啶 200mg(0. 79mmol)，加 入6-溴己酸乙酯352. 53mg(l. 58mmol)以及适量无水K2C03,混合溶于2mL二甲基甲酰胺 中，100°C下反应5h ;秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4_二氧六环与水的混合 液50ml (体积比1 : 1)中，将合成物质水解24h;分离纯化后得到淡黄色晶体态的半抗原 CnH1303NBr2S 138mg，产率为 93%。
[0011] 2.全抗原的合成
[0012] 免疫原 C15H903Br3-BSA 的合成：取半抗原 C15H903Br30. 50mmol (0· 239g)置于溶于 10ml N，N-二甲基甲酰胺；取N-羟基琥拍酰亚胺0. 50mmol (0. 0584g), N，Ν' -二环己基碳 0. 55mmol0. 1035g)，溶于10ml Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌下逐滴加到溶有半抗原 的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应8h，4°C过夜；将反应产物以9000r/min离心15min， 上层清液为活性酯；将适量的牛血清白蛋白溶解于pH为9. 6的碳酸盐缓冲液配制成15mg/ mL的溶液10mL ;4°C搅拌下，取10mL活性酯缓慢地滴加入10mL的蛋白溶液中，继续搅拌 4h ;反应后的溶液用0. 9 %生理盐水透析5d ;将透析完成后，将最后透析液冷冻干燥后保存 于-20。。。
[0013] 包被原CnH1303NBr 2-0VA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步骤与免疫原合成相同。
[0014] 3.抗血清的合成
[0015] 选取体型均一，健康状况良好的两制新西兰大白兔作为免疫对象，用生理盐水稀 释适量免疫原C 15H903Br3-BSA，并将免疫原溶液与弗氏完全佐剂混合，使免疫原充分乳化。取 弗氏完全佐剂乳化后的免疫原溶液对兔子进行皮下注射，注射后轻柔免疫部位使免疫原被 充分吸收，避免皮下局部组织硬化。在第3次加强免疫后，通常将兔耳缘静脉取血部位周围 的兔毛拔净，摩擦刺激局部，使兔耳发热，静脉充血，手术刀割小口后取约2~3mL血液，静 置离心后，取上清液用（测试效价的具体方法）对现有抗血清进行效价检测。待效价达到 预期后，在颈动脉进行大量采血。
[0016] 表1人工抗原生物免疫实施方案
[0017]
[0018] 4.间接竞争抑制ELISA检测BDE-47方法的建立
[0019] 以每孔100μ L的5μ g/mL的包被原稀释液包被96孔酶标板，4°C静置过夜；将 包被液倒净，向每孔加入350 μ L洗涤液，浸泡lmin，吸去洗涤液，此步骤重复3次；以每孔 200 μ L封闭液进行封闭，37°C振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤3次；加入50 μ LBDE-47 标准系列浓度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20,50,100,200,500， 1000ug/L，）和50 μ L抗血清溶液，震荡30s后，37°C振荡温育60min ;如上封闭后洗涤，加入 100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振荡温育60min ;如上封闭后洗涤，加入100 μ L底物液， 37°C避光振荡温育15min ;加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，终止反应；酶标仪在450nm波 长下测定各板孔中溶液的吸光度。
[0020] 本发明的有益效果：间接竞争抑制ELISA用于BDE-47的检测方法具有较高的灵敏 度，通过实际样品加标回收分析，间接竞争抑制ELISA方法表现出较高的稳定性和精确度， 该方法相比传统气相色谱-质谱检测（GC-MS)方法相比更简单快速。
【附图说明】
[0021] 图1半抗原C15H903Br 3合成路线
[0022] 图2半抗原成路线
[0023] 图3免疫原合成路线
[0024] 图4包被原合成路线
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可 从常规试剂公司购买得到。
[0026] 间接竞争抑制ELISA检测方法的建立与评估
[0027] 一、方法的灵敏度
[0028] 表2 K1-BSA抗血清ELISA法测定BDE-47标样数据
[0029]
[0030] 以每孔100 μ L的5 μ g/mL的包被原稀释液包被96孔酶标板，4°C静置过夜；将 包被液倒净，向每孔加入350 μ L洗涤液，浸泡lmin，吸去洗涤液，此步骤重复3次；以每孔 200 μ L封闭液进行封闭，37°C振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤3次；加入50 μ L 的 BDE-47 标准系列浓度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20,50,100,200,500， 1000ug/L，）和50 μ L抗血清溶液，震荡30s后，37°C振荡温育60min ;如上封闭后洗涤，加入 100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振荡温育60min ;如上封闭后洗涤，加入100 μ L底物液， 37°C避光振荡温育15min ;加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，终止反应；酶标仪在450nm波 长下测定各板孔中溶液的吸光度。计算可得间接竞争抑制ELISA检测BDE-47的IC 5。值为 0· 108mg/L，检出限为0· 01mg/L，定量限为0· 023mg/L，在0· 01~0· 5mg/L范围内检测结果 准确。
[0031] 二、实际样品添加回收试验
[0032] 选择水、底泥和鲈鱼肌肉三种环境样品进行添加回收分析，比较间接竞争抑制 ELISA检测和传统GC-MS检测结果。样品前处理过程如下：水样经过0. 7μπι的Watman GF/ F玻璃纤维滤纸过滤后，加入50% (体积比）的甲醇后在超声清洗器上超声lOmin，静置 30min，离心后取上层清液即可进行ELISA检测。底泥（鱼样）经过充分干燥、研磨、筛选后 与无水硫酸1 : 1.2(质量比）充分混合；加入合适比例的正己烷与二氯甲烷混合溶剂（V/ V = 2 : 1)，超声萃取30min，重复萃取两次；高纯氮气吹干萃取溶剂后用正己烷作替换溶 剂，并用浓硫酸纯化至无色；再用高纯氮气吹干后溶于lmL的甲醇中进行ELISA分析。
[0033] 表3 ELISA方法检测各加标环境样品中BDE-47
[0034]
[0035] 对水样、底泥及鲈鱼肌肉样品进行平行样品提取（η > 4)、纯化和分析，数据处 理结果见表3。水样的相对标准偏差为4. 8~11. 8%，底泥相对标准偏差结果为4. 04~ 15. 57 %，鱼样为3. 74~8. 24 %。该检测方法中各样品加标回收率处分别在66. 20~ 88. 57%，78. 32~84. 15%，75. 23~80. 20%，基本满足针对于复杂基质中微量或是痕量目 标物的回收率要求，证明该方法具有较好的准确度和稳定性，可以满足对富集后环境样品 中PBDEs的检测要求。
【主权项】
1. 一种2,2'，4,4' -四溴联苯醚（BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：选择 C15H9O3Br3S半抗原，其合成步骤为： (1) 称取1201. 2mg(5mmol)的磷酰基乙酸三乙酯于250ml锥形瓶，加入IOmlTHF,另加 入280mg氢化钠，在冰浴器中搅动反应20min ; (2) 称取3-溴-4-氟苯甲酸3. 24g(16mmol)，再称取2,4-二溴苯酉分4g，（16mmol)溶于 20ml二甲基乙酰胺中，反应2h ; (3) 称取已制得的3-溴-4-(2,4-二溴苯氧基）苯甲酸200〇11^(4.61111]1〇1)，与上步骤冷 却过后的混合物进行反应3-4h ; (4) 秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml (体 积比I : 1)中，将合成物质水解24h;分离纯化后得到白色晶体态半抗原C15H903Br 3。2. -种2,2'，4,4' -四溴联苯醚（BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：选择 C11H13O3NBr2S半抗原，其合成步骤为： ⑴称取3,5-二溴-2-羟基批陡200mg(0. 79mmol)，加入6-溴己酸乙酯 52. 53mg(l. 58mmol)以及适量无水K2CO3,混合溶于2mL二甲基甲酰胺中，KKTC下反应5h ; (2) 秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H2O加入1，4-二氧六环与水的混合液50ml (体 积比I : 1)中，将合成物质水解24h; (3) 分离纯化后得到淡黄色晶体态的半抗原CnH1303NBr2。3. -种2, 2'，4,4'-四溴联苯醚（BDE-47)的全抗原及其合成方法，其特征在于：以 C15H9O3Br3与BSA偶联，C nH1303NBr# OVA偶联得到两种抗原，其合成步骤为： (1) C15H9O3Br3-BSA 的合成：取半抗原 C15H9O3Br3 0· 50mmol (0· 239g)溶于 IOml N， N-二甲基甲酰胺；取N-羟基琥拍酰亚胺0. 50mmol (0. 0584g), N，Ν' -二环己基碳 0. 55mmol (0. 1035g)，溶于IOml Ν，N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌下逐滴加到溶有半抗原 的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应8h，4°C过夜； (2) 将反应产物以9000r/min离心15min，上层清液为活性酯； (3) 将适量的牛血清白蛋白溶解于pH为9. 6的碳酸盐缓冲液配制成15mg/mL的溶液 IOmL ;4°C搅拌下，取IOmL活性酯缓慢地滴加入IOmL的蛋白溶液中，继续搅拌4h ; (4) 反应后的溶液用0. 9%生理盐水透析5d ;将透析完成后，将最后透析液冷冻干燥后 保存于_2〇°C。 (5) C11H13O3NBr2-OVA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步骤与免疫原合成相同。4. 一种2,2'，4,4' -四溴联苯醚（BDE-47)的抗血清及其制备，其特征在于：以 C15H9O3Br3-BSA作为免疫原，新西兰大白兔作为免疫对象，进行多次免疫，免疫方法为： (1) 选取体型均一，健康状况良好的两制新西兰大白兔作为免疫对象，用生理盐水稀释 适量免疫原C15H9O 3Br3-BSA,并将免疫原溶液与弗氏完全佐剂混合，使免疫原充分乳化。 (2) 取弗氏完全佐剂乳化后的免疫原溶液对兔子进行皮下注射，注射后轻柔免疫部位 使免疫原被充分吸收，避免皮下局部组织硬化。 (3) 在第3次加强免疫后，通常将兔耳缘静脉取血部位周围的兔毛拔净，摩擦刺激局 部，使兔耳发热，静脉充血，手术刀割小口后取约2~3mL血液，静置离心后，取上清液对现 有抗血清进行效价检测。待效价达到预期后，在颈动脉进行大量采血。 表1人工抗原生物免疫实施方案5. -种间接竞争抑制ELISA检测BDE-47方法的建立，其特征在于：将权利要求1、2、3、 4中所述的BDE-47的半抗原、抗原及抗体应用于免疫分析，具体方法为： (1) 以C11H13O3NBr2-OVA作为包被原，以每孔100 μ L的5 μ g/mL的包被原稀释液包被96 孔酶标板，4°C静置过夜； (2) 将包被液倒净，向每孔加入350 μ L洗涤液，浸泡lmin，吸去洗涤液，此步骤重复3 次； (3) 以每孔200 μ L封闭液进行封闭，37°C振荡温育30min后，将封闭液倒净，如上洗涤 3次； (4) 加入 50μ LBDE-47 标准系列浓度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20， 50,100, 200, 500,1000ug/L，）和 50 μ L 抗血清溶液，震荡 30s 后，37°C振荡温育 60min ; (5) 如上封闭后洗涤，加入100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振荡温育60min ; (6) 如上封闭后洗涤，加入100 μ L底物液，37°C避光振荡温育15min ; (7) 加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，终止反应； (8) 酶标仪在450nm波长下测定各板孔中溶液的吸光度。6. -种使用权利要求5中建立的检测方法进行实际样品添加回收实验的方法，其特征 在于：选择水、底泥和鲈鱼肌肉三种环境样品进行添加回收分析，比较间接竞争抑制ELISA 检测和传统GC-MS检测的结果，具体方法如下： (1) 水样经过〇· 7 μ m的Watman GF/F玻璃纤维滤纸过滤后，加入50% (体积比）的甲 醇后在超声清洗器上超声l〇min，静置30min，离心后取上层清液，进行ELISA检测； (2) 底泥（鱼样）经过充分干燥、研磨、筛选后与无水硫酸1 : 1.2 (质量比）充分混 合；加入合适比例的正己烷与二氯甲烷混合溶剂（V/V = 2 : 1)，超声萃取30min，重复萃取 两次；高纯氮气吹干萃取溶剂后用正己烷作替换溶剂，并用浓硫酸纯化至无色；再用高纯 氮气吹干后溶于ImL的甲醇中进行ELISA检测。
【文档编号】G01N33/53GK105884609SQ201410630814
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月6日
【发明人】孙红文, 刘婧婷, 张彦峰
【申请人】南开大学