一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置的制造方法
【专利摘要】一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP?9)定量装置，属于免疫学检测技术领域。由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP?9标准品浓度梯度冻干粉一套、抗MMP9抗体或抗HNL抗体包被的96孔酶标板、酶标抗HNL抗体溶液溶液或酶标抗MMP9抗体溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP?9标准品为人源HNL/MMP?9。本发明特异性检出HNL/MMP?9，而不检出游离MMP?9、HNL及HNL同源二聚体。本试装置使用时孵育只需两步和清洗只需一步，显著缩短检测时间。因此，本发明具有特异性强和测试时间短等优点。本发明具有以HNL/MMP?9为标志物诊断疾病(如乳腺癌)的实验室研究和潜在临床应用价值。
【专利说明】
一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二 聚体定量装置
技术领域
[0001]本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于酶联免疫吸附(ELISA)技术 的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置。
【背景技术】
[0002] 人中性粒细胞脂质运载蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL)也称中性粒细 胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)，是 一脂质运载蛋白（J.Biol.Chem. 1993,268:10425-10432;Scand.J.Clin.Lab. Invest. 1994， 54: 365-376)。单体(momomer)、同源二聚体(homomer)及单体与MMP-9分子形成异源二聚体 (HNL/MMP-9)是HNL在体液中的分子存在形式，不同分子形式HNL与不同的病理过程有关。如 单体HNL可能与急性肾损伤有相对较高的相关性（Lancet 2005,365: 1231-1238; Am· J · N印hro 1 · 2004，24:307-315)，HNL/MMP-9可能与肿瘤侵袭有关。Ceci 1 ia A· Fernandez 等人研究发现HNL/MMP-9与乳腺癌存在相关性，具有作为乳腺癌诊断生物标准物的潜力 (Clin.Cancer Res.2005,11:5390-5395)〇
[0003] 单独定量HNL方法已经有很多公开报道，如国际专利W0/1995/029404A1、欧洲专利 EP 2225268和中国专利ZL200980155194、ZL201220323587、ZL201420423962、201510184818 等;定量MMP-9的方法如中国专利（申请号：201410180514.X)SPR(表面等离子共振)法检测 溶液中的MMP-9,Andrea Staack等报道了酶联免疫吸附法(ELISA)定量MMP_9(BMC Urology 2006,6:1-19)
[0004] 除R&D Systems公司有一款HNL/MMP-9定量试剂盒产品(DM9L20)外，至今没有其他 关于HNL/MMP-9的准确定量方法相关专利和文献的报道。R&D Systems HNL/MMP-9定量装置 产品说明书表明采用该装置定量HNL/MMP-9需要用时约4.5小时，可见该产品十分费时。
【发明内容】
[0005] 为了实现HNL/MMP-9分子的特异性快速定量，本发明设计并开发出基于酶联免疫 吸附（ELISA)技术的HNL/MMP-9快速定量装置。该装置具有操作简单和使用快捷等优异性 能，在HNL/MMP-9作为肿瘤等疾病生物标志物的实验室研究和未来临床应用方面具有极大 应用潜力。
[0006] 为了实现上述目标，本发明采取以下技术方案：
[0007] -种基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ 丽P-9)快速定量装置，其特征在于：由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP-9标准品浓度梯 度冻干粉一套、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或抗HNL抗体包被的96孔酶标板、酶标抗HNL 抗体或酶标抗MMP-9抗体、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP-9 标准品为人源HNL/MMP-9;所述酶标抗体所标记的酶可用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等； 所述定量装置是指经两步法可快速定量HNL/MMP-9，所述两步法快速定量HNL/MMP-9是指装 置使用过程中孵育过程只需两次，所述两次孵育过程第一次是指将酶标抗HNL抗体加入抗 MMP-9抗体包被的96孔酶标板或酶标抗MMP-9抗体加入到抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快 速加入标准品浓度梯度溶液和样品溶液后孵育20~40min，所述两次孵育过程第二次是指 第一次孵育后将抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或抗HNL抗体包被的96孔酶标板经洗液工 作液清洗后指加入酶底物溶液孵育10~20min后加入终止液。
[0008] 将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得样品稀释液工作液;将25倍洗液用去离 子水稀释25倍制成洗液工作液;所述标准品浓度梯度溶液是指将HNL/MMP-9标准品浓度梯 度冻干粉加入200yL样品稀释液工作液制成;所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释 后的体液样本，所述体液样本包括尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等。
[0009] 本发明装置具体组成、制备及使用方法如下：
[0010] 1)本发明装置组成
[0011] 表1:为本发明装置组成
[0012]
[0013]
[0014] 2)制备方法
[0015] a)抗体包被的96孔酶标板的制备
[0016] (1)抗体包被酶标板
[0017] 将抗MMP-9抗体或抗HNL抗体用25~100mmol/L Na2C03-NaHC03、pH 9.6的碳酸钠缓 冲液稀释到2~6yg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加1 OOyL抗体包被液;37 °C孵育 2h、室温孵育4h或4°C过夜；
[0018] 抗MMP-9抗体可为商品化的抗MMP-9抗体（如Abeam的ab38898或ab51203等）或通过 常规方法以MMP-9免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗MMP-9抗体，所述抗体可为 单克隆抗体或多克隆抗体。
[0019] 抗HNL抗体可为商品化的抗HNL抗体（如Abeam的ab63929、ab23477或P&M Venge Diagnostics Development公司的HNL mab 697等）或通过常规方法（Current protocols in molecular biology.New York:John Wiley，2008 11.10.1-11.10.10)以人HNL免疫动 物制备的抗体或基因工程方法制备的抗HNL抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0020] (2)封闭酶标板
[0021] 弃包被液；向96孔酶标板每孔加200~300μΙ^闭液(封闭液为含2%BSA(wt/vol) 的25~100臟〇1/1恥 20)3-似!10)3，？!19.6的碳酸钠缓冲液）；37°(：孵育211、室温孵育411或4 1€ 过夜。
[0022] (3)固定酶标板
[0023]弃封闭液；向96孔酶标板每孔加200~300yL固定液（固定液为含50%蔗糖(wt/ vol)、50%海藻糖（wt/vol)或25%鹿糖（*1:/￥〇1)和25%海藻糖（￥1:/￥〇1)的5〇1]1111〇1/1^ Na2C03-NaHC03，pH 9 · 6的碳酸钠缓冲液）；室温固定30min~2h。
[0024] (4)密封酶标板
[0025]弃固定液，室温晾干或25~30 °C真空干燥;将酶标板和袋装干燥剂装进锡箱袋然 后抽真空，4 C保存。
[0026] b)5倍样品稀释液
[0027] 为含有2 · 5%BSA(wt/vol)、0 · 5%Tween-20(vol/vol)、0 · 5%十六烷基三甲基溴化 铵(CTAB) (wt/vo 1)、2 % PEG-600 (聚乙二醇600) (vo 1 /vo 1)和0 · 1 % NaN3 (wt/vo 1)的磷酸根 摩尔浓度为50mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液；
[0028] c)标准品浓度梯度冻干粉的制备
[0029 ] 标准品浓度梯度冻干粉为不同浓度HNL/MMP-9溶液制备的冻干粉，HNL/MMP-9以文 献方法从中性粒细胞分离纯化获得（J. Biol .Chem. 1993,268: 10425-10432; Scand · J · Cl in · Lab · Invest · 1994，54:365-376)。具体是将 10ng纯化的HNL/MMP-9溶解在400 yL样品稀释液工作液中，充分混匀，HNL/MMP-9的浓度为25ng/mL;然后将上述溶液用样品稀 释液工作液进行2倍法梯度稀释获得浓度分别为12.5ng/mL、6.25ng/mL、3 . 13ng/mL、 1 · 56ng/mL、0 · 78ng/mL、0 · 39ng/mL的HNL/MMP-9标准品溶液各200yL，将以上溶液通过常规 方法进行冻干，获得标准品浓度梯度冻干粉①-⑦一套。
[0030]样品稀释液工作液是将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。
[0031] d)酶标抗体溶液的制备
[0032] 酶标抗体是指通过常规的方法(Abeam的abl02850、abl02890、abl02887等）将辣根 氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)等酶分子共价标记在抗HNL抗体或抗MMP-9抗体上。如果 步骤a)抗体包被的酶标板中的抗体是抗MMP-9抗体，那么酶标抗体中的抗体就是抗HNL抗 体;反过来如果步骤a)抗体包被的酶标板中的抗体是抗HNL抗体，那么酶标抗体中的抗体就 是抗MMP-9抗体。
[0033]酶标抗体溶液为含有1 %BSA(wt/vol)、0 · 1 %NaN3(wt/vol)和0 · 5~lyg/mL酶标抗 体的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。
[0034] e) 25 倍洗液
[0035]为含有2·5%Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩尔浓度为250mmol/L、pH 7·4的PBS缓 冲液。
[0036] f)酶底物溶液和终止液
[0037]对应酶标抗体所标记的酶采用不同的酶底物溶液和终止液。该体系是已经公开成 熟的常规方法，也有相应的商品化产品可供选择，如表2。
[0038]表2:酶标抗体的酶底物溶液和终止液体系
[0039]
[0040] 3)使用方法 [00411使用步骤如下：
[0042] (1)取出上述制备的溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板等，放 置于室温环境平衡；
[0043] (2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释 液工作液和洗液工作液；
[0044] (3)将生物样本(血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液)用样品稀释液工作液(血清和血 浆通常稀释50倍，尿液通常稀释25倍，唾液和脑脊液通常稀释5倍)稀释后制成样品溶液； [0045] (4)向每管标准品浓度梯度冻干粉中加 200yL的样品稀释液工作液，充分混匀制成 标准品浓度梯度溶液；
[0046] (5)将步骤(4)和步骤(3)制备的标准品溶液和样品溶液各1 OOyL加至U型底96孔 板；
[0047] (6)将50yL酶标抗体溶液加至抗体包被的96孔酶标板；
[0048] (7)用多道移液器取50yL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品溶液和样品溶液 移至步骤(6)制备的96孔酶标板上；
[0049] (8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，150~ 180rpm、37°C 孵育 20 ~40min;
[0050] (9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对96孔酶标板进行常规3~5次清洗；
[00511 (10)向96孔酶标板每孔中加入酶底物溶液100yL，避光条件下孵育10~20min;
[0052] (11)向96孔酶标板每孔中加入终止液100yL，轻轻混匀，30min内利用常规的分光 光度计测定450nm处的吸光值；
[0053] (12)以标准品浓度梯度溶液的浓度值为横纵标，以标准品浓度梯度溶液450nm处 的吸光值为纵坐标作标准曲线，再根据标准曲线及样品溶液450nm处的吸光值计算出样品 溶液中异源二聚体(HNL/MMP-9)的浓度。
[0054]由于采取了以上技术方案，使本发明具有以下显著有益效果：
[0055] (1)本发明根据HNL异源二聚体是由HN L单体和MMP-9组成，因此HNL/MMP-9异源二 聚体既有抗HNL抗体识别的表位也有抗MMP-9抗体识别的表位;而HNL单体和HNL同源二聚体 只有抗HNL抗体识别的表位而没有抗MMP-9抗体识别的表位，游离MMP-9只有抗MMP-9抗体识 别的表位而没有抗HNL抗体识别的表位。所以利用抗HNL抗体和抗MMP-9抗体组成的夹心 ELISA能特异性检测出HNL/MMP-9，而不检出游离的HNL或MMP-9,也不检出HNL同源二聚体 (图1)
[0056] (2)本发明利用酶对抗HNL抗体或抗MMP-9抗体直接标记得到酶标抗体，从而使本 装置只需孵育两次、清洗一次就能完成整个实验，因此本发明测试时间显著缩短，只需常规 夹心ELI SA测试时间的1 /5~1 /4。
[0057] (3)本发明可用于以HNL/MMP-9为标志物诊断疾病(如乳腺癌）的实验室研究和潜 在临床应用研究。
【附图说明】
[0058]图1为本发明一种人中性粒细胞载脂蛋白（HNL/MMP-9)异源二聚体的定量装置能 特异性快速定量HNL/MMP-9的原理图。其中24代表用于抗体包被的96孔酶标板的一个孔，26 代表用于包被96孔酶标板的抗HNL抗体、27代表用于包被96孔酶标板的抗MMP-9抗体，28代 表HNL同源二聚体（由两个相同的（30)组成）、29代表HNL/MMP-9异源二聚体（由（30)和(31) 组成）、30代表HNL单体、31代表MMP-9，32代表酶标抗MMP-9抗体、33代表酶标抗HNL抗体。图1 左图由26包被24，26能识别HNL上的表位从而能结合30、28及29，32能识别MMP-9上的表位从 而特异性结合29，因此该体系能特异性检测29(HNL/MMP-9); 32利用其上所标记的酶催化酶 底物溶液产生有色产物，进而利用分光光度计获取特定波长下产物的吸光度值。图1右图由 27包被24,27能识别MMP-9上的表位从而你们结合31和29,33能识别HNL上的表位从而特异 性识别结合在27上的29，因此该体系能特异性检测29 (HNL/MMP-9)，33利用其上所标记的酶 催化酶底物溶液产生有色产物，进而利用分光光度计获取特定波长下产物的吸光度值。 [0059]图2为本发明一种基于酶联免疫吸附技术的异源二聚体人中性粒细胞载脂蛋白 (HNL/MMP-9)快速定量装置实施例5绘制的参考标准曲线。
【具体实施方式】
[0060]下面将用实施例进一步说明本发明。需要声明的是：（1)本发明实施例是用于本发 明的进一步解释而不是对本发明的限定；（2)根据本发明专利构思所述的构造、特征及原理 所做的简单变化均包括在本专利的保护范围内；（3)本领域技术人员对所描述的具体实施 例做各种修改或补充或替代，只要不偏离本发明权利要求书所定义的范围，均属于本发明 的保护范围。
[0061]实施例1: 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ MMP-9)快速定量装置的组成 [0062]表3:为实施例1装置的组成
[0063]
[0064] 实施例2: -种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ MMP-9)快速定量装置的组成
[0065] 本实施例装置由以下部分组成(见表4)。
[0066] 表4:实施例2装置的组成
[0067]
[0068] 实施例3: -种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ MMP-9)快速定量装置的组成
[0069] 本实施例装置由以下部分组成(见表5)。
[0070] 表5:实施例3装置的组成
[0071]
[0072] 实施例4: 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ MMP-9)快速定量装置的酶标板的制备
[0073] (1)抗体包被酶标板
[0074] 将抗丽?-9抗体以1^3111的3匕38898)用50111111〇1/1恥2〇)3-恥!1〇)3印119.6的碳酸钠缓 冲液稀释到2以8/1111^制成抗体包被液；向96孔酶标板(灿11〇纟/^13〇印：8>；|^131：-13〇1:1:〇11196￥611 p lat e)每孔加100μ]^)?体包被液;4 °C过夜。
[0075] (2)封闭酶标板
[0076] 弃包被液；向96孔酶标板每孔加200μΙ^?闭液（封闭液为含2%BSA(wt/vol)的 50mmol/L Na2C〇3-NaHC〇3，pH 9.6的碳酸钠缓冲液）；37°C孵育2h。
[0077] (3)固定酶标板
[0078] 弃封闭液；向96孔酶标板每孔加30(^1^固定液（固定液为25%的蔗糖(的八〇1)和 25%的海藻糖(wt/vol)的50mmol/L Na2C03-NaHC03，pH 9 · 6的碳酸钠缓冲液;室温固定lh。 [0079] (4)密封酶标板
[0080]弃固定液，25~30 °C真空干燥;将酶标板和袋装干燥剂装进锡箱袋然后抽真空，4 °c保存。
[0081]实施例5: -种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/ MMP-9)快速定量装置的具体使用步骤
[0082]现以实施例1装置的使用为例说明本装置的具体使用步骤。
[0083] (1)取出上述制备的溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板等，放 置于室温环境平衡；
[0084] (2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释 液工作液和洗液工作液；
[0085] (3)将血清用样品稀释液工作液稀释50倍，得到样品溶液；
[0086] (4)向每管标准品浓度梯度冻干粉中加200yL样品稀释液工作液，充分混匀制成标 准品浓度梯度溶液；
[0087] (5)将步骤(4)和(3)制备的标准品浓度梯度溶液和样品溶液各1 OOyL加至U型底96 孔板；
[0088] (6)将50yL HRP-抗HNL抗体加至抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板；
[0089] (7)用多道移液器取50yL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品浓度梯度溶液和 样品溶液加至步骤(6)中的96孔酶标板上；
[0090] (8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，180rpm，37 °C 孵育 20min;
[0091 ] (9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对96孔酶标板进行3次清洗，最后一 次清洗后将96孔酶标板倒扣在吸水滤纸上10s;
[0092] (10)在清洗结束前，将TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分别通过颠倒试剂瓶混匀， 取等体积溶液A和溶液B混匀制成TMB底物工作液；
[0093] (11)加入TMB底物100yL至96孔酶标板，盖上封板膜和锡箱纸，孵育15min;
[0094] (12)加入100yL、2mol/L H2S〇4的终止液，轻轻混匀30S，30min内利用常规的分光光 度计以540nm波长为参考、读取450nm波长下的吸光值；
[0095] (13)以浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线趋势线公式 计算样品中HNL浓度。
[0096] 表6:不同浓度HNL/MMP-9标准品溶液对应的450nm波长处的吸光度值
[0097]
LUUVbj 根据表6绘制买施例5的称准凹线（图幻。田表6 P」以得出本装置足重丼源二衆体的 浓度可低至〇. 2ng/mL，结合图2可以得出本装置定量同源二聚体的线性范围为0.2ng.mL~ 12·5ng/mL〇
[0099] 本实施例装置的批内差异CV平均值为5.94% (范围0.78%~9.03%，n = 12)，批间 差异CV平均值为8.25% (范围为1.22%~14.30%，n = 3)。
[0100] 通过向已知HNL/MMP-9浓度(Co)的尿液中加入已知浓度(&)的HNL/MMP-9、MMP-9、 HNL及同源二聚体HNL，利用本实施例获得尿溶液中的HNL/MMP-9测定值浓度(C2);理论值浓 度为C3。根据公式（1)回收率1(%)=C3 + C2X100%和公式(2)回收率2(%) = (C2-CQ)+C1X 100 %计算得到以上分子在尿样中的回收率(表7)。
[0101 ] 表7: HNL/MMP-9、MMP-9、HNL及HNL同源二聚体在尿液中的回收率
[0104] 表7数据显示本装置能特异性定量尿液样本中的HNL异源二聚体，而对游离的MMP-9、单体HNL及同源二聚体HNL则不检出。由此可以得出本方法有很高的特异性和灵敏度。
[0102]
[0103]
【主权项】
1. 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装 置，其特征在于：由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉一套、抗 MMP-9抗体包被的96孔酶标板和酶标抗HNL抗体溶液或抗HNL抗体包被的96孔酶标板和酶标 抗MMP-9抗体溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP-9标准品 为人源HNL/MMP-9;所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶;所述定量装 置经两步法快速定量HNL/MMP-9,所述两步法快速定量HNL/MMP-9是指装置使用过程中孵育 过程只需两次，所述孵育过程只需两次第一次是指将酶标抗HNL抗体溶液加入抗抗体包被 的96孔酶标板或将酶标抗抗体溶液加入抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入标准品浓 度梯度溶液和样品溶液后孵育20~40min，所述两次孵育过程第二次是指加入酶底物溶液 孵育10~20min后加入终止液;所述标准品浓度梯度溶液是指HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻 干粉加入200yL样品稀释液工作液制成;所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的 体液样本，所述体液样本为尿液、血清、血浆、脑脊液或唾液;所述样品稀释液工作液是将5 倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。2. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于:抗MMP-9抗体为商品化的抗MMP-9抗体或通过常规方法 以MMP-9免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗抗体，所述抗体可为单克隆抗体或 多克隆抗体;抗HNL抗体为商品化的抗HNL抗体或通过常规方法以人HNL免疫动物制备的抗 体或基因工程方法制备的抗HNL抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。3. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于:抗体包被的96孔酶标板是由如下步骤制备得到， (1) 抗体包被酶标板 将抗MMP-9抗体或抗HNL抗体用25~100mmol/L Na2C03-NaHC03、pH 9.6的碳酸钠缓冲液 稀释到2~6yg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加100yL抗体包被液;37°C孵育2h、室 温孵育4h或4°C过夜； (2) 封闭酶标板 弃包被液；向96孔酶标板每孔加200~300yL封闭液，封闭液为含2%BSA(wt/vol)的25 ~100mmol/L Na2C03-NaHC03，pH 9.6的碳酸钠缓冲液;37°C孵育2h、室温孵育4h或4°C过夜； (3) 固定酶标板 弃封闭液；向96孔酶标板每孔加200~300yL固定液，固定液为含50%蔗糖(的八〇1)、 50%海藻糖(wt/vol)或25%鹿糖(wt/vol)和25%海藻糖(wt/vol)的50mmol/LNa2⑶3-NaHC0 3，pH 9.6的碳酸钠缓冲液;室温固定30min~2h; (4) 密封酶标板 弃固定液，室温晾干或25 °C真空干燥;将酶标板和袋装干燥剂装进锡箱袋然后抽真空， 4°C保存。4. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：5倍样品稀释液为含有2.5 %BSA(wt/vol)、0.5 % Tween-20 (vo 1/vo 1)、0 · 5 % 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) (wt/vo 1)、2 % PEG-600 (聚乙二醇 600)(vol/vol)和0.1 %NaN3(wt/vol)的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。5. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于:25倍洗液为含有2.5 % Tween-20( vol/vol)的磷酸根摩 尔浓度为250mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。6. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/丽P-9定量装置，其特征在于:标准品浓度梯度冻干粉为不同浓度HNL/MMP-9溶液制 备的冻干粉，具体是将l〇ng纯化的HNL/MMP-9溶解在400yL样品稀释液工作液中，充分混匀， 此溶液HNL/MMP-9的浓度为25ng/mL;然后将上述溶液用样品稀释液工作液进行2倍法梯度 稀释获得浓度分别为12 · 5ng/mL、6 · 25ng/mL、3 · 13ng/mL、1 · 56ng/mL、0 · 78ng/mL、0 · 39ng/mL 的HNL/MMP-9标准品溶液各200yL，将以上溶液通过常规方法进行冻干，获得标准品浓度梯 度冻干粉一套。7. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于:酶标抗体的制备是指通过常规的方法将辣根氧化物 酶HRP或碱性磷酸酶(ALP)共价标记在抗HNL抗体或抗抗体上;酶标抗体溶液为含有1 %BSA (wt/vol)、0.1 %NaN3(wt/vol)和0.5~lyg/mL酶标抗体的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、 pH7.4的PBS缓冲液。8. 如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚 体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于:其使用步骤如下， (1) 取出溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板，放置于室温环境平衡； (2) 将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工 作液和洗液工作液； (3) 将生物样品用样品稀释液工作液制成样品溶液； (4) 向每管标准品浓度梯度冻干粉中加200yL的样品稀释液工作液，充分混匀制成标准 品溶液； (5) 将步骤(4)和步骤(3)制备的标准品溶液和样品溶液各1 OOyL加至U型底96孔板； (6) 将50yL酶标抗体加至抗体包被的96孔酶标板； (7) 用多道移液器取50yL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品溶液和样品溶液移至 步骤(6)中的96孔酶标板上； (8) 用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，150~180rpm、37 °C 孵育 20 ~40min; (9) 倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对酶标板进行常规3~5次清洗； (10) 向96孔酶标板每孔中加入酶底物溶液100yL，避光条件下孵育10~20min; (11) 向96孔酶标板每孔中加入终止液100yL，轻轻混匀，30min内利用常规的分光光度 计测定450nm处的吸光值； (12) 以标准品浓度梯度溶液的浓度值为横纵标，以标准品浓度梯度溶液450nm处的吸 光值为纵坐标作标准曲线，再根据标准曲线及样品溶液450nm处的吸光值计算出样品溶液 中异源二聚体HNL/MMP-9的浓度。
【文档编号】G01N33/68GK105974127SQ201610404140
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】蔡林君, 杨津, 姜春来, 孔维
【申请人】吉林大学